4.6. Calibrated pipettes and multic

4.6. Calibrated pipettes and multichannel pipettes.
5. METHOD PREPARATION
5.1. NOTE: SUBSEQUENT PROCEDURES SHOULD BE PERFORMED IN A CLASS 2 BIOSAFETY LAMINAR FLOW HOOD USING STERILE TECHNIQUE AND ADHERING TO CDC/NIH STANDARDS (INCLUDING THE USE OF GLOVES AND LAB COATS).
5.2. Preparation of Culture Medium, Antigens/Mitogens, and Plates
5.3. Preparation of two types of media: RPMI-10% and RPMI-0.
5.4. RPMI -10%
5.5. RPMI 1640 containing L-glutamine and supplemented with 100U/mL penicillin, 100μg/mL streptomycin (Pen-Strep), and 10% heat inactivated human AB serum. HEPES buffer (10mM final) may also be added to the media.
5.6. RPMI -0
5.7. RPMI 1640 supplemented with Pen-Strep and L-glutamine only, NO SERUM.
5.8. Media is stored at 4oC. Media must be re-supplemented with 2mM L-glutamine if stored for more than 1 month.
5.9. Note: Some laboratories prefer to make RPMI containing 20% serum and 2X concentrations of Pen-Strep and L-glutamine. This media is used in the preparation of antigens and mitogens for the LPA plates that are stored frozen. PBMCs that are added to the plate are prepared in RPMI-0, resulting in a final concentration of 1X Pen-Strep, 1X L-glutamine, and 10% serum.
5.10. Preparation of antigen/mitogen working solutions:
5.11. Antigen/mitogen solutions can be prepared in RPMI-10% (or RPMI-20, see note above). For each antigen/mitogen in the assay, prepare a solution at twice (2X) the intended final concentration in the assay wells. Prepare sufficient volume in order to fill the requisite number of assay wells (number of assay wells x 100 μL/well = minimum volume to prepare).
5.12. Refer to the PIIS for the final concentration of antigen or mitogen. An example of how to prepare antigen dilutions is illustrated below:
5.13. The protocol calls for a final (1X) concentration of CASTA at 10ug/mLand of CMV antigen at a dilution of 1:10.
5.14. Determine how many plates you will need for the protocol (how many patients your site expects to enroll times the number of visits that call for an LPA to be done). Labs usually make up about 20 plates at a time.
5.15. Determine if quadruplicate or triplicate wells for each antigen will be run.
5.16. For this example, we will run quadruplicates. I want to set up about 23 plates. I will need 10mL of 2X the intended concentration (100uL/well x 4 wells x 23 = about 10mL). I need 10mL of 20ug/mL CASTA and 10mL of a 1:5 dilution of CMV for a 2X concentration.
5.17. The CASTA antigen from Greer Laboratories comes in a 400ug vial. I add 1mL of RPMI to the vial to give a concentration of 400ug/mL. I need 200ug total (10mL at

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

4.6 การสอบเทียบปิเปตและปิเปตหลายช่อง.
5 เตรียมวิธี
5.1 หมายเหตุ:. ขั้นตอนต่อมาควรจะดำเนินการในชั้น 2 เครื่องดูดควันความปลอดภัยทางชีวภาพไหลโดยใช้เทคนิคปลอดเชื้อและการยึดมั่นใน CDC / NIH มาตรฐาน (รวมถึงการใช้ห้องปฏิบัติการถุงมือและเสื้อโค้ต)
5.2 การเตรียมความพร้อมของกลางวัฒนธรรมแอนติเจน / mitogens และแผ่น
5.3 เตรียมความพร้อมของทั้งสองประเภทของสื่อ:.% RPMI-10 และ RPMI-0
5.4 RPMI -10%
5.5 RPMI 1640 ที่มี l glutamine และเสริมด้วย 100u/ml penicillin, streptomycin 100μg/ml (ปากกาอักเสบ) และความร้อนการใช้งาน 10% ของมนุษย์ AB ซีรั่ม HEPES บัฟเฟอร์ (10mm สุดท้าย) อาจจะเพิ่มไปยังสื่อ.
5.6 RPMI -0
5.7 RPMI 1640 เสริมด้วยปากกาอักเสบและ L-glutamine เท่านั้นไม่มีเซรุ่ม.
5.8 สื่อจะถูกเก็บไว้ที่ 4 องศาเซลเซียสสื่อจะต้อง re-2mm เสริมด้วย L-glutamine ถ้าเก็บไว้นานกว่า 1 เดือน.
5.9 หมายเหตุ: ห้องปฏิบัติการบางคนชอบที่จะทำให้ RPMI มีความเข้มข้นในซีรั่มและ 2x 20% ปากกาอักเสบและ L-glutamine สื่อนี้ถูกนำมาใช้ในการเตรียมแอนติเจนและ mitogens สำหรับแผ่น LPA ที่เก็บแช่แข็ง PBMCs ที่มีการเพิ่มแผ่นได้จัดทำขึ้นใน RPMI-0,ส่งผลให้ความเข้มข้นสุดท้ายของ 1x ปากกาอักเสบ, 1x L-glutamine และซีรั่ม 10%.
5.10 การเตรียมการของแอนติเจน / mitogen ทำงานแก้ปัญหา:
5.11 โซลูชั่นแอนติเจน / mitogen สามารถเตรียมใน% RPMI-10 (หรือ RPMI-20 ดูบันทึกด้านบน) สำหรับแอนติเจนแต่ละ / mitogen ในการทดสอบการเตรียมการแก้ปัญหาที่สองครั้ง (2x) ความเข้มข้นสุดท้ายที่ตั้งใจไว้ในการทดสอบหลุมเตรียมปริมาณเพียงพอในการสั่งซื้อเพื่อเติมเต็มจำนวนที่จำเป็นของหลุมทดสอบ (จำนวนทดสอบหลุม x 100 ไมโครลิตร / ดี = ปริมาณขั้นต่ำในการเตรียมความพร้อม).
5.12 อ้างถึง piis สำหรับความเข้มข้นสุดท้ายของแอนติเจนหรือ mitogen ตัวอย่างของวิธีการเตรียมความพร้อมเจือจางแอนติเจนเป็นที่แสดงด้านล่าง:
5.13โปรโตคอลเรียกร้องให้มีความเข้มข้น (1x) สุดท้ายของ Casta ที่ 10ug/mland แอนติเจนของเชื้อ CMV ที่เจือจาง 1:10.
5.14 กำหนดจำนวนแผ่นที่คุณจะต้องสำหรับโปรโตคอล (หลายวิธีที่ผู้ป่วยที่เว็บไซต์ของคุณคาดว่าจะลงทะเบียนเรียนจำนวนครั้งของการเข้าชมที่เรียกร้องให้ LPA ที่จะทำ) ห้องปฏิบัติการมักจะทำขึ้นประมาณ 20 แผ่นในเวลา.
5.15ตรวจสอบว่าหลุม quadruplicate หรือเพิ่มขึ้นสามเท่าสำหรับแอนติเจนแต่ละคนจะถูกเรียกใช้.
5.16 สำหรับตัวอย่างนี้เราจะทำงาน quadruplicates ฉันต้องการที่จะตั้งขึ้นประมาณ 23 แผ่น ฉันจะต้อง 10ml 2x ของความเข้มข้นที่ตั้งใจไว้ (100ul/well x 4 หลุม x 23 = ประมาณ 10ml) ฉันต้องการ 10ml จาก 20ug/ml Casta และ 10ml จาก 01:05 เจือจางของ CMV สำหรับความเข้มข้น 2x.
5.17แอนติเจน Casta greer จากห้องปฏิบัติการมาในขวด 400ug ฉันจะเพิ่ม 1ml ของ RPMI ที่ขวดเพื่อให้ความเข้มข้นของ 400ug/ml ฉันต้อง 200ug ทั้งหมด (10ml ที่

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

4.6 การปรับเทียบ pipettes และแบบ pipettes.
5 วิธีเตรียม
5.1 หมายเหตุ: ขั้นตอนต่อไปควรทำในคลาส 2 BIOSAFETY กระแส LAMINAR ฮูดใช้ใส่เทคนิค และยึดมั่นในมาตรฐาน CDC/NIH (รวมถึงการใช้ถุงมือและเสื้อ LAB) .
5.2 เตรียมสื่อวัฒนธรรม Antigens/Mitogens และแผ่น
5.3 เตรียมสื่อสองชนิด: RPMI - 10% และ RPMI 0.
5.4. RPMI -10%
5.5 1640 RPMI ประกอบด้วย L glutamine และเสริม ด้วยยาเพนนิซิลลิน 100U/mL ยกเลิกความร้อน streptomycin (ปากกา-Strep), และ 10% 100μg/mL เซรั่มมนุษย์ AB นอกจากนี้ยังสามารถเพิ่มบัฟเฟอร์ HEPES (10 มม.สุดท้าย) เพื่อสื่อ
5.6 RPMI-0
5.7 RPMI 1640 เสริม ด้วยปากกา-Strep และ L glutamine เท่านั้น ซีรั่มไม่
5.8 สื่อจัดเก็บที่ 4oC สื่อต้อง supplemented อีกครั้งกับ 2 มม. L glutamine ถ้าเก็บสำหรับมากกว่า 1 เดือน
5.9 หมายเหตุ: ห้องปฏิบัติการบางอย่างต้องการให้ประกอบด้วยเซรั่ม 20% และความเข้มข้น X 2 ปากกา-Strep และ L glutamine RPMI มีใช้สื่อนี้ในการเตรียม antigens และ mitogens LPA จะแผ่นที่เก็บแช่แข็ง PBMCs ที่เพิ่มลงในจานเตรียมไว้ใน RPMI-0 ในความเข้มข้นสุดท้าย 1 X ปากกา-Strep, 1 X L glutamine ก 10% ซีรั่ม
5.10 เตรียมแก้ปัญหางานตรวจ หา/mitogen:
5.11 วิธีตรวจ หา/mitogen สามารถเตรียม RPMI - 10% (หรือ RPMI-20 ดูหมายเหตุข้างต้น) สำหรับแต่ละตรวจ หา/mitogen ในการทดสอบ เตรียมการแก้ไขปัญหาที่สอง (2 X) ความเข้มข้นสุดท้ายตั้งใจในบ่อวิเคราะห์ เตรียมปริมาณที่เพียงพอเพื่อกรอกข้อมูลจำนวนบ่อทดสอบจำเป็น (จำนวนทดสอบ wells x 100 μL/ดี =ปริมาณต่ำสุดเพื่อเตรียมความพร้อม) .
5.12 ถึง PIIS สำหรับความเข้มข้นสุดท้ายของการตรวจหาหรือ mitogen ตัวอย่างของวิธีการตรวจหา dilutions เตรียมจะแสดงด้านล่าง:
5.13 เรียกโพรโทคอลสำหรับเข้มข้นสุดท้าย (1 X) ของ CASTA ที่ 10ug/mLand ของตรวจหา CMV ที่เจือจางของ 1:10.
5.14 กำหนดจำนวนแผ่นที่คุณจะต้องสำหรับโพรโทคอล (จำนวนผู้ป่วยที่ไซต์ของคุณคาดว่าจะลงทะเบียนเรียนเท่าจำนวนการเข้าชมที่โทรสำหรับการ LPA จะทำ) แล็บจะแต่งประมาณ 20 แผ่นในเวลา
5.15 กำหนดบ่อ quadruplicate หรือ triplicate สำหรับตรวจหาละจะทำ
ชี สำหรับตัวอย่างนี้ เราจะทำ quadruplicates ฉันต้องการตั้งค่าเกี่ยวกับ 23 แผ่น จะ 10mL 2 X ความเข้มข้นวัตถุประสงค์ (บ่อดี 100uL x 4 x 23 =ประมาณ 10mL) ต้อง 10mL ของมล 20ug CASTA และ 10mL ของเจือจาง 1:5 ของ CMV ในตัว 2 X ความเข้มข้น
5.17 ตรวจหา CASTA จากอินน์เอ็กซ์เพลสห้องปฏิบัติมาในคอนแทค 400ug ฉันเพิ่ม 1mL ของ RPMI คอนแทคให้ความเข้มข้นของ 400ug/mL ต้อง 200ug รวม (10mL ที่

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

4.6 . ปรับแต่งและเสียงแบบหลายช่องสัญญาณ pipettes pipettes .
5 วิธีการในการเตรียม
5.1 . หมายเหตุ:ในครั้งต่อไปตามขั้นตอนจะต้องดำเนินการในระดับ 2 เพื่อที่จะเป็นแผ่นการไหลของ Hood :การใช้ขวดนมปราศจากเชื้อได้เทคนิคและยึดมั่นใน CDC / the NIH มาตรฐาน(รวมถึงการใช้ถุงมือและห้องปฏิบัติการ,เสื้อโค้ท)..
5.2 . การเตรียมการของวัฒนธรรมขนาดกลาง antigens / mitogens และแผ่นความร้อน
5.3 . การเตรียมการของทั้งสอง ประเภท ของสื่อ rpmi 10% และ rpmi - 0 .
5.4 . rpmi 10%
5.5 . rpmi 1640 ประกอบด้วย L - glutamine และเสริมด้วย 100 U /อย่างไรสืบเนื่องมล. 100 ไมโครกรัม/ ML ยาซทเรพโทะไม - ซิน( pen-strep )และ 10% ความร้อนป้อมปราการของมนุษย์ AB เจลมาสก์มอยเจอร์ไรเซอร์. บัฟเฟอร์ hepes ( 10 สุดท้ายม.ม.)อาจจะมีการเพิ่มในมีเดีย.
5.6 ยัง rpmi - 0 ;
5.7 . rpmi 1640 และเสริมด้วย pen-strep และ L - glutamine เท่านั้นไม่มีเจลมาสก์มอยเจอร์ไรเซอร์.
5.8 สื่อจัดเก็บอยู่ที่ 4 ° Cสื่อต้องได้อีกครั้งและเสริมด้วย 2 มม. L - glutamine หากจัดเก็บไว้สำหรับมากกว่า 1 เดือน.
5.9 โปรดบันทึกไว้ด้วยว่า:ห้องปฏิบัติการบางคนชอบทำให้ rpmi ประกอบด้วย 2 x ความเข้มข้นและเจลมาสก์มอยเจอร์ไรเซอร์ 20% ของ pen-strep และ L - glutamine . สื่อนี้จะใช้ในการเตรียมการของ mitogens และ antigens lpa สำหรับแผ่นความร้อนที่จะถูกจัดเก็บไว้แช่แข็ง pbmcs ที่จะถูกเพิ่มลงในแผ่นที่ได้รับการจัดเตรียมใน rpmi - 0ส่งผลให้ในการทำสมาธิขั้นสุดท้ายของ 1 x pen-strep 1 x L - glutamine และ 10% เจลมาสก์มอยเจอร์ไรเซอร์.
5.10 การเตรียมการของ, Antigen for / mitogen โซลูชันการทำงาน:
5.11 . โซลูชัน mitogen , Antigen for /สามารถเตรียมใน rpmi 10% (หรือ rpmi - 20 ดูที่หมายเหตุด้านบน) สำหรับ mitogen , Antigen for /แต่ละเครื่องในพยายามที่จะเตรียมโซลูชันที่สองครั้ง( 2 x )สุดท้ายไว้ในบ่อที่สอบเตรียมความพร้อมระดับเสียงอย่างเพียงพอในการเติมน้ำลงในจำนวนที่กำหนดไว้ในบ่อสอบ(หมายเลขของระดับเสียง μl /ดี=ต่ำสุดสอบบ่อ x 100 เพื่อเตรียม)..
5.12 นิ้ว โปรดดูที่สำหรับ piis สมาธิสุดท้ายของ mitogen หรือ Antigen ตัวอย่างของการเตรียมความพร้อม dilutions , Antigen for คือ ภาพ ประกอบด้านล่างนี้:
5.13โปรโตคอลการโทรสำหรับรอบชิงชนะเลิศ( 1 x )ของ casta ที่ 10 mland UG /ของ, Antigen for cmv ที่เจือจาง 1 : 10 .
5.14 ตรวจสอบว่าจำนวนมากแผ่นความร้อนคุณจะต้องใช้สำหรับโปรโตคอล(จำนวนผู้ป่วยคาดว่าไซต์ของคุณเพื่อทำการลงทะเบียนครั้งที่จำนวนของการเที่ยวชมว่ามีสายเรียกเข้าสำหรับ lpa ที่จะทำได้) โดยปกติแล้วทำให้ห้องปฏิบัติการประมาณ 20 แผ่นทำความร้อนในช่วงเวลา.
5.15 Aตรวจสอบว่าน้ำบ่อเป็นสามหรือสี่สำหรับ, Antigen for แต่ละครั้งจะเรียก.
5.16 สำหรับตัวอย่างนี้เราจะเรียกใช้ quadruplicates ฉันต้องการตั้งค่าเกี่ยวกับ 23 แผ่นทำความร้อน ฉันจะต้องใช้ 10 มล. 2 x ความเข้มข้นที่ต้องการ(มล.เอช. x 23 =เกี่ยวกับ 10100 UL /รวมทั้ง x 4 ) ฉันจำเป็นต้อง 10 มล. casta 20 UG /มล.และ 10 มล. 1 : 5 เจือจางของ cmv สำหรับ 2 x ความเข้มข้น.
5.17 AAntigen casta จากห้องปฏิบัติการเท่านั้น Matt Greer ผู้บริหารระดับสูงมาใน 400 ขวด UG ฉันจะเพิ่ม 1 มล.ของ rpmi ในขวดที่จะทำให้สมาธิของ 400 UG / ml . ฉันจำเป็นต้องมล. 200 UG ( 10 ที่