2.2.4. Determination of hyaluronida

2.2.4. Determination of hyaluronidase activity (HA)
Hyaluronidase activity of the venom and its molecular
mass determination was analyzed by sodium dodecyl
sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis and performed
according to Cevallos et al. (1992). Briefly, SDS-PAGE gels
were prepared with hyaluronan, which was incorporated
into the gels as a hyaluronidase substrate in the 10%
resolving gel at a final concentration of 0.5 mg/mL.
Venom samples (10 and 5 mg), dispersed in Laemmli
buffer under non-reducing conditions and room temperature,
were electrophoresed at 90 V at room temperature
until the indicator reached the end of the gel. After
electrophoresis, the gel was washed twice in 5% Triton X-
100 in sodium phosphate buffer 0.1 M, pH 5.8, with
0.15 M NaCl for 1 h, once in 0.05% Triton X-100 in buffer
pH 5.8 for an hour and finally in buffer pH 5.8 without
Triton X-100 for 10 min. All these steps were performed at
room temperature. Subsequently, the gel was placed in
buffer without Triton X-100 and incubated at 37 C for the
desired amount of time. After incubation, the gels were
washed twice for 15 min in 0.015 M Tris–HCl, pH 7.95 and
then stained under gentle rotation for at least 5 h in the
dark. A stock solution of 0.1% Stains-all (1-ethyl-2-[3-(1-
ethylnaphthol [1,2-d] thiazolin-2-ylidene)-2-
methylpropenyl] Naphthol [1,2-d] thiazolium bromide;
Cat. No. 2718 fromEastman Kodak Company, Rochester,
NY, USA) in pure formamide was stored in a dark
container. The dye solution was freshly prepared by
combining 5 mL dye stock with 5 mL of formamide, 20 mL
of isopropanol, 1.5 mL of 1 M Tris–HCl, pH 7.95, and
deionized water to a volume of 100 mL (Green et al.,
1973). The gel was destained in 5% formamide and 20%
isopropanol in 0.015 M Tris–HCl, pH 7.95, until bands of
activity become clear. The protein molar mass standards
were always separated at the extreme end of the gel plate
and following electrophoresis, the line was carefully
sectioned and stained with Coomassie brilliant blue
R-250.
2.2.5. Determination

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

2.2.4 การกำหนดกิจกรรม hyaluronidase (ฮา)กิจกรรม hyaluronidase พิษและโมเลกุลของกำหนดมวลถูกวิเคราะห์ โดย dodecyl โซเดียมซัลเฟต polyacrylamide เจ electrophoresis และดำเนินการตาม Cevallos et al. (1992) สั้น ๆ SDS หน้าเจได้เตรียมกับ hyaluronan ซึ่งถูกรวมอยู่เป็นเจเป็น hyaluronidase พื้นผิวใน 10%เจลที่แก้ไขที่เข้มข้นสุดท้ายของ 0.5 mg/mLพิษตัวอย่าง (5 และ 10 มิลลิกรัม), กระจายใน Laemmliบัฟเฟอร์ไม่ลดเงื่อนไขและอุณหภูมิห้องมี electrophoresed ที่ 90 V ที่อุณหภูมิห้องจนตัวบ่งชี้ถึงจุดสิ้นสุดของเจ หลังจากelectrophoresis เจถูกล้างสองครั้งใน 5% ไตรตั้น X-100 ในโซเดียมฟอสเฟตบัฟเฟอร์ 0.1 M, pH 5.8 ด้วย0.15 M NaCl สำหรับ h 1 ครั้งเดียวใน 0.05% 100 X ไตรตั้นในบัฟเฟอร์pH 5.8 ชั่วโมง และสุดท้ายในบัฟเฟอร์ pH 5.8 โดยไตรตั้น X-100 ใน 10 นาที ดำเนินขั้นตอนเหล่านี้ทั้งหมดที่ที่อุณหภูมิห้อง ในเวลาต่อมา เจถูกวางไว้ในบัฟเฟอร์โดยไตรตั้น X-100 และ incubated ที่ 37 C สำหรับการจำนวนเวลาที่ระบุ หลังจากบ่ม เจได้ล้างสองครั้งสำหรับ 15 นาทีใน 0.015 M ตรี – HCl, pH 7.95 และแล้ว สีภายใต้หมุนเบา ๆ สำหรับน้อย 5 h ในการมืด ปัญหาหุ้นของ 0.1% คราบทั้งหมด (1-เอทิล - 2- [3- (1-ethylnaphthol [1, 2-d] thiazolin-2-ylidene) -2-methylpropenyl] โบรไมด์ Naphthol [1, 2-d] thiazoliumแมว 2718 หมายเลข fromEastman บริษัทโกดัก โรเชสเตอร์NY, USA) ใน formamide บริสุทธิ์ถูกเก็บไว้ในมืดคอนเทนเนอร์ โซลูชั่นย้อมถูกซึ่งทำด้วยรวมหุ้น 5 mL ย้อม ด้วย 5 mL ของ formamide, 20 mLของ isopropanol, 1.5 mL 1 M ตรี – HCl, 7.95 ค่า pH และปริมาตร 100 mL ของน้ำ deionized (Green et al.,1973) เจถูก destained formamide 5% และ 20%isopropanol ใน 0.015 M ตรี – HCl, pH 7.95 จนถึงวงของกิจกรรมที่ชัดเจน มาตรฐานโดยรวมสบโปรตีนจะแยกออกจากกันที่ขั้วของแผ่นเจลและต่อไปนี้ electrophoresis บรรทัดอย่างระมัดระวังส่วน ๆ และทิ้งคราบด้วย Coomassie ใสสีน้ำเงินR-2502.2.5 การกำหนด

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

2.2.4 การกำหนดกิจกรรม hyaluronidase (HA)
กิจกรรม Hyaluronidase ของพิษและโมเลกุลของ
การวัดมวลได้รับการวิเคราะห์โดยโซเดียมโดเดซิล
เจลอิเล็กซัลเฟต polyacrylamide และดำเนินการ
ตาม Cevallos และคณะ (1992) สั้น ๆ , เจล SDS-PAGE
ที่เตรียม hyaluronan ซึ่งได้รับการจัดตั้งขึ้น
เป็นเจลเป็นสารตั้งต้นใน hyaluronidase 10%
การแก้ไขเจลที่มีความเข้มข้นสุดท้ายของ 0.5 mg / ml.
ตัวอย่างพิษ (10 และ 5 มก.) กระจายตัวใน Laemmli
บัฟเฟอร์ ภายใต้เงื่อนไขที่ไม่ลดและอุณหภูมิห้อง
ได้รับการ electrophoresed ที่ 90 V ที่อุณหภูมิห้อง
จนตัวบ่งชี้ถึงจุดสิ้นสุดของเจล หลังจาก
electrophoresis เจลล้างสองครั้งใน 5% Triton X-
100 ในบัฟเฟอร์โซเดียมฟอสเฟต 0.1 M, ค่า pH 5.8 กับ
0.15 M NaCl เป็นเวลา 1 ชั่วโมงในทันที 0.05% Triton X-100 ในบัฟเฟอร์
ค่า pH 5.8 สำหรับชั่วโมงและในที่สุด ค่า pH บัฟเฟอร์ 5.8 โดยไม่ต้อง
Triton X-100 เป็นเวลา 10 นาที ขั้นตอนทั้งหมดนี้ได้รับการดำเนินการที่
อุณหภูมิห้อง ต่อมาเจลถูกนำมาวางใน
บัฟเฟอร์โดยไม่ต้อง Triton X-100 และบ่มที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียสสำหรับ
จำนวนที่ต้องการของเวลา หลังจากการบ่มเจลได้รับการ
ล้างสองครั้งเป็นเวลา 15 นาทีใน 0.015 M Tris-HCl ค่า pH 7.95 และ
ย้อมสีแล้วภายใต้การหมุนอ่อนโยนอย่างน้อย 5 ชั่วโมงใน
ความมืด วิธีการแก้ปัญหาของหุ้น 0.1% คราบทั้งหมด (1 เอทิล-2- [3- (1-
ethylnaphthol [1,2-D] thiazolin-2-ylidene) -2-
methylpropenyl] Naphthol [1,2-D] thiazolium โบรไมด์;
. แมวฉบับที่ 2718 fromEastman Kodak บริษัท โรเชสเตอร์,
นิวยอร์ก, สหรัฐอเมริกา) ใน Formamide บริสุทธิ์ถูกเก็บไว้ในที่มืด
ภาชนะ วิธีการแก้ปัญหาสีย้อมได้ถูกจัดทำสดใหม่โดย
รวม 5 หุ้นย้อมมิลลิลิตร 5 มิลลิลิตร Formamide, 20 มิลลิลิตร
ของ isopropanol 1.5 มิลลิลิตร 1 M Tris-HCl ค่า pH 7.95 และ
น้ำปราศจากไอออนปริมาณ 100 มิลลิลิตร (สีเขียว et al.,
1973) เจลถูก destained ใน 5% Formamide และ 20%
ใน isopropanol 0.015 M Tris-HCl พีเอช 7.95 จนกว่าแถบ
กิจกรรมกลายเป็นที่ชัดเจน โปรตีนมาตรฐานมวลโมเลกุล
ถูกแยกออกเสมอที่ปลายสุดของแผ่นเจล
และอิเล็กต่อไปนี้สายอย่างระมัดระวัง
ตัดและย้อมด้วยสีฟ้าสดใส Coomassie
R-250.
2.2.5 การกำหนด

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

2.2.4 . การกำหนดกิจกรรมไฮอะลูโรนิเดส ( ฮา )
ไฮอะลูโรนิเดสกิจกรรมของพิษและความมุ่งมั่นของมวลโมเลกุล
โดยใช้โซเดียมโดเดซิลซัลเฟต polyacrylamide gel electrophoresis และการแสดง

ตาม cevallos et al . ( 1992 ) สั้น ๆ , เอนไซม์เจล
เตรียมกับ hyaluronan ซึ่งจัดตั้งขึ้น
เป็นเจลเป็นวัสดุใน 10 %
ไฮอะลูโรนิเดสแก้ไขเจลที่ความเข้มข้นสุดท้าย 0.5 มิลลิกรัม / มิลลิลิตร
ตัวอย่างพิษ ( 10 และ 5 มิลลิกรัม ) กระจายตัวใน laemmli
บัฟเฟอร์ภายใต้เงื่อนไขและไม่มีการลดอุณหภูมิอยู่ที่ 90 electrophoresed
V
อุณหภูมิห้องจนกว่าจะบ่งชี้ถึงการสิ้นสุดของเจล หลังจาก
electrophoresis , เจลล้างสองครั้งใน 5 % Triton x -
100 ใน 0.1 M ฟอสเฟตบัฟเฟอร์ pH 5.8 ,
1 M NaCl เป็นเวลา 1 ชั่วโมงเมื่ออยู่ในบัฟเฟอร์ 0.05% Triton X-100
pH 5.8 ชั่วโมงสุดท้ายในบัฟเฟอร์ pH 5.8 โดย
Triton X-100 นาน 10 นาที ขั้นตอนเหล่านี้มีการปฏิบัติที่
อุณหภูมิห้อง ต่อมา เจลที่ถูกวางไว้ใน
บัฟเฟอร์โดย Triton X-100 บ่มที่ 37  C
ต้องการระยะเวลา หลังจากบ่ม , เจลล้าง 2 ครั้ง 15 นาที )
3 M ) ในบริษัท HCL 7.95 และ
อแล้วย้อมสีตามการหมุนเบาๆ อย่างน้อย 5 ชั่วโมงใน
มืด หุ้นโซลูชั่น 0.1% คราบทั้งหมด ( 1-ethyl-2 - [ 3 - ( 1 - ethylnaphthol 1,2-d
[ ]
methylpropenyl thiazolin-2-ylidene ) - 2 - [ ] naphthol 1,2-d ] thiazolium bromide ;
แมว ไม่ โดย fromeastman Kodak บริษัท โรเชสเตอร์
NY , USA ) บริสุทธิ์ ที่ถูกเก็บไว้ในภาชนะ Formamide มืด

สารละลายสีย้อมคือสดใหม่ ปรุงโดย
รวม 5 สี 5 มิลลิลิตร ML หุ้น Formamide 20 ml
ของไอโซโพรพานอล , 1.5 ml 1 M โดย–กรดไฮโดรคลอริก pH 7.95 และ
คล้ายเนื้อเยื่อประสานน้ำปริมาณ 100 ml ( สีเขียว et al . ,
1973 ) เจลคือ destained ใน Formamide 5% และไอโซโพรพานอล 20 %
3 M ) ในบริษัทไอด่างนั้น จนกว่าแถบ
กิจกรรมกลายเป็นชัดเจน โปรตีนมาตรฐานมวลต่อโมล
มักจะแยกในตอนท้ายสุดของจาน
เจลและต่อไปนี้อิเล็กบรรทัดรอบคอบ
แบ่งและเต็มไปด้วยเหล่านี้น่าจะเป็นสีฟ้าสดใส r-250
.
2.2.5 . ความมุ่งมั่น