2.1. Mice breeding and irradiationF

2.1. Mice breeding and irradiation
For the in vivo experiments, the pUR288 lacZ-transgenic mouse line 30 [12], harbouring 21 copies of the bacterial lacZ gene, was crossbred with the humanised NBS mouse which harbours the human NBN gene with the 5 bp founder mutation on a null-mutant murine Nbn background (Nbn−/−NBNdel5; [7]). The lacZ-transgenic mouse was also crossbred with our previously described cre recombinase inducible null mutant mouse (Nbnins6/lox6; [6]) and fibroblasts isolatedfor in vitro experiments in the completeabsence of nibrin. All mice had a mixed C57BL/6/129Sv background. Geno- typing was conducted by PCR analysis on DNA isolated from tail biopsies of the mice. Whole-body irradiation of mice was performed with the Cs137-irradiation device OB29/4 S/N 010 (Gamma-Service Medical GmbH) after sedation with Isoflurane. Mice were irradiated on 5 consecutive days with 0.5 Gy per day. Two days after the last irradiation animals were sacrificed and organs frozen in liquid nitrogen until extraction of DNA for the lacZ mutation assay.
2.2. Cell culture and cre recombinase treatment
Fibroblasts were derived from ear explants of control wild type mice (lacZ-Nbn+/+), humanised mice (lacZ-Nbn−/−NBNdel5) and heterozygous mice (lacZ-Nbnins6/lox6). Cells were cultured in Dul- becco’s modified Eagle’s medium (DMEM; Gibco Life Technologies, Germany) supplemented with 5% glucose and 10% foetal calf serum (FCS). Cell culture conditions were 37 ◦C and 5% CO2. Environ- mental oxygen was reduced to 4%. To generate homozygous null mutant fibroblasts in vitro, lacZ-Nbnins6/lox6 cells were incubated in suspension on two consecutive days with 1 ␮M cre recombinase (Excellgen, Rockville) for 2 h. Loss of nibrin was determined by PCR and western blot analysis as previously described [6]. Fibroblast cultures were irradiated in 75 cm2 flasks on ice with a single dose of 5 Gy and cells subsequently examined in the comet assay or lacZ assay.

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

2.1 หนูปรับปรุงพันธุ์และการฉายรังสีสำหรับในร่างกายทดลองสายเมาส์ pUR288 lacZ-ยีน 30 [12], เก็บงำ 21 สำเนาของยีนของแบคทีเรีย lacZ เป็นลูกผสมกับเมาส์ humanised NBS ซึ่งสถิตอยู่ในยีนของมนุษย์ NBN กับ 5 bp กลายพันธุ์ผู้ก่อตั้ง บนโมฆะกลายพันธุ์พื้นหลัง Nbn หมา (Nbn - / - NBNdel5; [7])
เมาส์ lacZ-พันธุ์ลูกผสมถูกยังมี recombinase CRE อธิบายไว้ก่อนหน้าเรา inducible เมาส์กลายพันธุ์ null (Nbnins6 / lox6; [6]) และสาย broblasts isolatedfor ในหลอดทดลอง completeabsence ของ nibrin หนูทั้งหมดมีผสม C57BL / 6 / 129Sv พื้นหลัง พิมพ์ Geno- ได้ดำเนินการโดยวิธี PCR วิเคราะห์ดีเอ็นเอที่แยกได้จากการตรวจชิ้นเนื้อหางของหนู การฉายรังสีทั้งร่างกายของหนูที่ได้ดำเนินการกับอุปกรณ์ Cs137 ฉายรังสี OB29 / 4 S / N 010 (Gamma-บริการทางการแพทย์ GmbH) หลังจากใจเย็นกับ Iso ชั้น urane หนูถูกฉายในวันที่ 5 ติดต่อกันเป็นวันที่มี 0.5 Gy ต่อวัน สองวันหลังจากการฉายรังสีสัตว์ที่ผ่านมาถูกไฟ sacri ced และอวัยวะแช่แข็งในไนโตรเจนเหลวจนการสกัดดีเอ็นเอสำหรับการทดสอบการกลายพันธุ์ lacZ.
2.2 การเพาะเลี้ยงเซลล์และ CRE รักษา recombinase
รบราได้มาจากชิ้นส่วนหูของหนูป่าประเภทการควบคุม (lacZ-Nbn + / +) หนู humanised (lacZ-Nbn - / - NBNdel5) และหนู heterozygous (lacZ-Nbnins6 / lox6) เซลล์เพาะเลี้ยงในสาย Modi Dul- Becco ed ของกลางนกอินทรี (DMEM; Gibco ชีวิต Technologies, เยอรมนี) เสริมด้วยกลูโคส 5% และ 10% ในซีรั่มของทารกในครรภ์ลูกวัว (FCS) เงื่อนไขการเพาะเลี้ยงเซลล์ 37 ◦Cและ CO2 5% ออกซิเจนจิตสิ่งแวดล้อมก็จะลดลง 4% เพื่อสร้าง homozygous null broblasts สายกลายพันธุ์ในหลอดทดลอง lacZ-Nbnins6 / lox6 เซลล์ถูกบ่มในการระงับสองวันติดต่อกัน 1 ␮M CRE recombinase (Excellgen, Rockville) เป็นเวลา 2 ชั่วโมง การสูญเสียของ nibrin ถูกกำหนดโดยวิธี PCR และการวิเคราะห์ดวงตะวันตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ [6] วัฒนธรรม fibroblast ถูกฉายใน 75 ซม 2 ชั้นถามบนน้ำแข็งที่มีขนาดเดียว 5 เกรย์และเซลล์การตรวจสอบในภายหลังการทดสอบดาวหางหรือทดสอบ lacZ

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

2.1 . หนูพันธุ์และการฉายรังสี
สำหรับในสัตว์ทดลอง , pur288 lacz จำลองเมาส์สาย 30 [ 12 ] กับ 21 ชุดของยีน lacz แบคทีเรีย เป็นลูกผสมกับ humanised NBS เมาส์ที่ท่าเรือยีนมนุษย์ราวกับ 5 BP ผู้ก่อตั้งการกลายพันธุ์ใน null กลายพันธุ์ ~ พื้นหลัง ( NBN −−บาท / nbndel5 ; [ 7 ] )เมาส์ lacz ยีนลูกผสมของเรายังอธิบายไว้ก่อนหน้านี้ด้วย recombinase inducible null กลายพันธุ์ เมาส์ ( nbnins6 / lox6 ; [ 6 ] ) และจึง broblasts isolatedfor ในหลอดทดลองใน completeabsence ของ nibrin . หนูมี c57bl ผสม / 6 / 129sv พื้นหลัง จีโน่ - พิมพ์โดยวิธี PCR ในการวิเคราะห์ดีเอ็นเอที่แยกได้จากเนื้อเยื่อหางของหนูการฉายรังสีที่ร่างกายของหนูได้ด้วย cs137 ฉายรังสีอุปกรณ์ ob29 / 4 S / N 010 ( GmbH บริการทางการแพทย์แกมมา ) หลังจากความใจเย็นกับ ISO fl urane . หนูคือการฉายรังสีใน 0.5 Gy ติดต่อกัน 5 วัน ต่อ วัน สองวันหลังจากที่สัตว์การฉายรังสีเมื่อซาคริจึง CED และอวัยวะแช่แข็งในไนโตรเจนเหลวจนการสกัด DNA สำหรับ lacz mutation assay .
2.2 .การเพาะเลี้ยงเซลล์ไฟโบรบลาสต์และการรักษาด้วย recombinase
มาจากหูอาหารควบคุมป่าประเภทหนู ( lacz บาท / ) humanised หนู ( lacz −−บาท / nbndel5 ) และหนู homozygous ( lacz-nbnins6 / lox6 ) เซลล์เพาะเลี้ยงใน DUI - becco ของโมไดจึงเอ็ดนกอินทรีขนาดกลาง ( dmem ; gibco ชีวิตเทคโนโลยีเยอรมนี ) เติมน้ำตาล 5% และ 10% เซรั่ม foetal น่อง ( FCS )สภาพการเพาะเลี้ยงเซลล์จำนวน 37 ◦ C และ CO2 ร้อยละ 5 สิ่งแวดล้อม - จิตออกซิเจนลดลงถึง 4% การสร้างยีนกลายพันธุ์ จึงเป็นโมฆะ broblasts ในหลอดแก้ว lacz-nbnins6 / lox6 cells ) ระงับสองวันติดต่อกัน ด้วย 1 ␮ M ด้วย recombinase ( excellgen วิลล์ , ) เป็นเวลา 2 ชั่วโมง การสูญเสีย nibrin ถูกกำหนดโดยวิธี PCR และการวิเคราะห์ Western blot ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ [ 6 ]ส่วนวัฒนธรรมคือการฉายรังสีใน 75 cm2 flถามบนน้ำแข็งกับยาเดี่ยว 5 เกรย์ และเซลล์ ภายหลังตรวจสอบในดาวหางวิเคราะห์หรือ lacz ตามลำดับ