Secondary, or indirect, immunofluor

Secondary, or indirect, immunofluorescence uses two antibodies; the unlabeled first (primary) antibody specifically binds the target molecule, and the secondary antibody, which carries the fluorophore, recognises the primary antibody and binds to it. Multiple secondary antibodies can bind a single primary antibody. This provides signal amplification by increasing the number of fluorophore molecules per antigen.[4] This protocol is more complex and time consuming than the primary (or direct) protocol above, but it allows more flexibility because a variety of different secondary antibodies and detection techniques can be used for a given primary antibody.[4]

This protocol is possible because an antibody consists of two parts, a variable region (which recognizes the antigen) and constant region (which makes up the structure of the antibody molecule). It is important to realize that this division is artificial and in reality the antibody molecule is four polypeptide chains: two heavy chains and two light chains. A researcher can generate several primary antibodies that recognize various antigens (have different variable regions), but all share the same constant region. All these antibodies may therefore be recognized by a single secondary antibody. This saves the cost of modifying the primary antibodies to directly carry a fluorophore.

Different primary antibodies with different constant regions are typically generated by raising the antibody in different species. For example, a researcher might create primary antibodies in a goat that recognize several antigens, and then employ dye-coupled rabbit secondary antibodies that recognize the goat antibody constant region ("rabbit anti-goat" antibodies). The researcher may then create a second set of primary antibodies in a mouse that could be recognized by a separate "donkey anti-mouse" secondary antibody. This allows re-use of the difficult-to-make dye-coupled antibodies in multiple experiments.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

แอนตี้สอง ใช้ immunofluorescence รอง หรือทาง อ้อม แอนติบอดี (หลัก) แรกเพียงเฉพาะ binds โมเลกุลเป้าหมาย และแอนติบอดีรอง ซึ่งดำเนินการ fluorophore ตระหนักถึงแอนติบอดีหลัก และ binds ไป แอนตี้รองหลายสามารถผูกเป็นแอนติบอดีหลักเดียว นี้ช่วยให้ขยายสัญญาณ โดยการเพิ่มจำนวนโมเลกุลของ fluorophore ต่อการตรวจหา[4] โพรโทคอลนี้จะซับซ้อน และใช้เวลานานกว่าหลัก (หรือโดยตรง) โพรโทคอด้านบน แต่จะช่วยให้ความยืดหยุ่นมากกว่าเนื่องจากสามารถใช้แอนตี้รองต่าง ๆ และเทคนิคการตรวจหาแอนติบอดีหลักที่กำหนด[4]โพรโทคอลนี้ได้เนื่องจากแอนติบอดีที่ประกอบด้วยสองส่วน ตัวแปรภูมิภาค (ซึ่งรู้จักการตรวจหา) และภูมิภาคคง (ซึ่งทำให้โครงสร้างของโมเลกุลแอนติบอดี) สิ่งสำคัญคือต้องตระหนักว่า ส่วนนี้เป็นประดิษฐ์ และในความเป็นจริง โมเลกุลแอนติบอดีเป็นโซ่ polypeptide ที่สี่: สองหนักโซ่และโซ่สองแสง นักวิจัยสามารถสร้างแอนตี้หลักหลายที่รู้จัก antigens ต่าง ๆ (มีตัวแปรภูมิภาค), แต่ทั้งหมดร่วมภูมิภาคคงเดียวกันได้ แอนตี้ทั้งหมดเหล่านี้อาจดังนั้นได้รับการรับรอง โดยแอนติบอดีรองที่เดียว นี้จะบันทึกต้นทุนการปรับเปลี่ยนแอนตี้หลักสืบทอดโดยตรง fluorophoreแอนตี้หลักแตกต่างกับภูมิภาคอื่นคงโดยทั่วไปสร้างขึ้น โดยเพิ่มแอนติบอดีในสายพันธุ์ต่าง ๆ ตัวอย่าง นักวิจัยอาจสร้างแอนตี้หลักในแพะที่รู้จัก antigens หลาย แล้ว จ้างย้อมควบคู่กระต่ายแอนตี้รองที่รู้จักแพะแอนติบอดีคงภูมิภาค (แอนตี้ "กระต่ายป้องกันแพะ") นักวิจัยอาจสร้างชุดที่สองของแอนตี้หลักในเมาส์ที่สามารถรับรู้ โดยแยกเป็นแอนติบอดีรอง "ลาป้องกันเมาส์" ได้ นี้ได้ใช้แอนตี้ควบคู่ย้อมยากให้ทำอีกครั้งในหลายการทดลอง

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

รอง หรืออ้อม วิธี ใช้ สอง แอนติบอดี ; unlabeled แรก ( หลัก ) แอนติบอดีที่เฉพาะกับโมเลกุลเป้าหมายและระดับแอนติบอดีซึ่งเป็น fluorophore , ตระหนักถึงแอนติบอดีประถมศึกษาและผูกมัน หลายระดับแอนติบอดีสามารถผูกเดียวระดับแอนติบอดีนี้มีการขยายสัญญาณโดยการเพิ่มจำนวนของ fluorophore โมเลกุลต่อแอนติเจน [ 4 ] โปรโตคอลนี้จะซับซ้อนมากขึ้นและเวลานานกว่าหลัก ( หรือโดยตรง ) ขั้นตอนข้างต้น แต่จะช่วยให้มีความยืดหยุ่นมากขึ้น เพราะความหลากหลายของแอนติบอดีที่แตกต่างกันสองและตรวจสอบเทคนิคสามารถใช้เพื่อให้แอนติบอดีหลัก [ 4 ]

โปรโตคอลนี้เป็นไปได้เนื่องจากแอนติบอดีที่ประกอบด้วยสองส่วน ตัวแปรเขต ( ซึ่งรับรู้แอนติเจน ) และส่วนที่คงที่ ( ซึ่งมีโครงสร้างโมเลกุลของแอนติบอดี ) มันเป็นสิ่งสำคัญที่ต้องตระหนักว่าแผนกนี้เป็นเทียมและในความเป็นจริงแอนติบอดีโพลีเปปไทด์โมเลกุลที่มีสี่สองหนักเบา โซ่ และโซ่นักวิจัยสามารถสร้างหลายระดับแอนติบอดีที่จำกับแอนติเจนต่างๆ ( มีขอบเขตตัวแปรที่แตกต่างกัน ) แต่ทั้งหมดร่วมภูมิภาคคงที่เดียวกัน แอนติบอดีเหล่านี้จึงอาจได้รับการยอมรับจากเดี่ยวระดับแอนติบอดี นี้ช่วยประหยัดค่าใช้จ่ายของการปรับเปลี่ยนแอนติบอดีหลักโดยตรงมี fluorophore .

แตกต่างหลักภูมิคุ้มกันกับภูมิภาคคงที่แตกต่างกันโดยทั่วไปที่สร้างขึ้นโดยการเพิ่มแอนติบอดีชนิดต่าง ๆ ตัวอย่างเช่น นักวิจัยอาจจะสร้างแอนติบอดีประถมศึกษาในแพะที่รู้จักหลายต่อ แล้วใช้สีคู่กระต่ายระดับแอนติบอดีแอนติบอดีที่จำแพะปลาบ ( " กระต่ายป้องกันแพะ " ) )ผู้วิจัยได้สร้างชุดสองชนิดหลักในเมาส์ที่อาจได้รับการยอมรับจากแยก " ลาป้องกันเมาส์ " ระดับแอนติบอดี นี้จะช่วยให้กลับมาใช้ ยากที่จะทำให้สีคู่แอนติบอดีในการทดลองหลาย ๆ