6. 1 Effect of ซีโอซิน on Euglena W

6. 1 Effect of ซีโอซิน on Euglena Wild Strain in KH Medium at pH
of 6.8
6. 1. 1 Minimum Inhibitory Concentration of ซีโอซิน for Euglena.
พัพัดั้งเดิม
The minimum inhibitory concentration of ซีโอซิน for the
Euglena wild strain in a medium at a pH of 6.8 was examined. The results reveal that in a liquid medium, the growth can be
completely inhibited at 50 µg/ml, whereas in a plate medium, the
growth can be nearly inhibited at 25 [Ig/ml. The growth inhibition
was observed even when the number of cells at the start of
culture was relatively large (2.0x106 cells/ml in a liquid medium,
2.0x106 cells/plate in a plate medium). In a medium containing 100
µg/ml of ซีโอซิน, the growth of the Euglena พัพัดั้งเดิม was almost
completely inhibited, whether in a liquid medium (รูป 5) or a
plate medium (รูป 6)
[0092]
รูป 7 shows the difference in the growth of the
Euglena wild strain in a KH medium at each pH
[0093]
6. 1. 2 Sensitivity of Euglena Wild Strain to Various Drugs







The influence of ซีโฟแทกซีม, which is used to remove
อะโกรแบคทีเรียม, on the growth of Euglena in การทรานสฟอร์ม by the อะโกรแบคทีเรียม method was examined. The results reveal that
ซีโฟแทกซีม had no influence on the growth of the Euglena wild
strain to at least 500 .tg/ml (รูป 8) . Thus, a selective medium
containing ซีโฟแทกซีม was used.
[0094]
G418 and ไฮโกรไมซิน inhibited the growth of the Euglena
พัพัดั้งเดิม as the concentrations increased (Figs. 9 and 10)
This suggests the possibility that these drugs, in addition to
ซีโอซิน, can be used as selection markers of the Euglena
ทรานสฟอร์แมนต์.
[0095]
6. 1. 3 Consideration of สภาวะ for การเพเพร่วม
การเพเพร่วม was performed by the method described in
Section 5.3. The liquid media used for การเพเพร่วม were a KH medium and an IM medium. An IM medium is frequently used when การทรานสฟอร์ม by the อะโกรแบคทีเรียม method is performed. The
media used in the present experiment had a pH of 5.3, contained
อะซีโตไซริงโกน, which is an inducer of vir genes, at a

concentration of 100 11M, and contained glucose, which is an
inducing factor, at a concentration of 10 mM. The results of co-
culturing using these media reveal that better growth of the
Euglena ทรานสฟอร์แมนต์ on a selective medium was observed when the 25 IM medium was used. A comparison of the system using exogenous
pCMV as an introduced gene โปรโมเตอร์ and the system using
endogenous pNOR as an introduced gene โปรโมเตอร์ reveals that better growth tended to be shown in the system using pNOR. [0096]
6. 1. 4 Consideration of Selective Medium สภาวะ
After the completion of การเพเพร่วม, the culture
solution was washed with ซีโฟแทกซีม (ซีโฟแทกซีม sodium, 500

11g/ml) . In a selective medium, the ซีโอซิน concentration was set
to 25 lag/ml, and the ซีโฟแทกซีม concentration was set to 100
ijg/mi. The ทรานสฟอร์แมนต์ was effectively obtained by increasing






the ซีโอซิน concentration in a stepwise manner in isolation of the ทรานสฟอร์แมนต์.
[0097]
6. 2 Drug Resistance of Euglena ทรานสฟอร์แมนต์
The drug resistance of the isolated Euglena
ทรานสฟอร์แมนต์ was observed. The Euglena ทรานสฟอร์แมนต์ was cultured in a KH medium and a selective liquid medium (each with pH of
6.8) . The results reveal that the ทรานสฟอร์แมนต์ cells showed
relatively good growth; however, there was a large difference
from the growth in the สภาวะ in which no drug was contained
รูป 11) . In view of the results in Section 6.1.1, it is believed
that almost no cells, except for the ทรานสฟอร์แมนต์, grow in the
selective liquid medium at a pH of 6.8. Accordingly, the
isolation of the ทรานสฟอร์แมนต์ with the drug is considered to have 15 been sufficient. More specifically, this suggests the possibility
that the cause of insufficient drug resistance that the
ทรานสฟอร์แมนต์ showed is not imperfect isolation of the cell line.
One of the causes for the insufficient drug resistance is a
problem of the expression amount of the introduced gene. There is 20 the possibility that a sufficient expression amount was not
obtained with the โปรโมเตอร์s used in this experiment. Additionally,
in the อะโกรแบคทีเรียม method, although an introduced gene is
inserted into the genome, the site is random. Since the
expression amount of an introduced gene tends to depend on the
site into which the introduced gene is inserted, there is the
possibility that, depending on the site of insertion, the
expression will not reach a sufficient level.
[0098]
6. 3 Detection of Introduced Gene from Euglena ทรานสฟอร์แมนต์
Analysis by PCR was performed using the total DNA
extracted from the Euglena ทรานสฟอร์แมนต์ as a template. The
fragment corresponding to the ซีโอซิน resistance gene region was
successfully amplified (รูป 12)
[0099]
6. 4 Analysis of Transcription Product Derived from Introduced








Gene
cDNA was synthesized using the total RNA extracted from
the Euglena ทรานสฟอร์แมนต์ as a template. Detection of the ซีโอซิน resistance gene was attempted using the cDNA as a template. The
fragment corresponding to this was obtained (รูป 13)
[0100]
6. 5 Stability of Introduced Gene
Passaging of the ทรานสฟอร์แมนต์ was continued under
ซีโอซิน-free สภาวะ, and the resulting ทรานสฟอร์แมนต์ was
subcultured again in a ซีโอซิน-containing medium. A comparison of
growth between these two reveals that sufficient growth was confirmed in both cases (รูป 14) . This indicates that drug resistance is sufficiently maintained even if culture is
performed in the absence of the drug for a period of time.
Additionally, a comparison of the number of divisions from the
start of culture shows little difference between the two. Thus, the trait acquired by การทรานสฟอร์ม is considered to be stably
maintained (รูป 15)
[0101]
7. Selection and Analysis of ทรานสฟอร์แมนต์ by Using 0418
An experiment was performed introducing a neomycin
resistance gene, which is responsible for 0418 resistance. The
neomycin resistance gene used is shown in SEQ ID NO: 7. The
experiment was performed in the same manner as in the selection
for ซีโอซิน. The experiment was performed at a 0418 concentration

of 10 ig/ml. As shown in Figs. 16 and 17, DNA and transcription
product of the neomycin resistance gene were detected from the obtained G418-resistant ทรานสฟอร์แมนต์.
[0102]
8. Selection and Analysis of ทรานสฟอร์แมนต์ by Using ไฮโกรไมซิน
An experiment was performed introducing a ไฮโกรไมซิน
resistance gene. The ไฮโกรไมซิน resistance gene used is shown in
SEQ ID NO: 8. The experiment was performed in the same manner as
in the selection for ซีโอซิน. The experiment was performed at a
ไฮโกรไมซิน concentration of 10 mg/ml. As shown in Figs. 18 and 19,






-27-

DNA and transcription product of the ไฮโกรไมซิน resistance gene
were detected from the obtained ไฮโกรไมซิน-resistant ทรานสฟอร์แมนต์.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

6. ผล 1 ของซีโอซินยูกลีนาต้องใช้ป่าใน KH ที่ pHของ 6.8 6. 1 1 ต่ำสุดลิปกลอสไขความเข้มข้นของซีโอซินสำหรับยูกลีนาพัพัดั้งเดิมความเข้มข้นลิปกลอสไขต่ำสุดของซีโอซินสำหรับการสายพันธุ์ป่ายูกลีนาในสื่อที่ pH 6.8 ถูกตรวจสอบ ผลการเปิดเผยว่า ในกลางของเหลว การเจริญเติบโตได้ ทั้งหมดห้ามที่ไมโครกรัมเป็นเครื่อง 50/ml ในขณะที่ในสื่อแผ่น การเจริญเติบโตสามารถเป็นห้ามเกือบที่ 25 [Ig/ml ยับยั้งการเจริญเติบโตถูกสังเกตแม้จำนวนของเซลล์ที่จุดเริ่มต้นของวัฒนธรรมมีขนาดค่อนข้างใหญ่ (2.0x106 เซลล์/มล.ในสื่อของเหลว2.0x106 เซลล์/แผ่นในแผ่น) ในสื่อที่ประกอบด้วย 100 ไมโครกรัมเป็น เครื่อง/ml ของซีโอซิน การเติบโตของยูกลีนาพัพัดั้งเดิมได้เกือบทั้งหมดห้าม ในสื่อของเหลว (รูป 5) หรือมีกลางแผ่น (รูป 6)[0092]รูปที่ 7 แสดงความแตกต่างในการเจริญเติบโตของการ สายพันธุ์ป่ายูกลีนาในสื่อ KH ที่ pH แต่ละ[0093]6. 1 2 ความไวของยูกลีนาต้องใช้ป่าเพื่อยาเสพติดต่าง ๆ อิทธิพลของซีโฟแทกซีม ซึ่งใช้ในการเอาออกอะโกรแบคทีเรียม ในการเติบโตของยูกลีนาในการทรานสฟอร์มโดยวิธีอะโกรแบคทีเรียมถูกตรวจสอบ เปิดเผยผลลัพธ์ที่ ซีโฟแทกซีมได้ไม่มีผลต่อการเจริญเติบโตของป่ายูกลีนา สายพันธุ์การ.tg น้อย 500 ml (รูป 8) ดังนั้น ใช้ปานกลางประกอบด้วยซีโฟแทกซีมใช้[0094]G418 และไฮโกรไมซินห้ามการเจริญเติบโตของยูกลีนาพัพัดั้งเดิมเป็นความเข้มข้นที่เพิ่มขึ้น (Figs. 9 และ 10) นี้ชี้ให้เห็นความเป็นไปได้ที่เหล่านี้ยาเสพติด นอกจากนี้การซีโอซิน สามารถใช้เป็นเครื่องหมายตัวเลือกของการยูกลีนาทรานสฟอร์แมนต์[0095]6. 1 พิจารณา 3 สภาวะสำหรับการเพเพร่วม ทำตามวิธีที่อธิบายไว้ในการเพเพร่วมส่วน 5.3 สื่อของเหลวที่ใช้สำหรับการการเพเพร่วมถูกสื่อ KH และปานกลางการ IM มักมีใช้สื่อการ IM เมื่อทำการทรานสฟอร์ม โดยวิธีอะโกรแบคทีเรียม ที่ สื่อที่ใช้ในการทดลองปัจจุบันมี pH 5.3 อยู่ อะซีโตไซริงโกน ซึ่งเป็นเป็น inducer ยีน vir ที่เป็นความเข้มข้น 100 11M และน้ำตาลกลูโคสที่มีอยู่ ซึ่งเป็นการinducing ปัจจัย ที่ความเข้มข้นของ 10 มม. ผลของ co- culturing ใช้สื่อเหล่านี้เปิดเผยการเจริญเติบโตที่ดีของการ ยูกลีนาทรานสฟอร์แมนต์บนสื่อกลางที่ใช้ถูกตรวจสอบเมื่อมีใช้สื่อ IM 25 การเปรียบเทียบระบบที่ใช้บ่อยpCMV เป็นการนำยีนโปรโมเตอร์และใช้ระบบpNOR endogenous เป็นการนำยีนโปรโมเตอร์เผยว่า เติบโตดีมีแนวโน้มที่จะแสดงในระบบโดยใช้ pNOR [0096] 6. 1 พิจารณาสภาวะงานปานกลาง 4หลังจากเสร็จสิ้นการการเพเพร่วม วัฒนธรรมโซลูชันที่ถูกล้าง ด้วยซีโฟแทกซีม (ซีโฟแทกซีมโซเดียม 50011 g/ml) ในการใช้ ความเข้มข้นซีโอซินถูกตั้งค่าความล่าช้า 25 ml และซีโฟแทกซีมความเข้มข้นถูกตั้งค่าให้ 100 ijg/mi ทรานสฟอร์แมนต์ได้รับได้อย่างมีประสิทธิภาพ โดยการเพิ่ม ความเข้มข้นซีโอซินวิธี stepwise แยกของทรานสฟอร์แมนต์[0097]6. 2 ยาต้านทานของยูกลีนาทรานสฟอร์แมนต์ ต่อต้านยาเสพติดของยูกลีนาแยกทรานสฟอร์แมนต์ถูกตรวจสอบ ยูกลีนาทรานสฟอร์แมนต์มีอ่างในกลางน้ำใช้ (ละ pH และ KH สื่อ6.8) ค่อย ๆ ผลลัพธ์ที่แสดงให้เห็นว่าเซลล์ทรานสฟอร์แมนต์เจริญเติบโตค่อนข้างดี อย่างไรก็ตาม มีความแตกต่างขนาดใหญ่ จากการเติบโตในสภาวะที่ไม่ประกอบด้วยยาที่รูป 11) มุมมองผลลัพธ์ในส่วน 6.1.1 เชื่อที่เกือบจะไม่มีเซลล์ ยกเว้นทรานสฟอร์แมนต์ เจริญเติบโตในเลือกกลางของเหลวที่มี pH 6.8 ตามลำดับ การแยกของทรานสฟอร์แมนต์กับยาถือได้ 15 ได้เพียงพอ อื่น ๆ โดยเฉพาะ นี้แนะนำเป็นไปได้ ว่า สาเหตุของพอยาต้านทานที่จะ ทรานสฟอร์แมนต์แสดงให้เห็นว่าไม่ได้แยกรายการเซลล์ไม่สมบูรณ์ หนึ่งในสาเหตุต่อต้านยาเสพติดไม่เพียงพอคือการ ปัญหาของจำนวนยีนนำนิพจน์ มี 20 นั้นไม่มีเป็นนิพจน์จำนวนเพียงพอ รับกับ โปรโมเตอร์s ที่ใช้ในการทดลองนี้ นอกจากนี้ วิธีอะโกรแบคทีเรียม แม้ว่ายีนที่นำ แทรกกลุ่ม เว็บไซต์เป็นแบบสุ่ม เนื่องจากการ จำนวนนิพจน์ที่นำยีนที่มีแนวโน้มขึ้นอยู่กับการ ไซต์ไปซึ่งยีนนำใส่ มีการความเป็นไปได้ที่ ตามไซต์ของแทรก การนิพจน์จะไม่ถึงระดับเพียงพอ[0098]6. 3 ตรวจยีนนำจากยูกลีนาทรานสฟอร์แมนต์ ทำการวิเคราะห์ โดย PCR โดยใช้ดีเอ็นเอทั้งหมดสกัดจากยูกลีนาจะทรานสฟอร์แมนต์เป็นแม่แบบ ที่มีส่วนที่สอดคล้องกับภูมิภาคยีนต้านทานซีโอซินเอาต์เสร็จเรียบร้อยแล้ว (รูป 12)[0099] 6. แนะนำผลิตภัณฑ์ Transcription มาวิเคราะห์ 4 ยีนมีสังเคราะห์ cDNA โดยใช้อาร์เอ็นเอที่สกัดจากผลรวมยูกลีนาจะทรานสฟอร์แมนต์เป็นแม่แบบ ตรวจยีนต้านทานซีโอซินพยายามใช้ cDNA ที่เป็นแม่แบบ ที่ ส่วนตรงนี้ไม่ได้ (รูปที่ 13)[0100]6. เสถียรภาพของยีนที่นำ 5Passaging ของทรานสฟอร์แมนต์มีอย่างต่อเนื่องภายใต้สภาวะที่ปราศจากซีโอซิน และทรานสฟอร์แมนต์ได้ subcultured อีกครั้งในกลางที่ประกอบด้วยซีโอซิน การเปรียบเทียบเจริญเติบโตระหว่างสองเผยว่า เติบโตเพียงพอได้รับการยืนยันในทั้งสองกรณี (รูปที่ 14) บ่งชี้ว่า ยาพอไว้ถ้าวัฒนธรรมดำเนินของยาระยะเวลา นอกจากนี้ การเปรียบเทียบจำนวนของหน่วยงานจากการจุดเริ่มต้นของวัฒนธรรมแสดงความแตกต่างเล็กน้อยระหว่างทั้งสอง ดังนั้น ติดมา ด้วยการทรานสฟอร์มถือเป็น stablyยังคงอยู่ (รูป 15)[0101] 7. การเลือกและการวิเคราะห์ของทรานสฟอร์แมนต์โดย 0418การทดลองทำการแนะนำกับนีโอมัยซินยีนต้านทาน ที่รับผิดชอบต่อต้าน 0418 ที่ยีนต้านทานนีโอมัยซินที่ใช้แสดงในลำดับ ID: 7ทำการทดลองในลักษณะเดียวกันในการเลือก for ซีโอซิน. The experiment was performed at a 0418 concentrationof 10 ig/ml. As shown in Figs. 16 and 17, DNA and transcriptionproduct of the neomycin resistance gene were detected from the obtained G418-resistant ทรานสฟอร์แมนต์.[0102] 8. Selection and Analysis of ทรานสฟอร์แมนต์ by Using ไฮโกรไมซินAn experiment was performed introducing a ไฮโกรไมซินresistance gene. The ไฮโกรไมซิน resistance gene used is shown inSEQ ID NO: 8. The experiment was performed in the same manner asin the selection for ซีโอซิน. The experiment was performed at a ไฮโกรไมซิน concentration of 10 mg/ml. As shown in Figs. 18 and 19, -27-DNA and transcription product of the ไฮโกรไมซิน resistance genewere detected from the obtained ไฮโกรไมซิน-resistant ทรานสฟอร์แมนต์.

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

6. 1 ผลของซีโอซินในยูกลีนาสายพันธุ์ในป่ากลาง KH ที่ pH
6.8
6 1. ความเข้มข้นขั้นต่ำ 1 ยับยั้งของซีโอซินสำหรับยูกลีนา.
พัพัดั้งเดิม
ความเข้มข้นต่ำสุดของซีโอซินสำหรับ
สายพันธุ์ป่ายูกลีนาในสื่อที่ pH 6.8 ได้รับการตรวจสอบ ผลการศึกษาพบว่าในอาหารเหลว, การเจริญเติบโตที่สามารถ
ยับยั้งสมบูรณ์ที่ 50 ไมโครกรัม / มล. ในขณะที่ในกลางแผ่น,
การเจริญเติบโตสามารถยับยั้งเกือบ 25 [Ig / ml ยับยั้งการเจริญ
พบว่าแม้ในขณะที่จำนวนของเซลล์ที่เริ่มต้นของ
วัฒนธรรมค่อนข้างขนาดใหญ่ (2.0x106 เซลล์ / มล. ในอาหารเหลว,
2.0x106 เซลล์ / แผ่นในสื่อแผ่น) ในสื่อที่มี 100
ไมโครกรัม / มิลลิลิตรซีโอซินการเจริญเติบโตของยูกลีนาพัพัดั้งเดิมก็เกือบจะ
ยับยั้งอย่างสมบูรณ์ไม่ว่าจะในอาหารเหลว (รูป 5) หรือ
ขนาดกลางจาน (รูป 6)
[0092]
รูปที่ 7 แสดงให้เห็นว่า ความแตกต่างในการเจริญเติบโตของ
สายพันธุ์ป่ายูกลีนาในกลาง KH ที่ pH แต่ละ
[0093]
6 1. 2 ความไวของยูกลีนาป่าสายพันธุ์ต่างๆที่จะยาเสพติดอิทธิพลของซีโฟแทกซีมซึ่งจะใช้ในการลบอะโกรแบคทีเรียมในการเจริญเติบโตของยูกลีนาในการทรานสฟอร์มโดยอะโกรแบคทีเรียม วิธีการได้รับการตรวจสอบ ผลการศึกษาพบว่าซีโฟแทกซีมมีไม่มีผลต่อการเจริญเติบโตของป่ายูกลีนาความเครียดอย่างน้อย 500 .tg / ml (รูป 8) ดังนั้นการเลือกสื่อที่มีซีโฟแทกซีมถูกนำมาใช้. [0094] G418 และไฮโกรไมซินสามารถยับยั้งการเจริญเติบโตของยูกลีนาพัพัดั้งเดิมเป็นความเข้มข้นที่เพิ่มขึ้น (มะเดื่อ. 9 และ 10) นี้แสดงให้เห็นความเป็นไปได้ ว่ายาเสพติดเหล่านี้นอกเหนือไปจากซีโอซินสามารถนำมาใช้เป็นเครื่องหมายการเลือกของยูกลีนาทรานสฟอร์แมนต์. [0095] 6 1. 3 พิจารณาสภาวะสำหรับการเพเพร่วมการเพเพร่วมดำเนินการโดยวิธีการที่อธิบายไว้ในมาตรา 5.3 สื่อของเหลวที่ใช้สำหรับการเพเพร่วมเป็นสื่อกลางใน KH และขนาดกลาง IM กลาง IM มักจะถูกใช้เมื่อการทรานสฟอร์มโดยอะโกรแบคทีเรียมที่จะดำเนินการวิธีการ สื่อที่ใช้ในการทดลองในปัจจุบันมีค่า pH 5.3 ที่มีอยู่อะซีโตไซริงโกนซึ่งเป็น inducer ของยีน vir ที่ความเข้มข้น 100 11M, กลูโคสและที่มีอยู่ซึ่งเป็นปัจจัยที่กระตุ้นให้เกิดการอย่างเข้มข้น 10 มิลลิ ผลของการร่วมเพาะเลี้ยงโดยใช้สื่อเหล่านี้แสดงให้เห็นว่าการเจริญเติบโตที่ดีขึ้นของยูกลีนาทรานสฟอร์แมนต์ในสื่อเลือกพบว่าเมื่อกลาง 25 IM ถูกนำมาใช้ การเปรียบเทียบของระบบโดยใช้ภายนอกpCMV เป็นโปรโมเตอร์ของยีนและแนะนำระบบโดยใช้pNOR ภายนอกเป็นยีนแนะนำโปรโมเตอร์เผยให้เห็นว่าการเจริญเติบโตที่ดีขึ้นมีแนวโน้มที่จะแสดงในระบบโดยใช้ pNOR [0096] 6 1. 4 พิจารณาคัดเลือกกลางสภาวะหลังจากเสร็จสิ้นการเพเพร่วมวัฒนธรรมทางออกที่ถูกล้างด้วยซีโฟแทกซีม (ซีโฟแทกซีมโซเดียม 500 11g / ml) ในสื่อที่เลือกซีโอซินถูกกำหนดความเข้มข้นถึง 25 ล่าช้า / ml และซีโฟแทกซีมเข้มข้นที่ถูกกำหนดให้ 100 IJG / ไมล์ ทรานสฟอร์แมนต์ได้อย่างมีประสิทธิภาพโดยการเพิ่มซีโอซินความเข้มข้นในลักษณะแบบขั้นตอนในการแยกของทรานสฟอร์แมนต์. [0097] 6 2 ดื้อยาของยูกลีนาทรานสฟอร์แมนต์ดื้อยาของยูกลีนาแยกทรานสฟอร์แมนต์พบว่า ยูกลีนาทรานสฟอร์แมนต์ได้รับการเพาะเลี้ยงในกลาง KH และอาหารเหลวเลือก (แต่ละคนมีค่า pH 6.8) ผลการศึกษาพบว่าทรานสฟอร์แมนต์เซลล์ที่แสดงให้เห็นการเจริญเติบโตค่อนข้างดี; แต่มีความแตกต่างที่มีขนาดใหญ่จากการเจริญเติบโตในสภาวะที่ไม่มียาเสพติดที่มีรูป 11) ในมุมมองของผลในมาตรา 6.1.1 เป็นที่เชื่อกันว่าเซลล์เกือบจะไม่มีการยกเว้นสำหรับทรานสฟอร์แมนต์เติบโตในอาหารเหลวเลือกที่ pH 6.8 ดังนั้นการแยกทรานสฟอร์แมนต์กับยาเสพติดถือว่ามี 15 เพียงพอ โดยเฉพาะอย่างยิ่งนี้แสดงให้เห็นความเป็นไปได้ว่าสาเหตุของการดื้อยาที่ไม่เพียงพอที่ทรานสฟอร์แมนต์แสดงให้เห็นว่าจะไม่แยกที่ไม่สมบูรณ์ของเซลล์. หนึ่งในสาเหตุของการดื้อยาที่ไม่เพียงพอเป็นปัญหาของจำนวนเงินที่แสดงออก ของยีนแนะนำ มี 20 เป็นไปได้ว่าเป็นจำนวนเงินที่เพียงพอที่แสดงออกไม่ได้รับกับโปรโมเตอร์ s ใช้ในการทดลองนี้ นอกจากนี้ในวิธีการที่มอะโกรแบคทีเรียแม้ว่ายีนแนะนำจะแทรกเข้าไปในจีโนมของเว็บไซต์ที่เป็นแบบสุ่ม เนื่องจากปริมาณการแสดงออกของยีนที่แนะนำมีแนวโน้มที่จะขึ้นอยู่กับเว็บไซต์ที่เป็นที่แนะนำยีนใส่มีความเป็นไปได้ที่ขึ้นอยู่บนเว็บไซต์ของแทรกการแสดงออกจะไม่สามารถเข้าถึงในระดับที่เพียงพอ. [0098] 6 3 การตรวจหายีนแนะนำจากยูกลีนาทรานสฟอร์แมนต์การวิเคราะห์โดยวิธี PCR ได้รับการดำเนินการโดยใช้ดีเอ็นเอรวมสกัดจากยูกลีนาทรานสฟอร์แมนต์เป็นแม่แบบ ส่วนที่สอดคล้องกับซีโอซินภูมิภาคต้านทานยีนขยายประสบความสำเร็จ (12 รูป) [0099] 6 4 การวิเคราะห์ถอดความสินค้าที่ได้มาจากการแนะนำของยีนยีนสังเคราะห์โดยใช้อาร์เอ็นเอรวมสกัดจากยูกลีนาทรานสฟอร์แมนต์เป็นแม่แบบ การตรวจสอบของซีโอซินยีนต้านทานความพยายามโดยใช้ยีนเป็นแม่แบบ ส่วนนี้สอดคล้องกับที่ได้รับ (รูป 13) [0100] 6 5 เสถียรภาพของยีนแนะนำPassaging ของทรานสฟอร์แมนต์ได้อย่างต่อเนื่องภายใต้ซีโอซินฟรีสภาวะและผลทรานสฟอร์แมนต์ได้รับการ เลี้ยงอีกครั้งในซีโอซิน -containing กลาง . การเปรียบเทียบการเจริญเติบโตระหว่างสองคนนี้แสดงให้เห็นว่าการเจริญเติบโตเพียงพอที่ได้รับการยืนยันในทั้งสองกรณี (รูปที่ 14) นี้บ่งชี้ว่าการดื้อยาจะยังคงเพียงพอแม้ว่าวัฒนธรรมจะดำเนินการในกรณีที่ไม่มียาเสพติดเป็นระยะเวลา. นอกจากนี้การเปรียบเทียบจำนวนของหน่วยงานจากจุดเริ่มต้นของวัฒนธรรมที่แสดงให้เห็นความแตกต่างเล็ก ๆ น้อย ๆ ระหว่างคนทั้งสอง ดังนั้นลักษณะที่ได้มาโดยการทรานสฟอร์มจะถือเป็นเสถียรเก็บรักษาไว้ (รูปที่ 15) [0101] 7 การคัดเลือกและการวิเคราะห์ของทรานสฟอร์แมนต์ 0418 โดยใช้การทดสอบที่ได้ดำเนินการแนะนำ neomycin ยีนต้านทานซึ่งเป็นผู้รับผิดชอบในการต้านทาน 0418 ยีนต้านทาน neomycin ใช้แสดงใน SEQ ID NO: 7. ทดลองดำเนินการในลักษณะเดียวกับในการเลือกสำหรับซีโอซิน การทดลองดำเนินการที่มีความเข้มข้น 0418 10 ig / ml ดังแสดงในมะเดื่อ 16 และ 17 และการถอดรหัสดีเอ็นเอผลิตภัณฑ์ของยีนต้านทาน neomycin ถูกตรวจพบจากการที่ได้รับ G418 ทนทรานสฟอร์แมนต์. [0102] 8 การคัดเลือกและการวิเคราะห์ของทรานสฟอร์แมนต์โดยใช้ไฮโกรไมซินได้ดำเนินการทดลองแนะนำไฮโกรไมซินยีนต้านทาน ไฮโกรไมซินยีนต้านทานที่ใช้แสดงในSEQ ID NO: 8. การทดลองดำเนินการในลักษณะเดียวกับในการเลือกสำหรับซีโอซิน การทดลองดำเนินการที่ไฮโกรไมซินความเข้มข้น 10 มิลลิกรัม / มิลลิลิตร ดังแสดงในมะเดื่อ 18 และ 19 -27- สินค้าและการถอดรหัสดีเอ็นเอของไฮโกรไมซินยีนต้านทานที่ตรวจพบจากการที่ได้รับไฮโกรไมซิน -resistant ทรานสฟอร์แมนต์

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

6 . 1 ผลของซีโอซินในป่าห้วยทรายสายพันธุ์ใน KH ปานกลาง pH 6.8

6 1 . 1 ความเข้มข้นต่ำสุดของซีโอซินยับยั้งสำหรับยูกลีนา .

พัพัดั้งเดิมการแสดงนิทรรศการของซีโอซินสำหรับ
ยูกลีนาป่าสายพันธุ์ในอาหารที่พีเอช 6.8 ถูกตรวจสอบ ผลการวิจัย พบว่า ในอาหารเหลว การเจริญเติบโตสามารถ
ยับยั้งที่ 50 µกรัม / มิลลิลิตรในขณะที่จานขนาดกลาง
การเจริญเติบโตสามารถเกือบยับยั้งที่ 25 [ IG / มล. มีฤทธิ์ในการยับยั้งการเจริญเติบโต
พบว่าแม้ว่าจำนวนเซลล์ที่เริ่มต้นของ
วัฒนธรรมค่อนข้างใหญ่ ( 2.0x106 เซลล์ / มิลลิลิตรในอาหารเหลว
2.0x106 , เซลล์ / จาน ในจานขนาดกลาง ) ในอาหารที่มี 100
µ g / ml ซีโอซิน , การเจริญเติบโตของยูกลีนาพัพัดั้งเดิมเกือบ
ยับยั้ง ไม่ว่าในอาหารเหลว ( รูป 5 ) หรือ จานกลาง ( รูป 6 )

[ ]
0092 รูป 7 แสดงความแตกต่างในการเจริญเติบโตของ
ยูกลีนาป่าเมื่อยใน KH กลางที่แต่ละ 0093 อ
[ ]
6 1 . 2 ความไวของยูกลีนาป่าสายพันธุ์ต่าง ๆยา







อิทธิพลของซีโฟแทกซีมซึ่งถูกใช้เพื่อลบอะโกรแบคทีเรียม
,ต่อการเจริญเติบโตของยูกลีนาในการทรานสฟอร์มโดยอะโกรแบคทีเรียม วิธีตรวจสอบ ผลการศึกษาพบว่า
ซีโฟแทกซีมไม่มีอิทธิพลต่อการเจริญเติบโตของยูกลีนาป่า
เมื่อยอย่างน้อย 500 มิลลิลิตร ( รูป TG / 8 ) ดังนั้น การเลือกใช้สื่อที่มีซีโฟแทกซีม
.
[ ]
g418 ไฮโกรไมซิน 0094 และยับยั้งการเจริญเติบโตของยูกลีนา
พัพัดั้งเดิมเมื่อความเข้มข้นสูงขึ้น ( Figs 9 และ 10 )
นี้แสดงให้เห็นความเป็นไปได้ว่า ยาเหล่านี้ นอกจาก
ซีโอซินสามารถใช้เป็นเครื่องหมายของการทรานสฟอร์แมนต์ยูกลีนา
.
[ ]
0095 6 1 . 3 การพิจารณาสภาวะสำหรับการเพเพร่วม
การเพเพร่วมโดยใช้วิธีการที่อธิบายไว้ในมาตรา 5.3
.ของเหลวที่ใช้สื่อเพื่อการเพเพร่วมเป็นขนาดกลางและขนาดย่อมจำนวนม สื่อม มักใช้เมื่อการทรานสฟอร์มโดยอะโกรแบคทีเรียมวิธีทํา
สื่อที่ใช้ในการทดลอง ปัจจุบันมีพีเอช 5.3 อยู่
อะซีโตไซริงโกนซึ่งเป็นเอนไซม์ vir ยีน ที่ความเข้มข้น 100

11m และประกอบด้วยกลูโคสซึ่งเป็นปัจจัยกระตุ้น
ที่ความเข้มข้น 10 มิลลิเมตร ผลของการใช้สื่อเหล่านี้ Co -
เปิดเผยว่า การเจริญเติบโตที่ดีขึ้นของ
ยูกลีนาทรานสฟอร์แมนต์บนเลือกขนาดกลาง พบว่าเมื่อ 25 ม สื่อที่ใช้ การเปรียบเทียบระบบการใช้ภายนอก
pcmv เป็นแนะนำยีนโปรโมเตอร์และระบบการใช้
ใน pnor เป็นแนะนำยีนโปรโมเตอร์ พบว่า การเจริญเติบโตที่ดีขึ้นมีแนวโน้มที่จะถูกแสดงในระบบการใช้ pnor . [ 0096 ]
6 1 . 4 การพิจารณาเลือกสื่อสภาวะ
หลังจากการเพเพร่วม , วัฒนธรรม
ซีโฟแทกซีม ( ซีโฟแทกซีมล้างด้วยสารละลายโซเดียม 500

11g / ml ) ในอาหารเลือกได้การซีโอซินความเข้มข้นตั้ง
ล้า / 25 มิลลิลิตร และซีโฟแทกซีมความเข้มข้นตั้ง 100
ijg / มิ . การทรานสฟอร์แมนต์ได้อย่างมีประสิทธิภาพได้โดยการเพิ่ม






ความเข้มข้นซีโอซินในลักษณะแบบขั้นตอนในการแยกของทรานสฟอร์แมนต์ 0097 .
[ ]
6 2 การดื้อยาของยูกลีนาทรานสฟอร์แมนต์
ยาต้านทานของแยกยูกลีนา
ทรานสฟอร์แมนต์ถูกสังเกต ที่ห้วยทรายทรานสฟอร์แมนต์เลี้ยงในอาหารเหลวสูตร KH และเลือก ( แต่ละที่มี pH
6.8 ) ผลการวิจัย พบว่า เซลล์ทรานสฟอร์แมนต์พบ
การเจริญเติบโตค่อนข้างดี อย่างไรก็ตาม มี
ความแตกต่างขนาดใหญ่จากการเติบโตในสภาวะที่ไม่มียาก็มี
รูป 11 ) ในมุมมองของผลลัพธ์ในส่วนและก็เชื่อว่า
ที่เกือบจะไม่มีเซลล์ ยกเว้นทรานสฟอร์แมนต์เติบโตใน
เหลว selective ที่พีเอช 6.8 . ตาม ,
แยกของทรานสฟอร์แมนต์กับยาเสพติดถือว่ามี 15 เพียงพอแล้ว มากขึ้นโดยเฉพาะนี้แสดงให้เห็นความเป็นไปได้ว่า สาเหตุของความต้านทานยา

ทรานสฟอร์แมนต์ไม่เพียงพอที่พบไม่ใช่การแยกเซลล์ที่ไม่สมบูรณ์ของเส้น
สาเหตุที่ต้านทานยาไม่เพียงพอ เป็นปัญหาของการแสดงออก
ปริมาณแนะนำของยีน มีความเป็นไปได้ที่ปริมาณ 20 สำนวนเพียงพอไม่ได้
ที่ได้รับกับโปรโมเตอร์ S ที่ใช้ในการทดลองครั้งนี้ นอกจากนี้ ในอะโกรแบคทีเรียม
วิธี แม้ว่าการแนะนำยีน
แทรกเข้าไปในโครโมโซม , เว็บไซต์เป็นแบบสุ่ม เนื่องจากปริมาณการใช้
การแสดงออกยีนจึงขึ้นอยู่กับ
เว็บไซต์เป็นที่แนะนำยีนถูกแทรก มี
เป็นไปได้ ขึ้นอยู่กับเว็บไซต์ของแทรก
ท่าทางจะไม่ถึงระดับที่เพียงพอสําหรับการใช
[ ]
6 3 การแนะนำยีนจากห้วยทรายทรานสฟอร์แมนต์
การวิเคราะห์โดยวิธี PCR โดยใช้ DNA มีการรวม
สกัดจากห้วยทรายทรานสฟอร์แมนต์เป็นแม่แบบ
ส่วนที่สอดคล้องกับซีโอซินต้านทานยีนภูมิภาค
เรียบร้อยแล้วขยาย ( รูป 12 ) 0099
[ ]
64 การวิเคราะห์ผลิตภัณฑ์ถอดความมาจากแนะนำ









ยีนยีนสังเคราะห์ใช้อาร์เอ็นเอทั้งหมดสกัดจาก
ทรานสฟอร์แมนต์ยูกลีนาเป็นแม่แบบ การตรวจหายีนของซีโอซินความต้านทานจึงใช้วิธีเป็นแม่แบบ
ส่วนที่สอดคล้องกันได้ ( รูป 13 ) 0100
[ ]
6 5 เสถียรภาพของยีน
แนะนำ