TO cells were seeded in 24-well pla

TO cells were seeded in 24-well plates (Nunc) at a density of 2 105 cells per well. The cells were transfected using 10 ml Neon® Transfection System (Invitrogen, Carlsbad, CA) with 10 ml buffer R and 500 n plasmid in each well, and using 2 pulses of 1100 V and 30 ms each. In each well, cells were transfected with 50 ng ofRenilla luciferase vector (Promega, Madsion, WI), 150 ng of pA1(- 202), 150 ng of either pIRF1, pIRF3 pIRF7A, pIRF7B or pIPS-1, and 150 ng of either ps7ORF1, ps8ORF2 or control vector pcDNA3.1. The transfected TO cells were harvested after 48 h. According to man- ufacturer's instruction, the cells were lysed by 70 ml 1 passive lysis buffer from Dual-Luciferase® reporter assay system (Promega, Madsion, WI). Ten microliters of lysate was dispensed with 100 ml of luciferase assay buffer II to measure the Renilla luciferase activity for normalization of transfection efficiency. Then the firefly lucif- erase activity was recorded after adding 100 ml of Stop & Glo buffer in the same well. Both luciferase activity assays were documented using a plate Luminometer, Luminoskan Ascent (Thermo Scientific, Beverly, MA). All samples for promoter assay were set up in trip- licates and the results were presented as relative luciferase activ- ities. All luciferase reporter assays were repeated at least three times.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

เซลล์ถูกเตรียมในดี 24 แผ่น (Nunc) ที่ความหนาแน่นของ 2 105 เซลล์ต่อดี เซลล์ถูก transfected ใช้ 10 มล. Neon® Transfection ระบบ (Invitrogen คาร์ลบาด CA) บัฟเฟอร์ 10 ml R และ 500 n plasmid ในแต่ละดี และใช้ 2 พัลส์ของ V และ 30 ms แต่ละ ในแต่ละดี เซลล์ถูก transfected กับ 50 ฉบับ ofRenilla luciferase เวกเตอร์ (Promega, Madsion, WI), 150 ฉบับ pA1(-202), 150 ฉบับของ pIRF1, pIRF3 pIRF7A, pIRF7B หรือ 1 จุด และ 150 ฉบับของ ps7ORF1, ps8ORF2 หรือการควบคุมเวกเตอร์ pcDNA3.1 การ transfected เซลล์เก็บเกี่ยวหลังจาก 48 ชั่วโมง ตามคำสั่งคน-ufacturer เซลล์ถูก lysed โดยบัฟเฟอร์ lysis แฝง 70 ml 1 จาก Dual-Luciferase® โปรแกรมรายงานการทดสอบระบบ (Promega, Madsion, WI) Microliters สิบของ lysate ของถูกจ่าย มีบัฟเฟอร์ทดสอบ luciferase II วัดกิจกรรม luciferase Renilla สำหรับฟื้นฟูประสิทธิภาพ transfection 100 มิลลิลิตร แล้ว หิ่งห้อย lucif ลบกิจกรรมถูกบันทึกหลังจากเพิ่ม 100 มล.ของบัฟเฟอร์และ Glo เหมือนกัน Assays ทั้งกิจกรรม luciferase ถูกได้ใช้จาน Luminometer ขึ้น Luminoskan (วิทยาศาสตร์เทอร์โม เบเวอร์ลี่ MA) ตัวอย่างทั้งหมดสำหรับผู้ทดสอบตั้งขึ้นใน licates โก และผลลัพธ์ถูกแสดงเป็นญาติ luciferase ห้คุณสามารถของพิเศษ ทั้งหมด luciferase ข่าว assays ซ้ำกันน้อยครั้งที่สาม

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

ไปยังเซลล์เมล็ดในแผ่น 24 หลุม (Nunc) ที่อัตราความหนาแน่น 2 105 เซลล์ต่อกัน เซลล์ถูก transfected ใช้ 10 มล. Neon®ระบบมีเดีย (Invitrogen, Carlsbad, CA) 10 มล. บัฟเฟอร์ R และ 500 N พลาสมิดในแต่ละอย่างดีและใช้ 2 พัลส์ 1100 V และ 30 มิลลิวินาทีในแต่ละ ในแต่ละดีเซลล์ถูก transfected 50 NG ofRenilla luciferase เวกเตอร์ (Promega, Madsion, WI) 150 NG ของ PA1 (- 202) 150 NG ทั้ง pIRF1, pIRF3 pIRF7A, pIRF7B หรือ pips-1 และ 150 นาโนกรัมทั้ง ps7ORF1, ps8ORF2 หรือการควบคุมเวกเตอร์ pcDNA3.1 transfected ไปยังเซลล์ที่ถูกเก็บเกี่ยวหลังจาก 48 ชั่วโมง ตามคำสั่งของมนุษย์ ufacturer เซลล์ถูก lysed 70 มล. 1 บัฟเฟอร์สลายแฝงจาก Dual-Luciferase®ระบบนักข่าวทดสอบ (Promega, Madsion, WI) สิบไมโครลิตรของ lysate ถูกจ่าย 100 มิลลิลิตร luciferase ทดสอบบัฟเฟอร์ครั้งที่สองในการวัดกิจกรรม luciferase Renilla สำหรับการฟื้นฟูของประสิทธิภาพ transfection จากนั้นกิจกรรมการลบ lucif- หิ่งห้อยถูกบันทึกไว้หลังจากเพิ่ม 100 มล. ของ Stop & Glo บัฟเฟอร์ดีเหมือนกัน การวิเคราะห์ทั้งสองกิจกรรม luciferase ได้รับการบันทึกโดยใช้ Luminometer แผ่น Luminoskan Ascent (Thermo Scientific, Beverly, MA) ตัวอย่างทั้งหมดสำหรับการทดสอบก่อการตั้งอยู่ใน licates trip- และผลลัพธ์ที่ได้นำเสนอเป็นญาติสิ่งอํา activ- luciferase ทั้งหมดตรวจนักข่าว luciferase ซ้ำอย่างน้อยสามครั้ง

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

เซลล์ถูก seeded ใน 24 ดีแผ่น ( ขณะนี้ ) ในอัตราความหนาแน่น 2 105 เซลล์ต่อดี เซลล์ก็ transfected ใช้ 10 ml ®นีออนสำหรับระบบ ( Invitrogen Carlsbad , CA , 10 ml ) กับบัฟเฟอร์ R และ 500 N พลาสมิดในแต่ละหลุม และใช้ 2 กะพริบ 1 , 100 V 30 นางสาวแต่ละ ในแต่ละเซลล์มี transfected ดี กับ 50 ของ ofrenilla เวกเตอร์เอนไซม์ลูซิเฟอเรส ( promega แมดิ น , , WI ) , 150 นาโน pa1 ( 202 ) , 150 นาโนให้ pirf1 pirf3 pirf7a pirf7b , , หรือ pips-1 และ 150 นาโนให้ ps7orf1 ps8orf2 , หรือควบคุม pcdna3.1 เวกเตอร์ การ transfected เซลล์ถูกเก็บเกี่ยวหลังจาก 48 ชั่วโมง ตามคำสั่งของชาย ufacturer , เซลล์ก็ lysed 70 ml 1 เรื่อยๆการสลายบัฟเฟอร์จากคู่ลูซิเฟอเรส®นักข่าวในระบบ ( promega แมดิ น , , WI ) 10 ตัวเลขของ lysate ถูกจ่ายด้วย 100 มิลลิลิตรเอนไซม์ลูซิเฟอเรส ( บัฟเฟอร์ 2 วัด renilla ลูซิเฟอเรสกิจกรรมเพื่อการฟื้นฟูประสิทธิภาพสำหรับ . แล้วหิ่งห้อยลูซีฟ - ลบกิจกรรมที่ถูกบันทึกไว้หลังจากการเพิ่ม 100 มิลลิลิตรของหยุดฯบัฟเฟอร์ในแบบเดียวกันด้วย ทั้งกิจกรรมเอนไซม์ลูซิเฟอเรส ( ตรวจเอกสารใช้จานลูมิโนมิเตอร์ luminoskan ทางขึ้น ( เทอร์โม , วิทยาศาสตร์ , เบเวอร์ลี , MA ) ตัวอย่างสำหรับการทดสอบ มีการตั้งค่าในการเดินทาง - licates และผลลัพธ์ที่ได้ แสดง เป็น ญาติ ลูซิเฟอเรสทีฟ - ities . นักข่าวลูซิเฟอเรสสามารถเป็นเวลาอย่างน้อยสามครั้ง