t has been reported that the hydrol

t has been reported that the hydrolase enzyme, chlorophyllase (CLH) catalyzes the formation of chlorophyllide during pigment extraction [17] (Figure 1A). This enzyme is unusually stable in high concentrations of organic solvents such as 50-70% aqueous acetone [18,19]. Higher plants contain one or two isoforms of this enzyme [20] and Arabidopsis has two CLH isoforms encoded by CLH1 and CLH2 genes, respectively [21]. CLH1 encodes the isoform of CLH that accounts for the majority of CLH in Arabidopsis leaves. CLH1 gene expression is significantly upregulated by methyl-jasmonate (MeJA), a phytohormone mediating various biotic and abiotic signaling pathways [22]. In contrast, CLH2 is constitutively expressed and only represents a minor fraction of CLH activity [23]. In the present study, we assessed how much chlorophyllide is formed during pigment extraction compared to the amount that naturally occurs in leaves. In a subsequent analysis, we then examined whether or not CLH is involved in chlorophyllide formation during extraction by comparing its formation in leaves of wild-type and an Arabidopsis mutant which is deficient in CLH activity. Collectively, these experiments indicated that the majority of chlorophyllide detected in extracts obtained using 80% acetone or pure acetone is produced during pigment extraction through the reaction catalyzed by CLH. We also compared three different methods of pigment extraction that were previously reported in literature. Bacon and Holden [17] reported that CLH activity could be suppressed by boiling leaves for a period of 5 min. They also indicated, however, that the boiling treatment also removes Mg2+ from chlorophyll [17]. We found that, in the case of Arabidopsis leaves, CLH can be inactivated and Mg2+ removal from chlorophyll can be reduced when samples were boiled for only 5 sec. In the method of Schenk et al. [23], leaves were first ground into powder in liquid nitrogen and pigments were subsequently extracted in buffered acetone cooled to −20°C. We found this method is very efficient when processing a relatively small number of samples. Finally, we tested the use of N, N’-dimethylformamide (DMF) as an extraction agent to eliminate the formation of chlorophyllide during sample preparation. Although Moran and Porath [24] reported that chlorophyll is stable in this solvent, they did not characterize the effect of DMF on chlorophyllide formation. In our study, DMF was capable of extracting pigments without enabling the conversion of chlorophyll to chlorophyllide in Arabidopsis, however, for the other species which we have tested in this study, DMF cannot completely suppress the activity of CLH. Collectively, all three methods (boiling leaf sample, freezing leaf samples in liquid nitrogen with the use of pre-cooled acetone, and the use of DMF as an extraction agent) were superior to the methods only using 80% or pure acetone for the extraction of photosynthetic pigments. It is important to understand advantages and disadvantages of each method and choose an appropriate one for each plant species and for the purpose of pigment analysis.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

ไม่มีการรายงานว่า เอนไซม์ hydrolase, chlorophyllase (CLH) catalyzes การก่อตัวของ chlorophyllide ในระหว่างการสกัดผง [17] (รูปที่ 1A) เอนไซม์นี้เป็นปกติมั่นคงในความเข้มข้นสูงของหรือสารทำละลายอินทรีย์เช่นอะซีโตนอควี 50-70% [18,19] ต้นไม้สูงประกอบด้วยหนึ่ง หรือสอง isoforms ของเอนไซม์นี้ [20] และ Arabidopsis มีสอง CLH isoforms เข้า โดยยีน CLH1 และ CLH2 ตามลำดับ [21] CLH1 จแมป isoform ของ CLH ที่ออกจากบัญชีสำหรับส่วนใหญ่ของ CLH ใน Arabidopsis CLH1 ยีนเป็นอย่างมาก upregulated โดย methyl-jasmonate (MeJA), phytohormone ที่เป็นสื่อกลางต่าง ๆ biotic และ abiotic signaling มนต์ [22] ในทางตรงกันข้าม CLH2 แสดงเป็น constitutively และแสดงเพียง เศษส่วนเล็กน้อยของกิจกรรม CLH [23] ในการศึกษาปัจจุบัน เราประเมินจำนวน chlorophyllide จะเกิดขึ้นในระหว่างการสกัดผงเทียบกับปริมาณที่เกิดขึ้นตามธรรมชาติในใบไม้ ในการวิเคราะห์ต่อไป เราแล้วตรวจสอบว่า CLH เกี่ยวข้องในผู้แต่ง chlorophyllide ในระหว่างการสกัด โดยการเปรียบเทียบของผู้แต่งในใบไม้ชนิดป่าและการ mutant Arabidopsis ซึ่งขาดสารในกิจกรรม CLH โดยรวม การทดลองเหล่านี้ระบุว่า ส่วนใหญ่ของ chlorophyllide ที่พบในสารสกัดที่ได้รับโดยใช้อะซีโตน 80% หรืออะซิโตนบริสุทธิ์ผลิตระหว่างผงสกัดผ่านปฏิกิริยากระบวน โดย CLH นอกจากนี้เรายังเปรียบเทียบสามวิธีของผงสกัดที่มีรายงานก่อนหน้านี้ในเอกสารประกอบการ เบคอนและโฮลเดน [17] รายงานว่า สามารถระงับกิจกรรม CLH โดยต้มใบเป็นระยะเวลา 5 นาที พวกเขายังระบุว่า อย่างไรก็ตาม ว่า รักษาเดือดยังเอา Mg2 + จากคลอโรฟิลล์ [17] ครั้ง เราพบว่า ในกรณีของ Arabidopsis ใบไม้ CLH สามารถถูกยกเลิก และ Mg2 + ออกจากคลอโรฟิลล์จะลดลงเมื่อมีต้มตัวอย่างสำหรับเพียง 5 วินาที ในวิธีการของ Schenk et al. [23], ใบไม้อยู่ล่างแรกเป็นผงในไนโตรเจนเหลว และสีถูกสกัดในอะซีโตนถูกบัฟเฟอร์ที่ระบายความร้อนด้วยการ −20 องศาเซลเซียสในเวลาต่อมา เราพบวิธีนี้มีประสิทธิภาพมากจำนวนตัวอย่างขนาดค่อนข้างเล็ก สุดท้าย เราทดสอบการใช้ N, N'-dimethylformamide (กรม) เป็นตัวแทนสกัดเพื่อขจัดการก่อตัวของ chlorophyllide ในระหว่างการเตรียมตัวอย่าง แม้ว่าโมแรนและ Porath [24] รายงานว่า คลอโรฟิลล์มีเสถียรภาพในตัวทำละลายนี้ พวกเขาไม่ได้ลักษณะผลของกรมก่อ chlorophyllide ในการศึกษาของเรา กรมมีความสามารถในการแยกสีโดยไม่มีการเปิดใช้งานการแปลงคลอโรฟิลล์ chlorophyllide ใน Arabidopsis อย่างไรก็ตาม ในอื่น ๆ ชนิดที่เราได้ทดสอบในการศึกษานี้ กรมไม่สมบูรณ์ระงับกิจกรรมของ CLH โดยรวม วิธีการสามทั้งหมด (ตัวอย่างใบ ตัวอย่างใบแช่แข็งในไนโตรเจนเหลวด้วยการใช้อะซิโตนเย็น ๆ ก่อน ใช้กรมเป็นตัวแทนสกัดเดือด) เหนือกว่าวิธีการใช้ 80% หรืออะซิโตนบริสุทธิ์สำหรับการสกัดสี photosynthetic จึงควรทำความเข้าใจข้อดีและข้อเสียของแต่ละวิธี และเลือกหนึ่งที่เหมาะสม สำหรับแต่ละชนิดพืช และ เพื่อการวิเคราะห์รงควัตถุ

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

ทีได้รับรายงานว่าเอนไซม์ hydrolase ที่ chlorophyllase (CLH) กระตุ้นการก่อตัวของ chlorophyllide ในระหว่างการสกัดสี [17] (รูปที่ 1A) เอนไซม์นี้เป็นความผิดปกติท​​ี่มีเสถียรภาพในระดับความเข้มข้นที่สูงของตัวทำละลายอินทรีย์เช่น 50-70% อะซีโตนน้ำ [18,19] พืชที่สูงขึ้นมีหนึ่งหรือสองไอโซฟอร์มของเอนไซม์นี้ [20] และ Arabidopsis มีสองไอโซฟอร์ม CLH เข้ารหัสโดย CLH1 และยีน CLH2 ตามลำดับ [21] CLH1 เข้ารหัสไอโซฟอร์มของ CLH ที่บัญชีสำหรับส่วนใหญ่ของ CLH ในใบ Arabidopsis CLH1 การแสดงออกของยีนคือ upregulated มีนัยสำคัญโดย methyl-jasmonate (เชื้อร) ซึ่งเป็น phytohormone mediating เส้นทางการส่งสัญญาณสิ่งมีชีวิตและ abiotic ต่างๆ [22] ในทางตรงกันข้าม CLH2 จะแสดง constitutively และแสดงให้เห็นถึงเพียงส่วนเล็ก ๆ น้อย ๆ ของกิจกรรม CLH [23] ในการศึกษาปัจจุบันเราประเมินเท่าใด chlorophyllide จะเกิดขึ้นในระหว่างการสกัดสีเมื่อเทียบกับจำนวนเงินที่เกิดขึ้นตามธรรมชาติในใบ ในการวิเคราะห์ที่ตามมาจากนั้นเราจะตรวจสอบหรือไม่ว่า CLH มีส่วนร่วมในการก่อ chlorophyllide ในระหว่างการสกัดโดยการเปรียบเทียบการสร้างในใบของป่าชนิดและกลายพันธุ์ Arabidopsis ซึ่งเป็นกิจกรรมที่ขาด CLH โดยรวมแล้วการทดลองเหล่านี้ชี้ให้เห็นว่าส่วนใหญ่ของ chlorophyllide ตรวจพบในสารสกัดที่ได้รับโดยใช้อะซีโตน 80% หรืออะซีโตนบริสุทธิ์ที่ผลิตในระหว่างการสกัดสีผ่านปฏิกิริยาเร่งปฏิกิริยาด้วย CLH นอกจากนี้เรายังเทียบสามวิธีที่แตกต่างกันของการสกัดสีที่ได้รับการรายงานก่อนหน้านี้ในวรรณคดี เบคอนและโฮลเดน [17] รายงานว่ากิจกรรม CLH อาจจะถูกระงับโดยการต้มใบระยะเวลา 5 นาที พวกเขายังชี้ให้เห็นว่าการรักษาเดือดยังเอา Mg2 + จากคลอโรฟิล [17] เราพบว่าในกรณีของใบ Arabidopsis ที่ CLH สามารถใช้งานและการกำจัด Mg2 + จากคลอโรฟิลจะลดลงเมื่อตัวอย่างที่ถูกต้มเพียง 5 วินาที ในวิธีการของ Schenk et al, [23] ใบมาบดเป็นผงเป็นครั้งแรกในไนโตรเจนเหลวและสีถูกสกัดในภายหลังอะซีโตนบัฟเฟอร์เย็นถึง -20 องศาเซลเซียส เราพบว่าวิธีนี้มีประสิทธิภาพมากเมื่อการประมวลผลเป็นจำนวนที่ค่อนข้างเล็กของตัวอย่าง สุดท้ายเราผ่านการทดสอบการใช้งานของ N, n 'dimethylformamide (DMF) เป็นตัวแทนสกัดที่จะกำจัดการก่อตัวของ chlorophyllide ในระหว่างการเตรียมตัวอย่าง แม้ว่าโมแรนและ Porath [24] รายงานว่าคลอโรฟิลมีเสถียรภาพในตัวทำละลายนี้พวกเขาไม่ได้เป็นลักษณะผลของกรมเชื้อเพลิงธรรมชาติใน chlorophyllide ก่อ ในการศึกษาของเรา DMF คือความสามารถในการสกัดเม็ดสีโดยไม่เปิดใช้แปลงของคลอโรฟิลที่จะ chlorophyllide ใน Arabidopsis แต่สำหรับสายพันธุ์อื่น ๆ ที่เราได้ผ่านการทดสอบในการศึกษาครั้งนี้กรมเชื้อเพลิงธรรมชาติไม่สมบูรณ์ปราบปรามกิจกรรมของ CLH เรียกรวมกันทั้งสามวิธี (ตัวอย่างใบต้มแช่แข็งตัวอย่างใบในไนโตรเจนเหลวที่มีการใช้อะซิโตนก่อนระบายความร้อนและการใช้งานของกรมเชื้อเพลิงธรรมชาติเป็นตัวแทนสกัดที่) เป็นดีกว่าวิธีการที่ใช้เพียง 80% หรืออะซีโตนบริสุทธิ์สำหรับการสกัด ของเม็ดสีสังเคราะห์ มันเป็นสิ่งสำคัญที่จะเข้าใจข้อดีและข้อเสียของแต่ละวิธีและเลือกหนึ่งที่เหมาะสมสำหรับแต่ละสายพันธุ์พืชและเพื่อวัตถุประสงค์ในการวิเคราะห์สี

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

ไม่ มีรายงานว่า ไฮโดรเลสเอนไซม์คลอโรฟิลเลส ( clh ) และการก่อตัวของคลอโรฟิลไลด์ในการสกัดรงควัตถุ [ 17 ] ( รูปที่ 1A ) เอนไซม์นี้เป็นมั่นคง ผิดปกติในความเข้มข้นสูงของตัวทำละลายอินทรีย์เช่น 50-70% สารละลายอะซิโตน [ 18,19 ] พืชชั้นสูงประกอบด้วยหนึ่งหรือสองไอโซฟอร์มของเอนไซม์ [ 20 ] และ Arabidopsis ได้สองต่อ และ clh2 clh1 clh เข้ารหัสโดยยีนตามลำดับ [ 21 ] clh1 encodes ไอโซฟอร์มของ clh ที่บัญชีสำหรับส่วนใหญ่ของ clh ใน Arabidopsis ใบ clh1 ยีน เป็นอย่าง upregulated โดยเมทิลจั มเนต ( ตาราง ) , phytohormone ไกล่เกลี่ยต่างๆการสัญญาณเซลล์สิ่งมีชีวิต [ 22 ] ในทางตรงกันข้าม clh2 เป็น constitutively แสดงเท่านั้น และใช้แทนเศษส่วนย่อยของกิจกรรม clh [ 23 ] ในการศึกษาครั้งนี้เราประเมินคลอโรฟิลไลด์เท่าไหร่จะเกิดขึ้นในระหว่างการสกัดรงควัตถุเมื่อเทียบกับปริมาณที่เกิดขึ้นตามธรรมชาติในใบ ในการวิเคราะห์ที่ตามมา เราจึงตรวจสอบหรือไม่ clh มีส่วนร่วมในการสร้างคลอโรฟิลไลด์ระหว่างการสกัด โดยเปรียบเทียบการเกิดของมันในใบยาและ Arabidopsis กลายพันธุ์ซึ่งขาดกิจกรรม clh . โดยรวมแล้วการทดลองนี้แสดงให้เห็นว่าส่วนใหญ่ของคลอโรฟิลไลด์ที่ตรวจพบสารสกัดที่ได้ใช้อะซิโตน 80% หรือบริสุทธิ์สำหรับผลิตระหว่างการสกัดสีจากปฏิกิริยาที่เร่งปฏิกิริยาด้วย clh . เราเปรียบเทียบสามวิธีที่แตกต่างกันของการสกัดรงควัตถุที่ก่อนหน้านี้มีรายงานในวรรณคดีเบคอนและโฮลเด้น [ 17 ] รายงานว่า กิจกรรม clh สามารถหยุดยั้งโดยการต้มใบเป็นระยะเวลา 5 นาที พวกเขายังพบ แต่ที่เดือดรักษายังเอา mg2 จากคลอโรฟิลล์ [ 17 ] เราพบว่า ในกรณีของ Arabidopsis ใบ clh สามารถยับยั้ง mg2 คลอโรฟิลล์และการกำจัดจะลดลงเมื่อจำนวนต้มแค่ 5 วินาทีในวิธีการของแชงก์ et al . [ 23 ] ใบแรกพื้นดินเป็นผงในไนโตรเจนเหลวและสี จัดการสกัดอะซีโตนในนี้เย็น− 20 องศา เราพบว่าวิธีนี้เป็นวิธีที่มีประสิทธิภาพมากเมื่อผลิตเป็นจำนวนที่ค่อนข้างเล็กของตัวอย่าง สุดท้าย เราได้ทดสอบการใช้ไนโตรเจนN ' - การล้างพิษ ( DMF ) เป็นสารสกัด กำจัดการก่อตัวของคลอโรฟิลไลด์ระหว่างการเตรียมตัวอย่าง และถึงแม้ว่าส่วนใหญ่ porath [ 24 ] รายงานว่า คลอโรฟิลล์ มีเสถียรภาพในตัวทำละลาย มีลักษณะผลของ DMF ในการสร้างคลอโรฟิลไลด์ . ในการศึกษาของเราDMF สามารถสกัดสี โดยไม่ทำให้การแปลงของคลอโรฟิลล์กับคลอโรฟิลไลด์ใน Arabidopsis อย่างไรก็ตาม ชนิดอื่น ๆที่เราได้ทดสอบในการศึกษานี้ไม่สามารถยับยั้งกิจกรรมของ DMF clh . โดยรวมแล้ว ทั้ง 3 วิธี ( พร้อมตัวอย่าง , ตัวอย่างใบใบแช่แข็งในไนโตรเจนเหลวด้วยการใช้ pre ด้วยอะซีโตนและใช้เป็นสาร DMF ตัวแทน ) เหนือกว่าวิธีการที่ใช้แค่ 80% หรือบริสุทธิ์อะซิโตนสำหรับการสกัดรงควัตถุสังเคราะห์แสง . มันเป็นสิ่งสำคัญที่จะเข้าใจข้อดีและข้อเสียของแต่ละวิธี และเลือกหนึ่งที่เหมาะสมสำหรับพืชแต่ละชนิด และมีวัตถุประสงค์เพื่อวิเคราะห์สี