Cell-free protein synthesis (CFPS)

Cell-free protein synthesis (CFPS) is widely used for the production of in vivo cytotoxic, regulatory, or unstable proteins that are difficult to express in living cells [1, 2, 3] and for the incorporation of unnatural amino acids into protein polypeptides [4, 5, 6]. Also, CFPS can be applied for high-throughput screening of target proteins [7, 8], functional tool for proteomics [7, 9], and the development of point-of-care medicines [10, 11]. Also, CFPS is the fastest method to produce a desired protein within one day [9, 12].

Protein synthesis is an energy-intensive process. The primary energy source ATP is regenerated from the secondary energy source through substrate phosphorylation in CFPS [13]. Common secondary energy compounds such as creatine phosphate, phosphoenolpyruvate (PEP), acetate phosphate, glucose-6-phosphate (G6P), 3-phosphoglycerate, and fructose-1,6-biphosphate, contain high-energy phosphate bonds for regenerating ATP. Consequently, ATP regeneration accompanied with the consumption of phosphate-containing substrate leads to an increase in inorganic phosphate. High concentrations of inorganic phosphate severely impair protein biosynthesis, likely due to precipitation of free magnesium ions [14, 15]. Magnesium ions are essentially important for nucleoside triphosphate synthesis, protein translation, and translation termination [16, 17].

In order to mitigate the accumulation of free phosphate, Swartz and his coworkers have studied the replacement of costly phosphate-containing secondary energy compounds by using phosphate-free secondary energy compounds (e.g., glucose or pyruvate) [18, 19]. Pyruvate, an end product of glycolysis, coupled with the Pediococcus sp. pyruvate oxidase, catalase, and acetate kinase to produce one ATP per pyruvate without accumulation of phosphate can be used for long-time CFPS [19]. Further improvements in utilizing glucose through the glycolytic pathway to acetate and lactate have been achieved for more efficient ATP regeneration [14, 18, 20]. Figure 1 shows that glucose and G6P can produce two and three ATP, respectively, through glycolysis to pyruvate. Extra ATP can be produced through the PANOx system with addition of nicotinamide adenine dinucleotide (NAD+) and coenzyme A (CoA) that help convert pyruvate to acetate and lactate. In addition, glucose as the secondary energy source is much less expensive than any phosphate-containing compounds or phosphate-free pyruvate [18].

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

สังเคราะห์โปรตีนฟรีเซลล์ (CFPS) ใช้กันอย่างแพร่หลาย สำหรับการผลิตโปรตีน cytotoxic ระเบียบ หรือไม่เสถียรในสัตว์ทดลองที่ยากต่อการแสดงในเซลล์ชีวิต [1, 2, 3] และ การรวมตัวกันของกรดอะมิโนผิดธรรมชาติเป็นพอลิเปปไทด์โปรตีน [4, 5, 6] ยัง CFPS สามารถใช้ความเร็วสูงตรวจโปรตีนเป้าหมาย [7, 8], เครื่องมือสำหรับรตีโอมิกส์ [7, 9], และการพัฒนายาของการดูแล [10, 11] นอกจากนี้ CFPS เป็นวิธีที่เร็วที่สุดในการผลิตโปรตีนที่ต้องการภายใน 1 วัน [9, 12]สังเคราะห์โปรตีนเป็นกระบวนการที่พลังงานสูง แหล่งพลังงานหลัก ATP ที่สร้างจากแหล่งรองผ่านพื้นผิว phosphorylation ใน CFPS [13] พลังงานสำรองทั่วไปสารประกอบเช่น creatine ฟอสเฟต phosphoenolpyruvate (เผ็ดร้อน), ฟอสเฟตอะซิเตท กลูโคส-6-ฟอสเฟต (G6P), 3 phosphoglycerate และฟรักโทสปริมาณฟลักซ์ 1.6 biphosphate ประกอบด้วยพันธบัตรฟอสเฟตพลังงานสูง ATP หรับ ดังนั้น สร้างใหม่หรือ ATP พร้อมของฟอสเฟตที่ประกอบด้วยพื้นผิวเป้าหมายการเพิ่มฟอสเฟตอนินทรีย์ ความเข้มข้นสูงของอนินทรีย์ฟอสเฟตรุนแรงทำการสังเคราะห์โปรตีน เพราะฝนของไอออนแมกนีเซียมฟรี [14, 15] แมกนีเซียมมีความสำคัญหลักสำหรับการสังเคราะห์ nucleoside triphosphate โปรตีนแปล และการเลิกจ้างแปล [16, 17]เพื่อลดการสะสมของฟอสเฟตฟรี Swartz และเพื่อนร่วมงานของเขาได้ศึกษาการแทนที่ค่าใช้จ่ายฟอสเฟตที่ประกอบด้วยพลังงานรองสารประกอบ โดยใช้สารประกอบพลังงานฟรีฟอสเฟตรอง (เช่น กลูโคสหรือ pyruvate) [18, 19] Pyruvate ผลิตภัณฑ์สิ้นสุดของ glycolysis ควบคู่ไปกับ Pediococcus oxidase pyruvate เอสพี catalase และอะซิเตทไคเนสผลิต ATP ต่อ pyruvate ไม่สะสมของฟอสเฟตสามารถใช้ได้สำหรับ CFPS นาน [19] ปรับปรุงเพิ่มเติมในการใช้น้ำตาลกลูโคสผ่านทางเดิน glycolytic อะซิเตทและน้ำนมได้รับความสำหรับเพิ่มประสิทธิภาพสร้าง ATP [14, 18, 20] รูปที่ 1 แสดงว่า กลูโคสและ G6P สามารถผลิต ATP และ ตามลำดับ ผ่าน glycolysis การ pyruvate สามารถผลิต ATP เพิ่มเติมผ่านระบบ PANOx ด้วย nicotinamide dinucleotide คือ (NAD +) และ coenzyme A (CoA) ที่ช่วยแปลง pyruvate อะซิเตท และแล กลูโคสเป็นแหล่งพลังงานสำรองมีราคาแพงมากน้อยกว่าสารประกอบที่ประกอบด้วยฟอสเฟตหรือฟรีฟอสเฟต pyruvate [18]

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

ปราศจากเซลล์สังเคราะห์โปรตีน (CFPS) ถูกนำมาใช้กันอย่างแพร่หลายสำหรับการผลิตในร่างกายพิษกฎระเบียบหรือโปรตีนที่ไม่แน่นอนว่าเป็นเรื่องยากที่จะแสดงในเซลล์ที่มีชีวิต [1, 2, 3] และสำหรับการรวมตัวของกรดอะมิโนที่เป็นธรรมชาติเข้า polypeptides โปรตีน [4, 5, 6] นอกจากนี้ CFPS สามารถนำมาใช้สำหรับการคัดกรองสูง throughput ของโปรตีนเป้าหมาย [7, 8] เครื่องมือการทำงานสำหรับโปรตีน [7, 9] และการพัฒนาของจุดของการดูแลยา [10, 11] นอกจากนี้ CFPS เป็นวิธีที่เร็วที่สุดในการผลิตโปรตีนต้องการภายในหนึ่งวัน [9, 12]. การสังเคราะห์โปรตีนเป็นกระบวนการที่ใช้พลังงานมาก เอทีพีแหล่งพลังงานหลักจะสร้างใหม่จากแหล่งพลังงานรองผ่านพื้นผิว phosphorylation ใน CFPS [13] สารประกอบที่พบบ่อยพลังงานรองเช่นฟอสเฟต creatine, phosphoenolpyruvate (PEP) ฟอสเฟต acetate กลูโคส -6- ฟอสเฟต (G6P) 3-phosphoglycerate และฟรุกโตส-1,6-biphosphate ประกอบด้วยพันธบัตรฟอสเฟตพลังงานสูงสำหรับ regenerating เอทีพี ดังนั้นเอทีพีฟื้นฟูพร้อมกับการบริโภคของพื้นผิวที่มีส่วนผสมของฟอสเฟตจะนำไปสู่การเพิ่มขึ้นของฟอสเฟตนินทรีย์ ความเข้มข้นสูงของนินทรีย์ฟอสเฟตชำรุดอย่างรุนแรงการสังเคราะห์โปรตีนน่าจะเกิดจากการตกตะกอนของแมกนีเซียมไอออนฟรี [14, 15] แมกนีเซียมไอออนที่มีความสำคัญเป็นหลักสำหรับการสังเคราะห์ nucleoside triphosphate แปลโปรตีนและการเลิกจ้างแปล [16 17]. เพื่อลดการสะสมของฟอสเฟตฟรี Swartz และเพื่อนร่วมงานของเขามีการศึกษาการเปลี่ยนค่าใช้จ่ายฟอสเฟตที่มีสารประกอบพลังงานรองโดยใช้ ปราศจากสารฟอสเฟตสารรองพลังงาน (เช่นกลูโคสหรือไพรู) [18 19] ไพรูผลิตภัณฑ์ท้ายของ glycolysis ควบคู่กับ Pediococcus SP เอนไซม์ไพรู catalase และไคเนสอะซิเตทในการผลิตหนึ่งเอทีพีต่อไพรูโดยไม่ต้องมีการสะสมของฟอสเฟตสามารถใช้สำหรับการเป็นเวลานาน CFPS [19] การปรับปรุงเพิ่มเติมในการใช้กลูโคสผ่านทางเดิน glycolytic เพื่อ acetate และแลคเตทได้รับการประสบความสำเร็จในการฟื้นฟูสำหรับเอทีพีมีประสิทธิภาพมากขึ้น [14, 18, ​​20] รูปที่ 1 แสดงให้เห็นว่าน้ำตาลกลูโคสและ G6P สามารถผลิตสองและสามเอทีพีตามลำดับผ่าน glycolysis เพื่อไพรู เอทีพีพิเศษที่สามารถผลิตได้ผ่านระบบ PANOx ด้วยนอกเหนือจาก dinucleotide adenine Nicotinamide (NAD +) และ Coenzyme A (COA) ที่ช่วยแปลงไพรูเพื่อ acetate และให้น้ำนม นอกจากนี้ยังมีน้ำตาลกลูโคสเป็นแหล่งพลังงานที่สองคือมากน้อยราคาแพงกว่าใด ๆ หรือสารประกอบฟอสเฟตฟรีไพรูฟอสเฟตที่มีส่วนผสมของ [18]

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

ฟรีเซลล์สังเคราะห์โปรตีน ( cfps ) ถูกใช้อย่างกว้างขวางในการผลิตในร่างกายเป็นพิษซึ่งไม่แน่นอน , หรือโปรตีนที่ยากที่จะแสดงออกในเซลล์ที่มีชีวิต [ 1 2 3 ] และสำหรับการรวมตัวกันของกรดอะมิโนในโปรตีนโปรตีนธรรมชาติ [ 4 , 5 , 6 ] นอกจากนี้ cfps สามารถใช้เพื่อช่วยคัดกรองของโปรตีนเป้าหมาย [ 7 , 8 ] เครื่องมือใช้งานสำหรับโปรตีโอมิกส์ [ 7 , 9 ] , และการพัฒนาของจุดของการดูแลยา [ 10 , 11 ] นอกจากนี้ cfps เป็นวิธีเร็วที่สุดเพื่อผลิตโปรตีนที่ต้องการภายในวันเดียว [ 9 , 10 ]การสังเคราะห์โปรตีนเป็นพลังงานเร่งรัดกระบวนการ เอทีพีเป็นแหล่งพลังงานหลักที่ได้จากแหล่งพลังงานทุติยภูมิผ่านพื้นผิวฟอสโฟริเลชันใน cfps [ 13 ] สารพลังงานทุติยภูมิที่พบบ่อยเช่น creatine ฟอสเฟต , ฟอสโฟอีนอลไพรูเวต ( PEP ) , ฟอสเฟต , glucose-6-phosphate ( g6p ) 3-phosphoglycerate และ fructose-1,6-biphosphate ประกอบด้วยพันธะฟอสเฟตสำหรับ regenerating พลังงาน ATP . ดังนั้น การฟื้นฟู เอทีพี พร้อมกับการบริโภคฟอสเฟตที่มีพื้นผิว นำไปสู่การเพิ่มขึ้นในอนินทรีย์ฟอสเฟต ความเข้มข้นสูงของอนินทรีย์ฟอสฟอรัสลดลงอย่างรุนแรงในโปรตีน อาจเนื่องจากการตกตะกอนของไอออนแมกนีเซียมฟรี [ 14 , 15 ) แมกนีเซียมไอออนเป็นหลักสำคัญสำหรับนิวคลิโอไซด์ ไตรฟอสเฟตการสังเคราะห์ โปรตีนแปล และแปลเอกสารสิ้นสุด [ 16 , 17 )เพื่อลดการสะสมของฟอสเฟตฟรี Swartz และเพื่อนร่วมงานของเขาได้ศึกษาการก่อสารประกอบฟอสเฟตพลังงานทุติยภูมิ โดยใช้สารประกอบฟอสเฟตฟรีพลังงานทุติยภูมิ เช่น กลูโคส หรือ pyruvate ) [ 18 , 19 ) ไพรูเวทผลิตภัณฑ์สุดท้ายของไกลโคไลซิส คู่กับ 3 sp . ไพรูเอนไซม์คาตาเลส และ acetate kinase ที่จะผลิต ATP ต่อไพรูเวทโดยไม่สะสมฟอสเฟตสามารถใช้ได้นาน cfps [ 19 ] การปรับปรุงเพิ่มเติมในการใช้กลูโคสผ่านทางเดิน glycolytic ไปอะซิเตท และแลคเตทได้สําเร็จได้อย่างมีประสิทธิภาพมากขึ้น เอทีพี การฟื้นฟู [ 14 , 18 , 20 ] รูปที่ 1 แสดงให้เห็นว่า กลูโคส และ g6p สามารถผลิตสองและสาม เอทีพี ตามลำดับ ผ่านไกลโคไลซิสเพื่อ pyruvate . เพิ่ม ATP สามารถผลิตได้ผ่านระบบ panox ด้วยนอกเหนือจากพยุหยาตรา ( NAD + ) และโคเอนไซม์ ( COA ) ที่ช่วยเปลี่ยนไพรูเวตจะแลคเตท และ . นอกจากนี้ กลูโคสเป็นแหล่งพลังงานทุติยภูมิมีมากน้อยราคาแพงกว่าสารประกอบฟอสเฟตฟอสเฟตหรือไพรูฟรี [ 18 ]