construct contained an antisense fr

construct contained an antisense fragment of cDNA for either
SGT1, SGT2 or SGT3, driven by the tuber-specific granule bound
starch synthase (GBSS6) promoter (van der Steege, Nieboer,
Swaving, & Templaar, 1992) and the neomycin phosphotransferase
II (nptII) marker gene. Cloning of the SGT1, SGT2 and SGT3 cDNA,
and binary plasmid assembly of the constructs used here has been
previously reported (McCue et al., 2005, 2006, 2007, respectively).
For each construct Agrobacterium-mediated transformation
(Gustafson et al., 2006) was used to generate putative transgenic
lines, selected by growth on kanamycin. Transgenesis was
confirmed by PCR (data not shown). Transgenic (a.–c.) and control
lines (d.–f.) used in this study included:
(a) SGT1 – sgt9-2 and sgt14-10.
(b) SGT2 – sgt2-11, sgt2-17 and sgt2-18.
(c) SGT3 – sgt3-05 and sgt3-23.
(d) Wild-type (WT) tubers.
(e) Tubers generated from non-transgenic plants produced via
tissue culture (TC), which included a callus phase.
(f) Transgenic tubers transformed with an ‘‘empty vector’’
construct – vector pBINPLUS–ARS containing the nptII gene
but no other target gene (BIN+8-2 and BIN+14-3).
It is well known that tissue culture can give rise to somaclonal
variation (Davies, 2002), a possible source of unintended effects
independent of Agrobacterium-mediated gene transfer. Empty
vector and tissue culture lines developed and grown alongside
GM lines with targeted trait modifications represent important
controls for vegetatively propagated plants where a comparison
between matched homozygous and azygous plants is not possible.
Tubers of cv. Desirée were developed from tissue-culturederived
plants and then re-propagated in the glasshouse through
two generations alongside the WT tubers (standard seed potatoes)
to minimise any impact of environmental variables on subsequent
plant performance.
Plants for experimental studies were grown in a single year
from tubers under containment (using TYGAN™ netting) in
30-cm diameter pots containing UC (University of California)
compost and watered with automatic irrigation. For each independent
line (transgenic or control line), two seed tubers were planted
in a completely randomised design. Each resulting plant (and its
combined tubers) is hereafter referred to as a biological replicate.
2.3. Sampling of tubers for comparative metabolite profiling
Plants were harvested after natural senescence, all the tubers
from a single plant combined to give one biological replicate, and
stored for two weeks in the dark at room temperature to facilitate
skin set. Thereafter, a sub-sample of tubers (usually four-five average-sized
tubers) was set aside to a combined fresh weight of ca.
800 g. For each biological replicate set of tubers from a pot, to minimise
the impact of metabolite gradients within these large tubers,
two opposite eighths were removed from each tuber, combined
and frozen in liquid nitrogen. The opposite eighths strategy
(Griffiths & Dale, 2001) has generally been used within our laboratories.
Individual tubers are transected into eight segments, and of
these two diametrically opposed segments are taken to provide a
representative sample of the metabolite levels in the whole tuber.
Frozen tissues were freeze-dried for one week prior to milling
using a Retsch mill (Tecator Udy) with a 1-mm sieve. Milled
freeze-dried potato powders were stored in re-sealable bags at
20 C (in the dark) until required for analysis. Metabolomic analyses
have shown that storage in this way has no impact on
metabolite profiles for at least three months (Shepherd et al.,
2007).

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

โครงสร้างส่วนการ antisense ของ cDNA ที่มีอยู่อย่างใดอย่างSGT1, SGT2 หรือ SGT3 ขับเคลื่อน ด้วยเม็ดเฉพาะหัวที่ผูกไว้โปรโมเตอร์ synthase (GBSS6) แป้ง (van der Steege, NieboerSwaving, & Templaar, 1992) และ phosphotransferase นีโอมัยซินยีนเครื่องหมาย II (nptII) โคลน cDNA SGT1, SGT2 และ SGT3ไบนารี plasmid ประกอบของโครงสร้างที่ใช้ที่นี่ได้รายงาน (McCue et al. 2005, 2006, 2007 ตามลำดับ)สำหรับโครงสร้างแต่ละการแปลงสื่ออโกรแบคทีเรียม(Gustafson et al. 2006) ถูกใช้เพื่อสร้าง putative จำลองบรรทัด เลือก โดยเติบโตในกานามัยซิน แก้ไข Transgenesisยืนยัน โดย PCR (ไม่แสดงข้อมูล) จำลอง (ก. – ค.) และการควบคุมเส้น (d. – f.) ใช้ในการศึกษานี้รวม:(ก) SGT1-sgt9-2 และ sgt14-10(ข) SGT2-sgt2-11, sgt2-17 และ sgt2 18(ค) SGT3-sgt3-05 และ sgt3-23(d) มุดแบบธรรมชาติ (WT)(จ) มุดจากพืชไม่ใช่จำลองผลิตผ่านเนื้อเยื่อ (TC), ซึ่งรวมขั้นตอนการแคลลัส(ฉ) จำลองมุดเปลี่ยน ด้วยการ ''เวกเตอร์ว่าง ''สร้าง – pBINPLUS เวกเตอร์ – ที่ประกอบด้วยยีน nptII ARSแต่ไม่อื่น ๆ เป้าหมายยีน (ช่อง 8-2 และช่อง + 14-3)มันเป็นที่รู้จักกันดีว่าเยื่อสามารถก่อให้ somaclonalเปลี่ยนแปลง (เดวีส์ 2002), แหล่งเป็นไปได้ของผลกระทบที่ไม่ตั้งใจอิสระของการถ่ายโอนยีนอโกรแบคทีเรียมสื่อ ว่างเปล่าเวกเตอร์และเนื้อเยื่อสายพัฒนา และเติบโตควบคู่ไปกับบรรทัดที่ GM มีการปรับเปลี่ยนลักษณะเป้าหมายเป็นสำคัญตัวควบคุมสำหรับแพร่กระจายพืช vegetatively การเปรียบเทียบระหว่างพืช azygous และ homozygous ตรงกันไม่ได้หัวของพันธุ์ Desirée ได้รับการพัฒนาจากเนื้อเยื่อ-culturederivedพืชแล้ว การแพร่กระจายในเรือนกระจกสำหรับปลูกต้นไม้ผ่านรุ่นสองพร้อมกับมุด WT (มาตรฐานเมล็ดพันธุ์มันฝรั่ง)เพื่อลดผลกระทบต่อสิ่งแวดล้อมตัวแปรในคราวต่อไปประสิทธิภาพการทำงานโรงงานพืชสำหรับการศึกษาทดลองที่ปลูกในปีเดียวจากมุดใต้บรรจุ (ใช้ตาข่าย TYGAN™) ในเส้นผ่าศูนย์กลาง 30 ซมกระถางประกอบด้วย UC (มหาวิทยาลัยแคลิฟอร์เนีย)ปุ๋ยหมัก และรดน้ำ ด้วยการชลประทานอัตโนมัติ สำหรับอิสระแต่ละบรรทัด (จำลอง หรือควบคุมบรรทัด), สองมุดเมล็ดปลูกไว้ในการออกแบบสุ่มอย่างสมบูรณ์ แต่ละพืชผล (และการรวมมุด) ต่อจากนี้เรียกว่าการจำลองแบบทางชีววิทยา2.3. การสุ่มตัวอย่างของมุดสำหรับโปรไฟล์ metabolite ที่เปรียบเทียบพืชเก็บเกี่ยวจากธรรมชาติชราภาพ มุดทั้งหมดจากพืชเดี่ยวรวมให้จำลองแบบชีวภาพหนึ่ง และเก็บไว้ในมืดที่อุณหภูมิห้องเพื่ออำนวยความสะดวกผิวชุด หลังจากนั้น ตัวอย่างย่อยของมุด (ปกติ 4 5 ขนาดค่าเฉลี่ยมุด) ถูกตั้งค่าไว้ให้มีน้ำหนักสดรวมของ ca800 กรัม สำหรับแต่ละชีวภาพทำซ้ำชุดมุดจากหม้อ เพื่อลดผลกระทบของการไล่ระดับสี metabolite ภายในเหล่านี้หัวใหญ่ตรงข้ามสอง eighths ถูกลบออกจากแต่ละหัว รวมและแช่แข็งในไนโตรเจนเหลว กลยุทธ์ eighths ตรงข้าม(Griffiths & Dale, 2001) โดยทั่วไปมีการใช้ภายในห้องปฏิบัติการของเราละมุดมี transected เป็นแปดส่วน และของกลุ่มโดยเชียรสองเหล่านี้ถูกนำไปให้อย่างตัวแทนของระดับ metabolite ในหัวทั้งหมดมีเนื้อเยื่อแช่แข็งแห้งหนึ่งสัปดาห์ก่อนกัดใช้ในโรงงาน Retsch (Tecator Udy) มีตะแกรง 1 มม. แป้งผงมันฝรั่งแห้งถูกเก็บไว้ในถุงผนึกที่20 C (ในมืด) จนกว่าจะจำเป็นสำหรับการวิเคราะห์ Metabolomic วิเคราะห์แสดงให้เห็นว่า เก็บข้อมูลในลักษณะนี้ไม่ส่งผลในโพรไฟล์ metabolite อย่างน้อยสามเดือน (Shepherd et al.,2007)

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

สร้างบรรจุชิ้นส่วน antisense ของยีนทั้ง
SGT1, SGT2 หรือ SGT3 โดยได้แรงหนุนหัวเฉพาะเม็ดผูกพัน
แป้งเทส (GBSS6) ผู้ก่อการ (แวนเดอร์ STEEGE, Nieboer,
Swaving และ Templaar, 1992) และ phosphotransferase neomycin
ii (nptII ) ยีนเครื่องหมาย โคลนของ SGT1, SGT2 และ SGT3 cDNA,
และการชุมนุมของพลาสมิดไบนารีโครงสร้างที่ใช้ที่นี่ได้รับการ
รายงานก่อนหน้านี้ (McCue et al., 2005 ปี 2006 ปี 2007 ตามลำดับ).
สำหรับแต่ละสร้างเชื้อ Agrobacterium
(กุสตาฟ, et al 2006) ถูกนำมาใช้ในการสร้างยีนสมมุติ
เส้นที่เลือกโดยการเจริญเติบโตในกานามัยซิ transgenesis ได้รับการ
ยืนยันโดยวิธี PCR (ไม่ได้แสดงข้อมูล) ดัดแปรพันธุกรรม ( a.-c. ) และการควบคุม
สาย ( d.-f. ) ที่ใช้ในการศึกษาครั้งนี้รวมถึง:
(A). SGT1 - sgt9-2 และ sgt14-10
(ข) SGT2 - sgt2-11, sgt2-17 และ . sgt2-18
(c) SGT3 - sgt3-05 และ sgt3-23.
(D) ป่าชนิด (WT) หัว.
(E) หัวที่เกิดจากพืชที่ไม่ใช่ยีนที่ผลิตผ่าน
การเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อ (TC) ซึ่งรวมถึงแคลลัส เฟส.
(ฉ) หัวพันธุ์กลายที่มี '' เวกเตอร์ที่ว่างเปล่า ''
สร้าง - เวกเตอร์ pBINPLUS-ARS ที่มียีน nptII
. แต่ไม่มียีนเป้าหมายอื่น ๆ (+ ถัง 8-2 ถังขยะ + 14-3)
เป็นที่รู้จักกันดีว่า การเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อสามารถก่อให้เกิดเซลล์ร่างกาย
เปลี่ยนแปลง (เดวีส์, 2002) ซึ่งเป็นแหล่งที่มาของผลกระทบที่ไม่ได้ตั้งใจ
เป็นอิสระจากการถ่ายโอนยีน Agrobacterium พึ่ง ที่ว่างเปล่า
เวกเตอร์และการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อสายพัฒนาและเติบโตไปพร้อมกับ
สายจีเอ็มมีการปรับเปลี่ยนลักษณะการกำหนดเป้าหมายที่สำคัญแทน
การควบคุมสำหรับพืชแพร่กระจาย vegetatively ที่เปรียบเทียบ
ระหว่างพืชและ homozygous azygous จับคู่เป็นไปไม่ได้.
หัวพันธุ์ Desiréeได้รับการพัฒนาจากเนื้อเยื่อ culturederived
พืชและ re-แพร่กระจายในเรือนกระจกผ่าน
สองรุ่นข้างหัว WT (มันฝรั่งเมล็ดมาตรฐาน)
เพื่อลดผลกระทบใด ๆ ของตัวแปรสิ่งแวดล้อมตามมา
ผลการดำเนินงานโรงงาน.
พืชสำหรับการศึกษาทดลองปลูกในปีเดียว
จากหัวภายใต้การกักกัน (ใช้ TYGAN ™ตาข่าย) ใน
30 ซม. กระถางขนาดเส้นผ่าศูนย์กลางที่มี UC (มหาวิทยาลัยแคลิฟอร์เนีย)
ปุ๋ยหมักและรดน้ำด้วยน้ำแบบอัตโนมัติ สำหรับแต่ละอิสระ
เส้น (ดัดแปรพันธุกรรมหรือการควบคุมสาย) สองหัวเมล็ดพันธุ์ถูกนำมาปลูก
ในแบบสุ่มสมบูรณ์ แต่ละโรงงานที่เกิด (และ
หัวรวม) จะเรียกต่อจากนี้จะเป็นซ้ำทางชีวภาพ.
2.3 ตัวอย่างของหัวสำหรับการเปรียบเทียบ metabolite profiling
พืชเก็บเกี่ยวหลังจากการเสื่อมสภาพของธรรมชาติหัวทั้งหมด
จากโรงงานเดียวรวมกันเพื่อให้หนึ่งซ้ำชีวภาพและ
เก็บไว้เป็นเวลาสองสัปดาห์ในที่มืดที่อุณหภูมิห้องเพื่ออำนวยความสะดวก
ชุดผิว หลังจากนั้นตัวอย่างย่อยของหัว (ปกติ 4-5 ขนาดเฉลี่ย
หัว) ตั้งอยู่ข้าง ๆ กับน้ำหนักสดรวมของแคลิฟอร์เนีย
800 กรัม สำหรับแต่ละซ้ำชีวภาพชุดหัวจากหม้อเพื่อลด
ผลกระทบของการไล่ระดับสี metabolite ภายในหัวขนาดใหญ่เหล่านี้
2/8 ตรงข้ามถูกถอดออกจากกันหัวรวม
และแช่แข็งในไนโตรเจนเหลว eighths ตรงข้ามกลยุทธ์
(Griffiths & เดล, 2001) ได้รับการทั่วไปที่ใช้ภายในห้องปฏิบัติการของเรา.
หัวส่วนบุคคลจะถูก transected เป็นแปดส่วนและ
ทั้งสองกลุ่มขัดจะถูกนำไปให้เป็น
ตัวอย่างที่เป็นตัวแทนของระดับสารในหัวทั้งหมด
เนื้อเยื่อถูกแช่แข็งแห้งเป็นเวลาหนึ่งสัปดาห์ก่อนที่จะกัด
โดยใช้ Retsch โรงงาน (Tecator Udy) กับ 1 มมตะแกรง แป้ง
แห้งผงมันฝรั่งถูกเก็บไว้ในถุงอีก sealable ที่
20 C (ในที่มืด) จนกว่าที่จำเป็นสำหรับการวิเคราะห์ วิเคราะห์ metabolomic
ได้แสดงให้เห็นว่าการจัดเก็บข้อมูลในลักษณะนี้ไม่มีผลกระทบต่อ
โปรไฟล์ metabolite เวลาอย่างน้อยสามเดือน (ต้อน et al.,
2007)

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

สร้างที่มีส่วนของยีน antisense สำหรับทั้งsgt1 sgt2 , หรือ sgt3 ขับเคลื่อน โดยเฉพาะเม็ดผูกหัวและแป้ง ( gbss6 ) โปรโมเตอร์ ( ฟาน เดอร์ steege nieboer , ,swaving & templaar , 1992 ) และนีโอมัยซิน phosphotransferase2 ( nptii ) ยีนเครื่องหมาย การโคลนชิ้น cDNA sgt1 sgt2 sgt3 , และ ,ไบนารีของพลาสมิดและประกอบโครงสร้างที่ใช้ที่นี่ได้รายงานก่อนหน้านี้ ( แมคคิว et al . , 2005 , 2006 , 2007 , ตามลำดับ )แต่ละระดับการสร้างอะโกรแบคทีเรียม( กุสตาฟ et al . , 2006 ) ถูกใช้เพื่อสร้างการแสดงออกยีนบรรทัด , เลือกโดยการเจริญเติบโตในทั้งสอง transgenesis คือการยืนยันโดยวิธี PCR ( ข้อมูลไม่แสดง ) พันธุกรรม ( A ( C ) และการควบคุมเส้น ( D ) F . ) ที่ใช้ในการศึกษาครั้งนี้ ได้แก่( A ) และ sgt1 – sgt9-2 sgt14-10 .( ข ) sgt2 – sgt2-11 sgt2-17 sgt2-18 , และ .( C ) และ sgt3 – sgt3-05 sgt3-23 .( D ) ป่าประเภท ( WT ) หัว( E ) หัวที่เกิดจากต้นพืชที่ไม่ใช่ที่ผลิตผ่านทางการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อ ( TC ) ซึ่งประกอบด้วย แคลลัส เฟส( F ) และยีนเปลี่ยนด้วย " "empty เวกเตอร์ " "สร้างเวกเตอร์– pbinplus – Ars ที่มี nptii ยีนแต่ไม่มีเป้าหมายอย่างอื่นของยีน ( บิน + 8-2 และถังขยะ + 14-3 )มันเป็นที่รู้จักกันดีว่าเนื้อเยื่อสามารถก่อให้เกิด :การเปลี่ยนแปลง ( Davies , 2002 ) , เป็นแหล่งที่เป็นไปได้ของผลกระทบที่ไม่ได้ตั้งใจอิสระของ Agrobacterium โดยถ่ายโอนยีน ว่างเปล่าเวกเตอร์เส้นและพัฒนาและเติบโตควบคู่ไปกับการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อเส้นที่มีลักษณะการเป็นตัวแทนของ ( gmt ) เป้าหมายสำคัญการควบคุม vegetatively ขยายพันธุ์พืชที่เปรียบเทียบระหว่างการจับและพืช ส่วน azygous เป็นไปไม่ได้และพันธุ์ desir é e ถูกพัฒนามาจากเนื้อเยื่อ culturederivedพืชและจากนั้นอีกครั้งในเรือนกระจกผ่านไปสองรุ่นกับ WT หัว ( มันฝรั่งเมล็ดพันธุ์มาตรฐานเพื่อลดผลกระทบของตัวแปรสิ่งแวดล้อมตามมาประสิทธิภาพของพืชพืชสำหรับการศึกษาทดลองปลูกในปีเดียวจากหัวภายใต้การควบคุม ( ใช้ tygan ™ตาข่าย )30 ซม. หม้อที่มี UC ( University of California )ปุ๋ยหมักและน้ำชลประทานแบบอัตโนมัติ สำหรับแต่ละอิสระบรรทัด ( บรรทัดหรือยีนควบคุมเมล็ดสองหัวที่ปลูก )ในทั้งหมดที่สามารถออกแบบ แต่ละผลพืช ( และของรวมหัว ) ภายหลังเรียกว่าชีววิทยาสืบพันธุ์2.3 ตัวอย่างของหัวเพื่อเปรียบเทียบระดับโปรไฟล์พืชเก็บเกี่ยวหลังจากการธรรมชาติ , หัวทั้งหมดจากต้นเดียวรวมกันเพื่อให้หนึ่งทางชีวภาพและลอกเลียนแบบเก็บได้นาน 2 สัปดาห์ในที่มืดอุณหภูมิห้องเพื่ออำนวยความสะดวกชุดผิว หลังจากนั้น ย่อยตัวอย่างของหัว ( ขนาดเฉลี่ยปกติ สี่ ห้าเกิด ) คือเมินเฉยกับน้ำหนักรวมของ CA800 กรัม สำหรับแต่ละชีวภาพเลียนแบบชุดของหัวจากหม้อ จำกัดผลกระทบของระดับการไล่สีภายในหัวขนาดใหญ่เหล่านี้สองฝั่งหนึ่งในแปดถูกถอดออกจากแต่ละหัว รวมและแช่แข็งในไนโตรเจนเหลว กลยุทธ์หนึ่งในแปด ตรงข้าม( กริฟฟิ & เดล , 2001 ) ได้โดยทั่วไปจะถูกใช้ภายในห้องปฏิบัติการของเราหัวคน transected เป็นแปดส่วน และของสองคนนี้ตรงข้ามกัน ส่วนจะถ่ายให้ตัวอย่าง ตัวแทนของระดับอุณหภูมิในหัวทั้งหมดเนื้อเยื่อถูกแช่แข็งแห้งสำหรับหนึ่งสัปดาห์ก่อนที่จะกัดใช้ retsch โรงสี ( tecator ยูดี่ ) กับ 1-mm ตะแกรง )มันฝรั่งผงแห้ง เก็บไว้ในถุงอีกครั้ง sealable ที่20 C ( ในที่มืด ) จนต้องวิเคราะห์ การวิเคราะห์ metabolomicแสดงให้เห็นว่ามีการจัดเก็บในลักษณะนี้ไม่มีผลกระทบต่อเพียงโปรไฟล์อย่างน้อยสามเดือน ( เชพ et al . ,2007 )