A modified Chelex-based method usin

A modified Chelex-based method using an InstaGene whole blood kit (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) was used to extract DNA from blood spots on filter paper. A blood spot of 4 mm in diameter was punched out and soaked overnight in 100 μl of phosphate-buffered saline (PBS) at 4°C. DNA extraction was performed on the following day as described previously (1). All samples were purified twice with the InstaGene matrix and stored at −20°C until further processing.

A template of 5 μl was used in a 50-μl nest 1 reaction mixture (GoTaq PCR core system; Promega, Madison, WI) under the following conditions: 5 μl of each primer (10 μM), 125 μM each dNTP, 2 mM MgCl2, and 1 U of GoTaq DNA polymerase.

Nest 2 reactions and further procedures (with the exception of the centrifugation step of the direct PCR nest 1 product) were identical to the standard- and direct nested-PCR techniques discussed above.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

แก้ไข Chelex ตามวิธีการใช้ชุดการรวมเลือด InstaGene (ห้องปฏิบัติการชีวภาพ Rad เฮอร์คิวลิส แคลิฟอร์เนีย) ถูกใช้เพื่อแยกดีเอ็นเอจากเลือดจุดบนกระดาษกรอง จุดเลือดของเส้นผ่าศูนย์กลาง 4 มม.เจาะรูออกมา และนำไปแช่ค้างคืนใน μl 100 ของ buffered ฟอสเฟตน้ำเกลือ (PBS) ที่ 4 องศาเซลเซียส ทำการสกัดดีเอ็นเอในต่อวันอธิบายไว้ก่อนหน้านี้ (1) ตัวอย่างทั้งหมดก็บริสุทธิ์สองกับเมตริกซ์ InstaGene และเก็บไว้ที่ −20 ° C จนประมวลผลต่อไปใช้แบบของ 5 μl ใน 50 μl รัง 1 ปฏิกิริยาส่วนผสม (ระบบหลัก GoTaq PCR Promega เมดิสัน WI) ภายใต้เงื่อนไขต่อไปนี้: 5 μl ของแต่ละพื้น (10 μM), 125 μM dNTP, MgCl2 2 มม. และพอลิเมอเรส U GoTaq DNA 1ซ้อนปฏิกิริยาที่ 2 และขั้นตอนต่อไป (ยกเว้นขั้นตอน centrifugation ผลิตภัณฑ์รัง 1 PCR โดยตรง) ได้เหมือนกับเทคนิคมาตรฐาน และตรงซ้อน-PCR ที่กล่าวถึงข้างต้น

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

วิธีการแก้ไข Chelex โดยใช้ชุดเลือด InstaGene ทั้ง (Bio-Rad ห้องปฏิบัติการ, ดาว, CA) ถูกนำมาใช้ในการสกัดดีเอ็นเอจากจุดเลือดบนกระดาษกรอง จุดเลือด 4 มมถูกเจาะออกมาและแช่ค้างคืนใน 100 ไมโครลิตรน้ำเกลือฟอสเฟตบัฟเฟอร์ (พีบีเอส) ที่ 4 ° C การสกัดดีเอ็นเอที่ได้ดำเนินการในวันต่อไปนี้ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ (1) ตัวอย่างทั้งหมดถูกบริสุทธิ์เป็นครั้งที่สองกับเมทริกซ์ InstaGene และเก็บไว้ที่ -20 ° C จนดำเนินการต่อไป. แม่แบบ 5 ไมโครลิตรที่ใช้ใน 50 ไมโครลิตรรัง 1 ปฏิกิริยาส่วนผสม (ระบบหลัก GoTaq PCR; Promega, Madison, WI) ภายใต้ ต่อไปนี้เงื่อนไข: 5 ไมโครลิตรของแต่ละไพรเมอร์ (10 ไมครอน) 125 ไมครอนแต่ละ dNTP 2 มิลลิ MgCl2 และ 1 ยู GoTaq ดีเอ็นเอโพลิเมอร์. Nest 2 ปฏิกิริยาและขั้นตอนต่อไป (ยกเว้นขั้นตอนการหมุนเหวี่ยงของรัง PCR โดยตรงที่ 1 ผลิตภัณฑ์) เหมือนกันกับระดับมาตรฐานและตรงเทคนิคการซ้อนกัน-PCR ที่กล่าวข้างต้น

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

ดัดแปลงจาก chelex โดยใช้ชุดเลือด instagene ( ไบโอ ราดห้องปฏิบัติการ , Hercules , CA ) ถูกใช้เพื่อสกัดดีเอ็นเอจากจุดเลือดบนกระดาษกรอง เลือดจุด 4 มม. ถูกเจาะออก และแช่ค้างคืนใน 100 μลิตรฟอสเฟตในน้ำเกลือ ( PBS ) ที่อุณหภูมิ 4 องศา การสกัดดีเอ็นเอแสดงในวันต่อไปนี้ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ ( 1 )ตัวอย่างบริสุทธิ์สองครั้งกับ instagene เมทริกซ์และเก็บรักษาที่อุณหภูมิ 20 ° C −ไปจนถึงการประมวลผลเพิ่มเติม

แม่แบบ 5 μผมใช้ 50 μผมรัง 1 ปฏิกิริยาผสม ( gotaq PCR หลักของระบบ promega เมดิสัน , WI ) ภายใต้เงื่อนไขต่อไปนี้ : 5 ลิตร ( μแต่ละไพรเมอร์ 10 μ M ) , 125 μ M แต่ละ dntp 2 มม. MgCl2 และ DNA polymerase ของ gotaq 1 u .

รังนก 2 ปฏิกิริยาและเพิ่มเติมวิธีการ ( กับข้อยกเว้นของ 3 ขั้นตอนของ PCR ตรงรัง 1 ผลิตภัณฑ์ ) เป็นเหมือนมาตรฐาน - และโดยตรงด้วย PCR เทคนิคที่กล่าวถึงข้างต้น