5 g/L peptone, 10 g/L dextrose, and

5 g/L peptone, 10 g/L dextrose, and 20 g/L agar) and incubated at
30 ◦C for two days until complete growth of the yeast colonies.
The yeast colonies were then separated from the other microorganisms
on the basis of their specific morphology. The yeast colonies
were grown repeatedly three times on fresh YM selective medium
agar plates to obtain pure colonies [20,23]. Next, a pre-culture of
Saccharomyces cerevisiae at a density of 2.45
×
107 cells/mL was
prepared by inoculating yeast colonies into 100 mL YM broth (pH
6.0) in a 250-mL flask and incubating the samples at 30 ◦C and
150 rpm for 24 h. To obtain dense cultures, the freshly prepared
yeast pre-culture (50 mL) was centrifuged at 3500 rpm for 10 min,
and the pellets obtained were resuspended in 5 mL YM broth.
The concentration of the dense yeast culture was determined to
be 2.21
×
108 cells/mL based on observations using a Neubauerimproved
hemocytometer (Paul Marienfeld, Germany).
2.4. Development of the yeast cell-free system
The freshly prepared dense yeast culture (5 mL) was placed in a
sterilized glass vial with 5 mL chilled glass beads, and the samples
were vortexed for 15.0 min to rupture the cells. To avoid the thermal
denaturation of the proteinaceous yeast cell internal matrix,
the samples were chilled on ice after regular intervals of 3 min. The
yeast lysates were then collected with a sterile syringe and concentrated
using a 10-kD spin column (Abcam, England; Product #
ab93349).
2.5. SDS-PAGE analysis
The presence of yeast glycolytic and fermentation enzymes after
bead beating was determined by sodium dodecyl sulfate polyacrylamide
gel electrophoresis (SDS-PAGE) using a 15% polyacrylamide
gradient gel under reducing conditions with a Bio-Rad mini-gel
apparatus [24]. Thermo Scientific PageRulerTM protein ladders with
a range of 10–170 kDa were used as standards, and the protein
bands were visualized by staining with Coomassie brilliant blue
R-250 (Sigma).
2.6. Liquid chromatography–mass spectrometry/mass
spectrometry hybrid quadrupole time of flight (LC–MS/MS Q-TOF)
analysis
A nano-LC–MS/MS Q-TOF analysis of the yeast lysates was performed
using a nano-HPLC system (Agilent, Wilmington, DE). A
nano-chip column (Agilent, Wilmington, DE, 150 mm
×
0.075 mm)
was used for peptide separation. The mobile phase A for LC separation
was 0.1% formic acid in deionized water, and mobile phase B
was 0.1% formic acid in acetonitrile. The chromatography gradient
was designed for a linear increase from 3% B to 40% B in 80 min,
then to 60% B in 10 min, 95% B in 10 min, and 3% B in 20 min; during
the analysis, the flow rate was maintained at 400 nL/min. The
product ion spectra were collected in the information-dependent
acquisition (IDA) mode and analyzed by Agilent 6530 Accurate-
Mass Q-TOF using continuous cycles of one full scan of TOF MS from
350 to 1200 m/z (1.0 s) plus three product ion scans from 100 to
1700 m/z (1.5 s each). Precursor m/z values were selected, starting
with the most intense ion, using a selection quadrupole resolution
of 4 Da. The rolling collision energy feature, which determines the
collision energy based on the precursor value and charge state, was
used. The dynamic exclusion time for the precursor ion m/z values
was 30 s.
2.7. Database searching
The mascot algorithm (Matrixscience, USA) was used to identify
peptide sequences present in a protein sequence database. The

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

peptone 5 g/L ขึ้น 10 g/L และ 20 g/L agar) และ incubated ที่◦C 30 สองวันจนเจริญเติบโตสมบูรณ์ของอาณานิคมยีสต์อาณานิคมยีสต์ที่แยกจากจุลินทรีย์อื่น ๆ แล้วตามสัณฐานวิทยาการเฉพาะ อาณานิคมยีสต์ได้ปลูกซ้ำสามครั้งใน YM สดกลางงานแผ่น agar รับอาณานิคมบริสุทธิ์ [20,23] ถัดไป เป็นวัฒนธรรมก่อนSaccharomyces cerevisiae ที่ความหนาแน่นของ 2.45×มี 107 เซลล์/มล.โดย inoculating อาณานิคมยีสต์เป็นซุป YM 100 mL (pH6.0) หนาว 250 mL และ incubating ตัวอย่างที่ 30 ◦C และรอบต่อนาที 150 ใน 24 ชม รับวัฒนธรรมหนาแน่น การลิ้มมี centrifuged ยีสต์ก่อนวัฒนธรรม (50 มล.) ที่ 3500 รอบต่อนาทีใน 10 นาทีและอัดเม็ดที่ได้มี resuspended ใน 5 mL YM ซุปมีกำหนดความเข้มข้นของวัฒนธรรมยีสต์หนาแน่นเป็น 2.21×108 เซลล์/มล.ตามสังเกตโดยใช้การ Neubauerimprovedhemocytometer (Paul Marienfeld เยอรมนี)2.4 การพัฒนาระบบฟรีเซลล์ยีสต์วัฒนธรรมยีสต์ลิ้มหนาแน่น (5 mL) ถูกวางไว้ในแก้ว sterilized คอนแทค ด้วยลูกปัดแก้ว 5 มล.แช่ และตัวอย่างvortexed สำหรับนาที 15.0 การ rupture เซลล์ได้ เพื่อหลีกเลี่ยงความร้อนdenaturation proteinaceous ยีสต์เซลล์ภายในเมตริกซ์ตัวอย่างถูกแช่ในน้ำแข็งหลังจากช่วงเวลาปกติ 3 นาทีlysates ยีสต์แล้วรวบรวมกับเข็มฉีดยาฆ่าเชื้อ และเข้มข้นใช้คอลัมน์หมุน 10-kD (Abcam อังกฤษ ผลิตภัณฑ์#ab93349)2.5 วิเคราะห์หน้า SDSของ glycolytic ยีสต์และการหมักเอนไซม์จากกำหนด โดยโซเดียม dodecyl ซัลเฟต polyacrylamide เต้นลูกปัดelectrophoresis เจล (SDS-หน้า) ใช้ polyacrylamide 15%ไล่โทนสีเจลภายใต้ลดลงด้วย Bio Rad เจมินิเครื่อง [24] เทอร์โม PageRulerTM วิทยาศาสตร์โปรตีนบันไดด้วยช่วง 10 – 170 kDa ถูกใช้เป็นมาตรฐาน และโปรตีนวงมี visualized โดยย้อมสีด้วยสีฟ้าสดใส CoomassieR-250 (ซิกมา)2.6 การเหลว chromatography – มวล spectrometry/มวลspectrometry ไฮบริ quadrupole เวลาบิน (LC – MS/MS Q-TOF)การวิเคราะห์Q นาโน-LC – MS/MS-ทำการวิเคราะห์ TOF lysates ยีสต์ใช้ระบบนาโน HPLC (Agilent วิลมิ DE) Aคอลัมน์ชินาโน (Agilent วิลมิ DE, 150 มม.×0.075 มิลลิเมตร)ใช้สำหรับแยกเพปไทด์ A เฟสเคลื่อนที่สำหรับแยก LCมี 0.1% กรดในน้ำ deionized และโมบายระยะ B0.1% กรดใน acetonitrile ได้ การไล่ระดับสี chromatographyถูกออกแบบมาสำหรับการเพิ่มขึ้นเชิงเส้นจาก 3% B 40% B ในนาที 80แล้วไปที่ 60% B ใน 10 นาที 95% B ใน 10 นาที และ 3% B ใน 20 นาที ในระหว่างการวิเคราะห์ อัตราการไหลไม่คงที่ nL 400 นาทีผลิตภัณฑ์ไอออนแรมสเป็คตราถูกรวบรวมไว้ในข้อมูลขึ้นอยู่กับโหมดซื้อ (IDA) และวิเคราะห์ โดย Agilent 6530 ถูกต้อง -Q มวลใช้วงจรต่อเนื่องของการสแกนเต็มรูปแบบหนึ่งของ MS TOF จาก TOF350 ถึง 1200 m/z (1.0 s) พร้อมสแกนสามผลิตภัณฑ์ไอออน 100 ไป1700 m/z (1.5 s ละ) ค่า m/z สารตั้งต้นได้เลือก เริ่มต้นมีไอออนที่รุนแรงที่สุด ใช้ความละเอียด quadrupole เลือกของดา 4 กลิ้งชนพลังงานคุณลักษณะ ซึ่งเป็นตัวกำหนดพลังงานชนยึดสารตั้งต้นค่าและค่าสถานะ ถูกใช้ เวลาแยกแบบไดนามิกสำหรับค่า m/z ไอออนสารตั้งต้นถูก 30 s2.7 การฐานข้อมูลค้นหาขั้นตอนวิธีแมสคอท (Matrixscience สหรัฐอเมริกา) ถูกใช้เพื่อระบุเพปไทด์ลำดับที่แสดงในฐานข้อมูลลำดับโปรตีน ที่

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

5 g / l ตามลำดับ , 10 กรัม / ลิตร เดกซ์โทรส และ 20 กรัม / ลิตรวุ้น ) และบ่มที่อุณหภูมิ 30 C
◦สองวันจนกว่าการเจริญเติบโตที่สมบูรณ์ของยีสต์ยีสต์อาณานิคมอาณานิคม
แล้วแยกออกจากจุลินทรีย์อื่นๆ
บนพื้นฐานของลักษณะที่เฉพาะเจาะจงของพวกเขา อาณานิคมยีสต์
ปลูกซ้ำสามครั้งสด การเลือกสื่อ
วุ้นแผ่นเพื่อให้ได้ 20,23 อาณานิคม [ บริสุทธิ์ ] ต่อไปก่อน
, วัฒนธรรมSaccharomyces cerevisiae ที่ความหนาแน่น 2.45
×
107 เซลล์ / มล. ถูกเตรียมโดยยีสต์ในอาณานิคม
ณ 100 มิลลิลิตร ) น้ำ ( pH
6.0 ) ในขวด 250 ml และการแช่ตัวอย่างที่ 30 ◦ C
150 รอบต่อนาทีเป็นเวลา 24 ชั่วโมง เพื่อเตรียมรับวัฒนธรรมหนาแน่น
สดยีสต์ก่อนวัฒนธรรม 50 ml ) คือระดับที่ 3 , 500 รอบต่อนาที เป็นเวลา 10 นาที และได้มีการ resuspended
ขี้ในน้ำซุป )
5 ml .ความเข้มข้นของยีสต์วัฒนธรรมหนาแน่น ตัดสินใจ


เป็น 2.21 × 108 เซลล์ / มิลลิลิตร จากการสังเกตการใช้ neubauerimproved
hemocytometer ( พอลมาเรียนเฟลด์ , เยอรมนี ) .
2.4 . การพัฒนาระบบการสังเคราะห์ยีสต์สดยีสต์วัฒนธรรม
ไว้หนาแน่น ( 5 มล. ) ลงในขวดแก้ว 5 ml
ฆ่าเชื้อแช่เย็น ลูกปัดแก้ว และตัวอย่าง
ถูก vortexed 15 .0 นาทีที่จะทำให้เซลล์ เพื่อหลีกเลี่ยงความร้อนของ proteinaceous
( เซลล์ยีสต์ภายในเมทริกซ์
จำนวนแช่เย็นแข็งหลังจากช่วงเวลาปกติ 3 นาที
lysates ยีสต์แล้วเก็บด้วยกระบอกฉีดยาปลอดเชื้อและเข้มข้น
ใช้ 10 กิโลปั่นคอลัมน์ ( ABCAM , อังกฤษ ; ผลิตภัณฑ์#

ab93349 ) 2.5
การวิเคราะห์เอนไซม์การปรากฏตัวของยีสต์ glycolytic และการหมักเอนไซม์หลังจาก
ลูกปัดเต้นถูกกำหนดโดยโซเดียมโดเดซิลซัลเฟตโพลีอะคริลาไมด์เจลอิเลคโตรโฟรีซีส ( SDS-PAGE )

ใช้ 15% โพลีอะคริลาไมด์เจล ภายใต้การลดเงื่อนไขกับทางชีวภาพราดมินิเจล
- [ 24 ] เทอร์โมวิทยาศาสตร์ pagerulertm โปรตีนบันไดกับ
ช่วง 10 – 170 กิโลดาลตันถูกใช้เป็นมาตรฐาน และโปรตีน
วงถูกมองเห็นโดยการศึกษาเหล่านี้น่าจะเป็น r-250 สีฟ้าสดใส ( Sigma )
.
2.6 liquid chromatography - มวลสาร / มวล
รีไฮบริดคำเวลาของเที่ยวบิน ( LC MS / MS และการวิเคราะห์ q-tof )

นาโน LC MS / MS และการวิเคราะห์ q-tof ของยีสต์ lysates แสดง
โดยใช้ระบบ HPLC นาโน ( Agilent , Wilmington , DE )
คอลัมน์เป็นนาโน ชิพ ( Agilent , Wilmington , DE , 150 มม. ×


0.075 มม.ใช้สำหรับแยกเปปไทด์ . เฟสเคลื่อนที่สำหรับ
แยก LC คือ 0.1% กรดในน้ำคล้ายเนื้อเยื่อประสาน และโมบายเฟส B
0.1 % กรดในไน . โครมาโทกราฟีลาด
ถูกออกแบบมาสำหรับเส้นเพิ่มขึ้นจาก 3 % B 40 % B ใน 80 นาที
แล้ว 60% B ใน 10 นาที 95 % B ใน 10 นาที และ 3 % B ใน 20 นาที ในระหว่าง
การวิเคราะห์อัตราการไหลไว้ที่ 400 nl / min
โดยไอออนผลิตภัณฑ์เชิงข้อมูล (
( IDA ) โหมดการใช้เลนต์ 6530 ถูกต้อง -
มวล q-tof ใช้อย่างต่อเนื่องรอบหนึ่งสแกนเต็มรูปแบบของ tof MS จาก
350 ถึง 1200 m / Z ( 1.0 ) บวกสามผลิตภัณฑ์ไอออนสแกนจาก 100
1700 M / Z ( 1.5 S แต่ละ ) สารตั้งต้น M / Z ค่าสุ่มเริ่มต้น
กับไอออนที่รุนแรงที่สุด การเลือกความละเอียด
คำ4 ดา . กลิ้งชนพลังงานคุณลักษณะที่กำหนด
การชนพลังงานตามค่าตั้งต้นและค่าธรรมเนียมรัฐ คือ
ใช้ . เวลาไปแบบไดนามิกสำหรับสารตั้งต้นไอออน M / Z ค่า
.
มา 30 ปี การค้นหาฐานข้อมูล
มาสคอตของ matrixscience , USA ) ถูกใช้เพื่อระบุลำดับปัจจุบัน
เปปไทด์ในโปรตีนลำดับฐานข้อมูล ที่