The RAPD process uses PCR with rand

The RAPD process uses PCR with random oligonucleotide
primers to amplify genomic DNA and analyze sequence polymorphisms.
RAPD is easy to perform, is cost-effective, does not
require prior sequence knowledge and requires only a small
amount of template genomic DNA [15]. The RAPD method has
become widely accepted as a valid taxonomic and phylogenetic tool
for a large range of organisms, including lactobacilli [14,16e18].However, RAPD reproducibility is variable and the process is sensitive
to reaction conditions, including template DNA quality,
ramping speed and the type of instrument used. Therefore, it is
more efficient to clone the RAPD markers and convert them into
sequence characterized amplified regions (SCARs). Long complementary
primers permit a more stringent annealing temperature
than that used with the RAPD analysis and typically results in the
amplification of a single locus [19].The template DNA of the
Lactobacillus strains was amplified with the OPD-3 primer (50-GTCGCCGTCA-30) by RAPD-PCR. This amplification produced a
species-specific band specific for L. pentosus (Fig. 1). This specific
fragment was then isolated and ligated into the pCR2.1-TOPO
vector for nucleotide sequencing. The cloned DNA was sequenced
(Fig. 2), entered into the GenBank database and aligned to homologs
using the BLAST analysis. These sequences showed high
congruence with the ABC transporter, an ATP-binding and
permease protein of L. pentosus, which is known to play a critical
role in multidrug resistance (MDR). From this, we deduced that
these cloned sequences likely exhibit high variation, which would
make them ideal templates for designing specific primers to
discriminate among species within the L. plantarum group. A
primer pair, SpOPD3Lpen-F1/R1, was designed from the cloned
sequences, and these primers successfully generated a single
species-specific band when used in PCR reactions with L. pentosus
DNA (Fig. 3). Annealing temperatures may influence PCR specificity,
and determining the optimal annealing temperature is a time
consuming process [20]. Lower annealing temperatures and additional
PCR amplification cycles may lead to non-specific PCR
products. Thus, either a high annealing temperature or a short
annealing time should be used. In the present study, we found that
the most appropriate annealing temperature for SpOPD3Lpen-F1/
R1was 65
C, with 20 cycles of PCR amplification. Moreover, to
confirm the species specificity of this set of primers, 34 Lactobacillus
strains were tested and demonstrated accuracies reaching 100%
(Table 1).
In conclusion, we have developed a pair of species-specific
primers based on RAPD fingerprinting. These novel speciesspecific
primers can be a rapid, cost-effective, accurate and reliableway
to distinguish the L. pentosus species from the L. plantarum
group.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

การอาร์เอพีดีใช้ PCR กับ oligonucleotide สุ่มไพรเมอร์เพื่อขยาย genomic DNA และวิเคราะห์ลำดับ polymorphismsอาร์เอพีดีเป็นง่าย มีประสิทธิภาพ ไม่ต้องรู้ลำดับก่อน และต้องมีขนาดเล็กจำนวนแม่ genomic DNA [15] มีวิธีอาร์เอพีดีเป็นที่ยอมรับกันเป็นเครื่องมือ phylogenetic และอนุกรมวิธานที่ถูกต้องสำหรับช่วงกว้างของสิ่งมีชีวิต รวม lactobacilli [14, 16e18]อย่างไรก็ตาม reproducibility อาร์เอพีดีเป็นตัวแปร และกระบวนการเป็นสำคัญปฏิกิริยาเงื่อนไข รวมทั้งคุณภาพของดีเอ็นเอต้นแบบประกาศความเร็วและชนิดของเครื่องมือที่ใช้ ดังนั้น จึงเป็นเพิ่มประสิทธิภาพในการโคลนเครื่องหมายอาร์เอพีดี และแปลงลงในลำดับลักษณะภูมิภาคเอาต์ (แผลเป็น) ยาวเพิ่มเติมไพรเมอร์ให้อุณหภูมิหลอมเข้มงวดมากขึ้นกว่าที่ใช้ กับการวิเคราะห์อาร์เอพีดี และมักจะส่งผลในการขยายของโลกัสโพลเดียว [19]ดีเอ็นเอแม่แบบของการมีขยายสายพันธุ์แลคโตบาซิลลัสกับพื้น 3 ผู้ป่วยนอก (50-GTCGCCGTCA-30) โดย PCR อาร์เอพีดี ผลิตขยายนี้เป็นวงดนตรี species-specific เฉพาะสำหรับ L. pentosus (Fig. 1) เฉพาะนี้ส่วนแยกต่างหาก แล้วควบไปเดิน pCR2.1เวกเตอร์สำหรับลำดับนิวคลีโอไทด์ ดีเอ็นเอโคลนถูกเรียงลำดับ(Fig. 2), เข้าสู่ฐานข้อมูลของ GenBank และชิด homologsใช้วิเคราะห์ระเบิด ลำดับเหล่านี้แสดงให้เห็นว่าสูงลงตัวกับ ABC ขนส่ง การ ATP รวม และโปรตีน permease ของ L. pentosus ซึ่งเป็นที่รู้จักการเล่นเป็นสำคัญบทบาทในการต้านทาน multidrug (MDR) จากนี้ เรา deduced ที่ลำดับโคลนเหล่านี้มักแสดงความผันแปรสูง ซึ่งจะทำให้แม่แบบที่เหมาะสำหรับการออกแบบไพรเมอร์เฉพาะเพื่อเหยียดระหว่างพันธุ์ภายในกลุ่ม L. plantarum Aคู่รองพื้น SpOPD3Lpen-F1/R1 ถูกออกแบบมาจากการโคลนลำดับ และไพรเมอร์เหล่านี้ประสบความสำเร็จสร้างเดียวเมื่อใช้ในปฏิกิริยา PCR กับ L. pentosus species-specific วงดีเอ็นเอ (Fig. 3) การอบเหนียวอุณหภูมิอาจมีผล PCR specificityและกำหนดอุณหภูมิหลอมตัวสูงสุดเป็นเวลาใช้กระบวนการ [20] ต่ำกว่าอุณหภูมิการอบเหนียว และเพิ่มเติมPCR วงจรขยายอาจจะไม่ใช่เฉพาะ PCRผลิตภัณฑ์ ดังนั้น การหลอมอุณหภูมิหรือระยะสั้นควรจะใช้เวลาการอบเหนียว ในการศึกษาปัจจุบัน เราพบว่าอุณหภูมิหลอมที่เหมาะสมที่สุดสำหรับ SpOPD3Lpen-F1 /R1was C, 65 มี 20 รอบของ PCR ขยาย นอกจากนี้ การยืนยัน specificity พันธุ์ชุดนี้ของไพรเมอร์ แลคโตบาซิลลัส 34สายพันธุ์ทดสอบ และสาธิต accuracies ถึง 100%(ตาราง 1)เบียดเบียน เราได้พัฒนาคู่ species-specificไพรเมอร์ตามลายพิมพ์อาร์เอพีดี Speciesspecific นวนิยายเหล่านี้ไพรเมอร์ได้อย่างรวดเร็ว มีประสิทธิภาพ ถูกต้องและ reliablewayการแยกสายพันธุ์ L. pentosus จาก L. plantarumกลุ่ม

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

กระบวนการ RAPD ใช้วิธี PCR กับ oligonucleotide สุ่ม
ไพรเมอร์เพื่อขยายดีเอ็นเอและวิเคราะห์ความหลากหลายลำดับ.
ดีเอ็นเอเป็นเรื่องง่ายที่จะดำเนินการเป็นค่าใช้จ่ายที่มีประสิทธิภาพไม่
ต้องใช้ความรู้ลำดับก่อนและต้องใช้เพียงขนาดเล็ก
จำนวนเงินของแม่ดีเอ็นเอ [15] วิธี RAPD ได้
กลายเป็นที่ได้รับการยอมรับอย่างกว้างขวางว่าเป็นเครื่องมือในการจัดหมวดหมู่และวิวัฒนาการที่ถูกต้อง
สำหรับช่วงที่มีขนาดใหญ่ของสิ่งมีชีวิตรวมทั้ง lactobacilli [14,16e18] อย่างไรก็ตามการทำสำเนาดีเอ็นเอเป็นตัวแปรและกระบวนการที่มีความสำคัญ
กับสภาพปฏิกิริยารวมทั้งแม่แบบที่มีคุณภาพดีเอ็นเอ
ramping ความเร็วและประเภทของเครื่องมือที่ใช้ ดังนั้นจึงเป็นสิ่ง
ที่มีประสิทธิภาพมากขึ้นในการโคลนเครื่องหมาย RAPD และแปลงให้เป็น
ลำดับลักษณะภูมิภาคขยาย (Scars) เสริมลอง
ไพรอนุญาตให้อุณหภูมิการหลอมที่เข้มงวดมากขึ้น
กว่าที่ใช้กับการวิเคราะห์ดีเอ็นเอและมักจะส่งผลให้
การขยายของทางเดินเดียว [19] ดีเอ็นเอแม่แบบของการได้โดยเริ่มต้น
สายพันธุ์แลคโตบาซิลลัสถูกขยายด้วยไพรเมอร์ OPD-3 (50 GTCGCCGTCA- 30) โดย RAPD-PCR การขยายการผลิตนี้
วงดนตรีสายพันธุ์เฉพาะที่เฉพาะเจาะจงสำหรับ L. pentosus (รูปที่ 1). นี้เฉพาะ
ส่วนที่แยกได้แล้วและ ligated เป็น pCR2.1-TOPO
เวกเตอร์สำหรับการหาลำดับนิวคลีโอ โคลนดีเอ็นเอถูกติดใจ
(รูปที่. 2) ได้ลงนามในฐานข้อมูล GenBank และสอดคล้องกับโฮโมลอก
โดยใช้การวิเคราะห์ระเบิด ลำดับเหล่านี้แสดงให้เห็นว่าสูง
สอดคล้องกับการขนย้ายเอบีซีเอทีพีผูกพันและ
โปรตีน permease ของ L. pentosus ซึ่งเป็นที่รู้จักในการเล่นที่สำคัญ
บทบาทในการต้านทาน multidrug (MDR) จากนี้เราอนุมานได้ว่า
ลำดับโคลนเหล่านี้มีแนวโน้มที่แสดงการเปลี่ยนแปลงสูงซึ่งจะ
ทำให้พวกเขามีแม่แบบที่เหมาะสำหรับการออกแบบไพรเมอร์ที่เฉพาะเจาะจงที่จะ
เห็นความแตกต่างระหว่างชนิดภายใน L. plantarum กลุ่ม
คู่ไพรเมอร์, SpOPD3Lpen-F1 / R1, ได้รับการออกแบบจากโคลน
ลำดับและไพรเมอร์เหล่านี้ประสบความสำเร็จในการสร้างเดียว
วงเฉพาะสายพันธุ์ที่เมื่อใช้ในปฏิกิริยา PCR กับ L. pentosus
ดีเอ็นเอ (รูปที่. 3) หลอมอุณหภูมิอาจมีอิทธิพลต่อความจำเพาะ PCR,
และการกำหนดอุณหภูมิการหลอมที่ดีที่สุดคือช่วงเวลาที่
การบริโภค [20] ลดอุณหภูมิการหลอมและเพิ่มเติม
รอบขยาย PCR อาจนำไปสู่การที่ไม่เฉพาะเจาะจง PCR
ผลิตภัณฑ์ ดังนั้นไม่ว่าจะเป็นอุณหภูมิที่สูงหรือการหลอมสั้น
เวลาการหลอมควรใช้ ในการศึกษาปัจจุบันเราพบว่า
อุณหภูมิการอบที่เหมาะสมที่สุดสำหรับ SpOPD3Lpen-F1 /
R1was 65 องศาเซลเซียสมี 20 รอบของการขยาย PCR นอกจากนี้เพื่อ
ยืนยันความจำเพาะสายพันธุ์ของชุดของไพรเมอร์นี้, แลคโตบาซิลลัส 34
สายพันธุ์ที่ได้รับการทดสอบและแสดงให้เห็นถึงความถูกต้อง 100%
(ตารางที่ 1).
โดยสรุปเราได้มีการพัฒนาคู่ของสายพันธุ์เฉพาะ
ไพรเมอร์ขึ้นอยู่กับลายนิ้วมือดีเอ็นเอ เหล่านี้ speciesspecific นวนิยาย
ไพรเมอร์สามารถเป็นได้อย่างรวดเร็วมีประสิทธิภาพถูกต้องและ reliableway
ที่จะแยกแยะ L. pentosus ชนิดจาก L. plantarum
กลุ่ม

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

โดยการใช้กระบวนการ PCR กับไพรเมอร์ซึ่ง
สุ่มขยายดีเอ็นเอและการวิเคราะห์ลำดับล .
เพียงเป็นเรื่องง่ายที่จะดำเนินการ คือ ประหยัด ไม่ต้องใช้ความรู้ลำดับก่อน
และต้องใช้เพียงเล็กน้อย
แม่แบบดีเอ็นเอ [ 15 ] ด้วยวิธีการที่ได้กลายเป็นที่ยอมรับกันอย่างแพร่หลาย เป็นใช้ได้

ทางเครื่องมือต่างๆและสำหรับช่วงใหญ่ของสิ่งมีชีวิตได้แก่ แลคโตบาซิลลัส [ 14,16e18 ] อย่างไรก็ตาม ที่สุดคือ ตัวแปร และกระบวนการตรวจสอบเป็นคนอ่อนไหว
เงื่อนไขปฏิกิริยารวมทั้งคุณภาพดีเอ็นเอแม่แบบ
เพิ่มความเร็วและชนิดของเครื่องมือที่ใช้ ดังนั้น มันคือ
มีประสิทธิภาพมากขึ้นลอกแบบเครื่องหมายอาร์เอพีดีและแปลงให้เป็น
ลำดับลักษณะขยายภูมิภาค ( แผลเป็น )
แบบยาวไพรเมอร์ให้เข้มงวดมากขึ้นกว่าที่อุณหภูมิการอบอ่อน
ใช้กับการวิเคราะห์ RAPD และมักจะผลใน
แบบเดียว - [ 19 ] . แม่แบบดีเอ็นเอของสายพันธุ์ Lactobacillus ถูกขยายด้วย
opd-3 รองพื้น ( 50-gtcgccgtca-30 ) โดยชื่อเรื่อง . เครื่องขยายเสียงนี้ผลิต
เผ่าพันธุ์ - เฉพาะวงดนตรีเฉพาะ L . pentosus ( รูปที่ 1 ) นี้โดยเฉพาะ
ส่วน แล้วแยก และผูกเป็น pcr2.1-topo
เวกเตอร์สำหรับลำดับนิวคลีโอไทด์ของ . การโคลนยีนดีเอ็นเอ
( รูปที่ 2 ) ป้อนลงในฐานข้อมูลและขนาดสอดคล้องกับโฮโมลอกส์
การวิเคราะห์ระเบิด ลำดับเหล่านี้มีความสอดคล้องกันสูง
กับ ABC ขนส่ง , เอทีพี และ
permease โปรตีนของ L . pentosus ซึ่งเป็นที่รู้จักกันในการเล่นที่สำคัญ
บทบาทในการต้านทาน ( 2547 ) จากเรื่องนี้ เราลงความเห็นว่า
เหล่านี้โคลนลำดับอาจแสดงการเปลี่ยนแปลงสูง ซึ่งจะทำให้พวกเขาเหมาะสำหรับการออกแบบแม่แบบ

โดยเฉพาะ เพื่อแบ่งแยกระหว่างสปีชีส์ในกลุ่ม L . plantarum . a
primer คู่ spopd3lpen-f1 / R1 , ได้รับการออกแบบจากโคลน
ลําดับและไพรเมอร์เหล่านี้ได้สร้างเดียว
เผ่าพันธุ์ - เฉพาะวง เมื่อใช้ในปฏิกิริยา PCR กับ L . pentosus
DNA ( รูปที่ 3 ) อุณหภูมิอบอาจมีอิทธิพลต่อ PCR วิธี
และกำหนดที่เหมาะสมอุณหภูมิการอบอ่อนเป็นเวลา
การบริโภค [ 20 ] ลดอุณหภูมิอบเพิ่มเติม ซึ่งอาจนำไปสู่การเพิ่มจำนวนรอบ

ผลิตภัณฑ์โดยเฉพาะ . ดังนั้น ไม่ว่าจะสูงหรือเตี้ย
อุณหภูมิการอบอ่อนการอบอ่อนควรใช้ ในการศึกษาครั้งนี้เราพบว่าอุณหภูมิการอบอ่อน
เหมาะสมที่สุดสำหรับ spopd3lpen-f1 /
r1was 65
C 20 รอบของ PCR แบบ . โดย

ยืนยันความจำเพาะของไพรเมอร์ชนิดของชุดนี้ 34 สายพันธุ์ Lactobacillus
ทดสอบและแสดงให้เห็นถึงความถูกต้อง 100 %
( ตารางที่ 1 ) .
สรุป เราได้พัฒนาเผ่าพันธุ์ - เฉพาะ
คู่ของไพรเมอร์ ตามด้วยลายนิ้วมือ นวนิยายเหล่านี้ speciesspecific
ไพรเมอร์สามารถได้อย่างรวดเร็ว มีประสิทธิภาพ ถูกต้อง และ reliableway
แยกแยะ L . pentosus ชนิด จากกลุ่ม L . plantarum