- ข้อความ
- ประวัติศาสตร์
Collection and preservation of pre-
Collection and preservation of pre-immunized serum
For production of antisera 3-4 month-old white rabbit (2.5 -
3 kg) were selected and kept in separate cage and
labeled properly. The pre-immunized sera of the rabbit
used for the test were collected before 7 days of
immunization with different a ntigens to confirm that the
rabbit did not contain any antisera. The sterilized tube
containing fresh drawn blood was kept at room
temperature for 1-2 h for clot formation. The clots was
stirred with glass rod and was kept overnight in
refrigerator to allow the clot contraction. The plasma were
centrifuged (3000 rpm, 15 min). The straw-coloured serum
was withdrawn into a sterilized centrifuge tube which was
labeled properly. For preservation of serum, it was added
with 0.02 % sodium azide (NaNH2) to give a final
concentration of 1:5000 and kept in a deep freeze at -20
ฐC for further use.
Serological test
Preparation of whole cell antigen: The antigen was
prepared from the freshly grown bacterial cultures. The
bacteria were cultured on NSA medium in test tube at 27ฐC for 24 h. The test tube was filled with PBS or saline water.
The culture was scraped with sterilized inoculation
needle. The scraped bacteria with saline water were
transferred to the centrifuge tube. The bacterial growth
was mixed thoroughly with the help of a vortex mixture to
make it completely homogenized. The whole cell of
bacteria was centrifuged (3000 rpm, 30 min, room
temperature). The supernatant was discarded and the
pellet was re-suspended with saline water and
centrifuged. The process was repeated three times to
make the bacteria free from any foreign material. After the
last centrifugation bacteria were re-suspended in normal
saline/butler saline, collected in sterilized specimen tube,
labeled properly, preserved and stored in deep freeze at -
20 ฐC for further use.
Preparation of antigen for agglutination test: The
antigens were prepared by suspending live bacteria in
buffer saline as described earlier except that the antigen
prepared was more concentrated having an optical
density of 0.5 using a Gallen Kamp colorimeter at 520
mm.
Immunization of rabbits for antisera production and
harvesting of immunized serum: The rabbits were
immunized by intra-muscular and intravenous injections.
Both right and left legs were used for intra-muscular
injection. In case of intravenous injection, marginal vein of
ear was used. Three doses of antigen (0.5 mL, 1.0 mL,
and 1.5 mL) were injected intra-muscularly at four days
interval. Acetone was used to dilate the vein. The
designed quantity was injected slowly into the blood
system. A booster injection was given 4 days after the last
injection to accelerate antibody production. Five or seven
days after the booster injection, the rabbits were held by
cardiac puncture for collection of antisera. The procedure
of collection of blood separation and preservation of
antiserum was the same as described earlier.
Antigen-antibody reaction tests: Mixture of antigen and
antibody showing positive reaction resulted in the
formation of precipitation due to binding of antibodies with
their respective antigens. Two different serological tests
were conducted to record the precipitations or positive
reaction of antigen and antibodies. The gel diffusion test
was performed following the method as originally
described by Ouchterlony (1958, 1962) while the tube
agglutination test was carried out for homologous and
heterologous antigens using a national standard method
(NHS, 2010).
Antibiotic sensitivity test
Antibiotic sensitivity test of the identified bacteria were
repeated 3 times for each strain using 10 different
antibiotics namely norfloxacin, tetracycline, ciprofloxacin,
neomycin, nalidixic acid, ofloxacin, chloramphenicol,
nitrofurantoin, streptomycin and amoxicillin (Hi- Media,
Mumbai, India) by disc diffusion method (Bauer et al.,1966). Antibiotic activity was measured in terms of zoneinhibition (mm diameter).
Plasmid DNA isolation and agarose gel
electrophoresis
The alkaline-lysis mini-prep method (Wizard Plus
Minipreps DNA Purification Systems, Promega, USA) was
used for plasmid extraction from all the four bacterial
isolates. Overnight-grown bacterial cultures (3-5 mL) were
pelleted by centrifugation (10,000 x g, 10 min),
supernatant decanted and pellet re-suspended in 300 OL
of Cell Re-suspension Solution (50 mM Tris, pH 7.5; 10
mM EDTA; 100 Og/mL RNase A). The re-suspended cells
were transferred to 1.5 mL micro-centrifuged tube to
which 300 OL of Cell Lysis Solution (0.2 M NaOH, 1 %
SDS) was added and samples thoroughly mixed. To the
cleared lysate 300 OL of Neutralization Solution (1.32 M
potassium acetate, pH 4.8) was added and mixed
properly. The lysate was centrifuged (10,000 x g, 5 min)
and plasmid purification was carried out using the vacuum
manifold (Promega Vac-Man, USA). The purified samples
were electrophoresed using 0.7 – 1.0 % agarose gel
followed by ethidium bromide (0.5 Og/mL) staining
(Sambrook et al., 1989). Electrophoresis was carried out
in 1 x Tris borate-EDTA (TBE) buffer at 120 V for 3 h or
until the loading dye (Genie-Merck, Bangalore, India)
neared the bottom of the gel. Gels were visualized and
photographed under GEL DOC XR SYSTEM (Bio-Rad,
USA).
For production of antisera 3-4 month-old white rabbit (2.5 -
3 kg) were selected and kept in separate cage and
labeled properly. The pre-immunized sera of the rabbit
used for the test were collected before 7 days of
immunization with different a ntigens to confirm that the
rabbit did not contain any antisera. The sterilized tube
containing fresh drawn blood was kept at room
temperature for 1-2 h for clot formation. The clots was
stirred with glass rod and was kept overnight in
refrigerator to allow the clot contraction. The plasma were
centrifuged (3000 rpm, 15 min). The straw-coloured serum
was withdrawn into a sterilized centrifuge tube which was
labeled properly. For preservation of serum, it was added
with 0.02 % sodium azide (NaNH2) to give a final
concentration of 1:5000 and kept in a deep freeze at -20
ฐC for further use.
Serological test
Preparation of whole cell antigen: The antigen was
prepared from the freshly grown bacterial cultures. The
bacteria were cultured on NSA medium in test tube at 27ฐC for 24 h. The test tube was filled with PBS or saline water.
The culture was scraped with sterilized inoculation
needle. The scraped bacteria with saline water were
transferred to the centrifuge tube. The bacterial growth
was mixed thoroughly with the help of a vortex mixture to
make it completely homogenized. The whole cell of
bacteria was centrifuged (3000 rpm, 30 min, room
temperature). The supernatant was discarded and the
pellet was re-suspended with saline water and
centrifuged. The process was repeated three times to
make the bacteria free from any foreign material. After the
last centrifugation bacteria were re-suspended in normal
saline/butler saline, collected in sterilized specimen tube,
labeled properly, preserved and stored in deep freeze at -
20 ฐC for further use.
Preparation of antigen for agglutination test: The
antigens were prepared by suspending live bacteria in
buffer saline as described earlier except that the antigen
prepared was more concentrated having an optical
density of 0.5 using a Gallen Kamp colorimeter at 520
mm.
Immunization of rabbits for antisera production and
harvesting of immunized serum: The rabbits were
immunized by intra-muscular and intravenous injections.
Both right and left legs were used for intra-muscular
injection. In case of intravenous injection, marginal vein of
ear was used. Three doses of antigen (0.5 mL, 1.0 mL,
and 1.5 mL) were injected intra-muscularly at four days
interval. Acetone was used to dilate the vein. The
designed quantity was injected slowly into the blood
system. A booster injection was given 4 days after the last
injection to accelerate antibody production. Five or seven
days after the booster injection, the rabbits were held by
cardiac puncture for collection of antisera. The procedure
of collection of blood separation and preservation of
antiserum was the same as described earlier.
Antigen-antibody reaction tests: Mixture of antigen and
antibody showing positive reaction resulted in the
formation of precipitation due to binding of antibodies with
their respective antigens. Two different serological tests
were conducted to record the precipitations or positive
reaction of antigen and antibodies. The gel diffusion test
was performed following the method as originally
described by Ouchterlony (1958, 1962) while the tube
agglutination test was carried out for homologous and
heterologous antigens using a national standard method
(NHS, 2010).
Antibiotic sensitivity test
Antibiotic sensitivity test of the identified bacteria were
repeated 3 times for each strain using 10 different
antibiotics namely norfloxacin, tetracycline, ciprofloxacin,
neomycin, nalidixic acid, ofloxacin, chloramphenicol,
nitrofurantoin, streptomycin and amoxicillin (Hi- Media,
Mumbai, India) by disc diffusion method (Bauer et al.,1966). Antibiotic activity was measured in terms of zoneinhibition (mm diameter).
Plasmid DNA isolation and agarose gel
electrophoresis
The alkaline-lysis mini-prep method (Wizard Plus
Minipreps DNA Purification Systems, Promega, USA) was
used for plasmid extraction from all the four bacterial
isolates. Overnight-grown bacterial cultures (3-5 mL) were
pelleted by centrifugation (10,000 x g, 10 min),
supernatant decanted and pellet re-suspended in 300 OL
of Cell Re-suspension Solution (50 mM Tris, pH 7.5; 10
mM EDTA; 100 Og/mL RNase A). The re-suspended cells
were transferred to 1.5 mL micro-centrifuged tube to
which 300 OL of Cell Lysis Solution (0.2 M NaOH, 1 %
SDS) was added and samples thoroughly mixed. To the
cleared lysate 300 OL of Neutralization Solution (1.32 M
potassium acetate, pH 4.8) was added and mixed
properly. The lysate was centrifuged (10,000 x g, 5 min)
and plasmid purification was carried out using the vacuum
manifold (Promega Vac-Man, USA). The purified samples
were electrophoresed using 0.7 – 1.0 % agarose gel
followed by ethidium bromide (0.5 Og/mL) staining
(Sambrook et al., 1989). Electrophoresis was carried out
in 1 x Tris borate-EDTA (TBE) buffer at 120 V for 3 h or
until the loading dye (Genie-Merck, Bangalore, India)
neared the bottom of the gel. Gels were visualized and
photographed under GEL DOC XR SYSTEM (Bio-Rad,
USA).
0/5000
เก็บรวบรวมและเก็บรักษาซีรั่มก่อน immunizedสำหรับการผลิตของ antisera 3-4 เดือน-กระต่ายขาวเก่า (2.5 -3 กิโลกรัม) ถูกเลือก และเก็บไว้ในกรงต่างหาก และชื่ออย่างถูกต้อง จะ immunized ก่อนเถาะใช้สำหรับการทดสอบถูกรวบรวมไว้ก่อน 7 วันรับวัคซีนพร้อม ntigens เพื่อยืนยันว่า การกระต่ายไม่ประกอบด้วย antisera ใด ๆ หลอด sterilizedประกอบด้วยเลือดสดออกถูกเก็บไว้ที่ห้องอุณหภูมิสำหรับ h 1-2 สำหรับก่อ clot Clots ถูกกวน ด้วยเหล็กแก้ว และถูกเก็บไว้ค้างคืนในตู้เย็นให้หดตัว clot พลาสมาถูกcentrifuged (3000 รอบต่อนาที 15 นาที) เซรั่ม straw-colouredถูกถอนในหลอด sterilized เครื่องหมุนเหวี่ยงที่ชื่ออย่างถูกต้อง สำหรับเก็บรักษาซีรั่ม ถูกเพิ่มด้วย 0.02% โซเดียม azide (NaNH2) ให้เป็นสุดท้ายความเข้มข้นของ 1:5000 และเก็บไว้ในเกมส์ที่ -20ฐC สำหรับใช้เพิ่มเติมทดสอบสภาวะจัดเตรียมการตรวจหาเซลล์ทั้งหมด: ตรวจหาได้เตรียมจากวัฒนธรรมแบคทีเรียสดปลูก ที่แบคทีเรียมีอ่างใน NSA ปานกลางในหลอดทดสอบที่ 27ฐC ใน 24 ชม หลอดทดสอบก็เต็มไป ด้วย PBS หรือน้ำเกลือวัฒนธรรมถูกขูดกับ sterilized inoculationเข็ม แบคทีเรีย scraped ด้วยน้ำเกลือได้โอนย้ายไปหลอดเครื่องหมุนเหวี่ยง การเจริญเติบโตของแบคทีเรียถูกผสมอย่างละเอียด โดยใช้ vortex ส่วนผสมการทำให้มันสมบูรณ์ homogenized เป็นกลุ่ม เซลล์ทั้งหมดของแบคทีเรียถูก centrifuged (3000 รอบต่อนาที 30 นาที ห้องพักอุณหภูมิ) Supernatant ถูกละทิ้งและเม็ดถูกเลื่อนออกไปอีกครั้ง ด้วยน้ำเกลือ และcentrifuged การถูกทำซ้ำสามครั้งเพื่อทำให้เชื้อแบคทีเรียจากวัสดุต่างประเทศใด ๆ หลังจากcentrifugation แบคทีเรียสุดท้ายถูกหยุดชั่วคราวในปกติอีกครั้งน้ำเกลือน้ำเกลือ/บริกร เก็บในหลอดตัวอย่าง sterilizedป้ายถูก รักษา และเก็บไว้ในเกมส์ที่-ฐC 20 สำหรับใช้เพิ่มเติมจัดเตรียมการตรวจหา agglutination ทดสอบ: การantigens ถูกเตรียม โดยระงับเชื้อแบคทีเรียที่อยู่ในบัฟเฟอร์น้ำเกลือตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ยกเว้นที่การตรวจหาเตรียมเข้มข้นมากขึ้นมีการออปติคอลความหนาแน่น 0.5 ใช้เครื่องไฮกัลเลนที่ 520มม.รับวัคซีนของกระต่าย antisera ผลิต และเก็บเกี่ยวซีรั่ม immunized: กระต่ายได้immunized โดยฉีดภายในกล้ามเนื้อ และฉีดขาซ้าย และขวาใช้สำหรับภายในกล้ามเนื้อฉีด ในกรณีที่ฉีดทางหลอดเลือดดำ หลอดเลือดดำกำไรของใช้หู 3 ปริมาณของตรวจหา (มล. 0.5, 1.0 mLและ 1.5 mL) ถูกฉีดที่สี่วัน intra-muscularlyช่วง อะซีโตนที่ใช้ถ่างหลอดเลือดดำ ที่ปริมาณออกถูกฉีดช้า ๆ ในเลือดระบบ ฉีดบูสเตอร์ให้ 4 วันหลังจากล่าสุดฉีดเพื่อเร่งผลิตแอนติบอดี ห้า หรือเจ็ดวันหลังจากฉีดบูสเตอร์ กระต่ายถูกจัดขึ้นโดยเจาะหัวใจสำหรับคอลเลกชันของ antisera ขั้นตอนการของเลือดแยกและเก็บรักษาของantiserum เหมือนกับที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ตรวจหาแอนติบอดีปฏิกิริยาทดสอบ: ส่วนผสมของการตรวจหา และแอนติบอดีที่แสดงปฏิกิริยาเชิงบวกทำให้เกิดการก่อตัวของฝนเนื่องจากผูกของแอนตี้ด้วยantigens ที่เกี่ยวข้องของพวกเขา สองทดสอบสภาวะต่าง ๆได้ดำเนินการบันทึก precipitations หรือบวกปฏิกิริยาของแอนตี้และตรวจหา ทดสอบเจลแพร่ทำตามวิธีการที่เป็นครั้งแรกโดย Ouchterlony (1958, 1962) ในขณะหลอดagglutination ทดสอบถูกดำเนินการสำหรับ homologous และantigens heterologous ที่ใช้วิธีการมาตรฐานแห่งชาติ(NHS, 2010)ทดสอบความไวต่อยาปฏิชีวนะทดสอบความไวต่อยาปฏิชีวนะของเชื้อแบคทีเรียที่ระบุได้ทำซ้ำ 3 ครั้งสำหรับแต่ละต้องใช้ใช้ 10 แตกต่างกันยาปฏิชีวนะได้แก่ norfloxacin เตตราไซคลีน ciprofloxacinนีโอมัยซิน กรดนาลิดิซิก ofloxacin, chloramphenicolnitrofurantoin, streptomycin และ amoxicillin (Hi - สื่อมุมไบ อินเดีย) โดยวิธีการแพร่ดิสก์ (Bauer et al., 1966) กิจกรรมยาปฏิชีวนะถูกวัด zoneinhibition (มม.เส้นผ่าศูนย์กลาง)Plasmid DNA agarose และแยกเจelectrophoresisวิธีเตรียมมินิ lysis ด่าง (ช่วยบวกสหรัฐอเมริการะบบฟอก DNA, Promega, Minipreps) ได้ใช้สำหรับสกัด plasmid จากแบคทีเรียสี่ทั้งหมดแยก มีแอร์พอร์ตโอเวอร์ไนท์โตแบคทีเรียวัฒนธรรม (3-5 mL)pelleted โดย centrifugation (10000 x g, 10 นาที),supernatant decanted และหยุดชั่วคราวอีกครั้งในแอล 300 เม็ดของเซลล์ใหม่ระงับ (50 มม.ตรี pH 7.5, 10mM EDTA ออก 100 mL RNase A) เซลล์ใหม่ระงับมีการถ่ายโอนการท่อไมโคร centrifuged 1.5 mL ไปOL ที่ 300 ของโซลูชันการ Lysis เซลล์ (0.2 M NaOH, 1%SDS) เข้ามา และตัวอย่างอย่างละเอียดผสม การล้างแอล 300 lysate ของปฏิกิริยาสะเทิน (1.32 Mเพิ่ม และผสมโพแทสเซียม acetate, pH 4.8)ถูกต้อง ที่ lysate ถูก centrifuged (10000 x g, 5 นาที)และฟอก plasmid ถูกดำเนินโดยใช้เครื่องดูดอเนก (Promega Vac แมน สหรัฐอเมริกา) ตัวอย่างบริสุทธิ์มี electrophoresed ใช้ 0.7 – 1.0% agarose เจลตาม ด้วยการย้อมสี (0.5 ออก/มล) โบรไมด์ ethidium(Sambrook et al., 1989) Electrophoresis ทำออกทริสเรทติ้ง x 1 borate-EDTA (TBE) บัฟเฟอร์ที่ 120 V สำหรับ 3 h หรือจนย้อมโหลด (ภูตเมอร์ค บังกาลอร์ อินเดีย)neared ด้านล่างของเจ เจมี visualized และถ่ายภาพภายใต้ระบบ XR DOC เจล (ไบ-Radสหรัฐอเมริกา)
การแปล กรุณารอสักครู่..
Collection and preservation of pre-immunized serum
For production of antisera 3-4 month-old white rabbit (2.5 -
3 kg) were selected and kept in separate cage and
labeled properly. The pre-immunized sera of the rabbit
used for the test were collected before 7 days of
immunization with different a ntigens to confirm that the
rabbit did not contain any antisera. The sterilized tube
containing fresh drawn blood was kept at room
temperature for 1-2 h for clot formation. The clots was
stirred with glass rod and was kept overnight in
refrigerator to allow the clot contraction. The plasma were
centrifuged (3000 rpm, 15 min). The straw-coloured serum
was withdrawn into a sterilized centrifuge tube which was
labeled properly. For preservation of serum, it was added
with 0.02 % sodium azide (NaNH2) to give a final
concentration of 1:5000 and kept in a deep freeze at -20
ฐC for further use.
Serological test
Preparation of whole cell antigen: The antigen was
prepared from the freshly grown bacterial cultures. The
bacteria were cultured on NSA medium in test tube at 27ฐC for 24 h. The test tube was filled with PBS or saline water.
The culture was scraped with sterilized inoculation
needle. The scraped bacteria with saline water were
transferred to the centrifuge tube. The bacterial growth
was mixed thoroughly with the help of a vortex mixture to
make it completely homogenized. The whole cell of
bacteria was centrifuged (3000 rpm, 30 min, room
temperature). The supernatant was discarded and the
pellet was re-suspended with saline water and
centrifuged. The process was repeated three times to
make the bacteria free from any foreign material. After the
last centrifugation bacteria were re-suspended in normal
saline/butler saline, collected in sterilized specimen tube,
labeled properly, preserved and stored in deep freeze at -
20 ฐC for further use.
Preparation of antigen for agglutination test: The
antigens were prepared by suspending live bacteria in
buffer saline as described earlier except that the antigen
prepared was more concentrated having an optical
density of 0.5 using a Gallen Kamp colorimeter at 520
mm.
Immunization of rabbits for antisera production and
harvesting of immunized serum: The rabbits were
immunized by intra-muscular and intravenous injections.
Both right and left legs were used for intra-muscular
injection. In case of intravenous injection, marginal vein of
ear was used. Three doses of antigen (0.5 mL, 1.0 mL,
and 1.5 mL) were injected intra-muscularly at four days
interval. Acetone was used to dilate the vein. The
designed quantity was injected slowly into the blood
system. A booster injection was given 4 days after the last
injection to accelerate antibody production. Five or seven
days after the booster injection, the rabbits were held by
cardiac puncture for collection of antisera. The procedure
of collection of blood separation and preservation of
antiserum was the same as described earlier.
Antigen-antibody reaction tests: Mixture of antigen and
antibody showing positive reaction resulted in the
formation of precipitation due to binding of antibodies with
their respective antigens. Two different serological tests
were conducted to record the precipitations or positive
reaction of antigen and antibodies. The gel diffusion test
was performed following the method as originally
described by Ouchterlony (1958, 1962) while the tube
agglutination test was carried out for homologous and
heterologous antigens using a national standard method
(NHS, 2010).
Antibiotic sensitivity test
Antibiotic sensitivity test of the identified bacteria were
repeated 3 times for each strain using 10 different
antibiotics namely norfloxacin, tetracycline, ciprofloxacin,
neomycin, nalidixic acid, ofloxacin, chloramphenicol,
nitrofurantoin, streptomycin and amoxicillin (Hi- Media,
Mumbai, India) by disc diffusion method (Bauer et al.,1966). Antibiotic activity was measured in terms of zoneinhibition (mm diameter).
Plasmid DNA isolation and agarose gel
electrophoresis
The alkaline-lysis mini-prep method (Wizard Plus
Minipreps DNA Purification Systems, Promega, USA) was
used for plasmid extraction from all the four bacterial
isolates. Overnight-grown bacterial cultures (3-5 mL) were
pelleted by centrifugation (10,000 x g, 10 min),
supernatant decanted and pellet re-suspended in 300 OL
of Cell Re-suspension Solution (50 mM Tris, pH 7.5; 10
mM EDTA; 100 Og/mL RNase A). The re-suspended cells
were transferred to 1.5 mL micro-centrifuged tube to
which 300 OL of Cell Lysis Solution (0.2 M NaOH, 1 %
SDS) was added and samples thoroughly mixed. To the
cleared lysate 300 OL of Neutralization Solution (1.32 M
potassium acetate, pH 4.8) was added and mixed
properly. The lysate was centrifuged (10,000 x g, 5 min)
and plasmid purification was carried out using the vacuum
manifold (Promega Vac-Man, USA). The purified samples
were electrophoresed using 0.7 – 1.0 % agarose gel
followed by ethidium bromide (0.5 Og/mL) staining
(Sambrook et al., 1989). Electrophoresis was carried out
in 1 x Tris borate-EDTA (TBE) buffer at 120 V for 3 h or
until the loading dye (Genie-Merck, Bangalore, India)
neared the bottom of the gel. Gels were visualized and
photographed under GEL DOC XR SYSTEM (Bio-Rad,
USA).
For production of antisera 3-4 month-old white rabbit (2.5 -
3 kg) were selected and kept in separate cage and
labeled properly. The pre-immunized sera of the rabbit
used for the test were collected before 7 days of
immunization with different a ntigens to confirm that the
rabbit did not contain any antisera. The sterilized tube
containing fresh drawn blood was kept at room
temperature for 1-2 h for clot formation. The clots was
stirred with glass rod and was kept overnight in
refrigerator to allow the clot contraction. The plasma were
centrifuged (3000 rpm, 15 min). The straw-coloured serum
was withdrawn into a sterilized centrifuge tube which was
labeled properly. For preservation of serum, it was added
with 0.02 % sodium azide (NaNH2) to give a final
concentration of 1:5000 and kept in a deep freeze at -20
ฐC for further use.
Serological test
Preparation of whole cell antigen: The antigen was
prepared from the freshly grown bacterial cultures. The
bacteria were cultured on NSA medium in test tube at 27ฐC for 24 h. The test tube was filled with PBS or saline water.
The culture was scraped with sterilized inoculation
needle. The scraped bacteria with saline water were
transferred to the centrifuge tube. The bacterial growth
was mixed thoroughly with the help of a vortex mixture to
make it completely homogenized. The whole cell of
bacteria was centrifuged (3000 rpm, 30 min, room
temperature). The supernatant was discarded and the
pellet was re-suspended with saline water and
centrifuged. The process was repeated three times to
make the bacteria free from any foreign material. After the
last centrifugation bacteria were re-suspended in normal
saline/butler saline, collected in sterilized specimen tube,
labeled properly, preserved and stored in deep freeze at -
20 ฐC for further use.
Preparation of antigen for agglutination test: The
antigens were prepared by suspending live bacteria in
buffer saline as described earlier except that the antigen
prepared was more concentrated having an optical
density of 0.5 using a Gallen Kamp colorimeter at 520
mm.
Immunization of rabbits for antisera production and
harvesting of immunized serum: The rabbits were
immunized by intra-muscular and intravenous injections.
Both right and left legs were used for intra-muscular
injection. In case of intravenous injection, marginal vein of
ear was used. Three doses of antigen (0.5 mL, 1.0 mL,
and 1.5 mL) were injected intra-muscularly at four days
interval. Acetone was used to dilate the vein. The
designed quantity was injected slowly into the blood
system. A booster injection was given 4 days after the last
injection to accelerate antibody production. Five or seven
days after the booster injection, the rabbits were held by
cardiac puncture for collection of antisera. The procedure
of collection of blood separation and preservation of
antiserum was the same as described earlier.
Antigen-antibody reaction tests: Mixture of antigen and
antibody showing positive reaction resulted in the
formation of precipitation due to binding of antibodies with
their respective antigens. Two different serological tests
were conducted to record the precipitations or positive
reaction of antigen and antibodies. The gel diffusion test
was performed following the method as originally
described by Ouchterlony (1958, 1962) while the tube
agglutination test was carried out for homologous and
heterologous antigens using a national standard method
(NHS, 2010).
Antibiotic sensitivity test
Antibiotic sensitivity test of the identified bacteria were
repeated 3 times for each strain using 10 different
antibiotics namely norfloxacin, tetracycline, ciprofloxacin,
neomycin, nalidixic acid, ofloxacin, chloramphenicol,
nitrofurantoin, streptomycin and amoxicillin (Hi- Media,
Mumbai, India) by disc diffusion method (Bauer et al.,1966). Antibiotic activity was measured in terms of zoneinhibition (mm diameter).
Plasmid DNA isolation and agarose gel
electrophoresis
The alkaline-lysis mini-prep method (Wizard Plus
Minipreps DNA Purification Systems, Promega, USA) was
used for plasmid extraction from all the four bacterial
isolates. Overnight-grown bacterial cultures (3-5 mL) were
pelleted by centrifugation (10,000 x g, 10 min),
supernatant decanted and pellet re-suspended in 300 OL
of Cell Re-suspension Solution (50 mM Tris, pH 7.5; 10
mM EDTA; 100 Og/mL RNase A). The re-suspended cells
were transferred to 1.5 mL micro-centrifuged tube to
which 300 OL of Cell Lysis Solution (0.2 M NaOH, 1 %
SDS) was added and samples thoroughly mixed. To the
cleared lysate 300 OL of Neutralization Solution (1.32 M
potassium acetate, pH 4.8) was added and mixed
properly. The lysate was centrifuged (10,000 x g, 5 min)
and plasmid purification was carried out using the vacuum
manifold (Promega Vac-Man, USA). The purified samples
were electrophoresed using 0.7 – 1.0 % agarose gel
followed by ethidium bromide (0.5 Og/mL) staining
(Sambrook et al., 1989). Electrophoresis was carried out
in 1 x Tris borate-EDTA (TBE) buffer at 120 V for 3 h or
until the loading dye (Genie-Merck, Bangalore, India)
neared the bottom of the gel. Gels were visualized and
photographed under GEL DOC XR SYSTEM (Bio-Rad,
USA).
การแปล กรุณารอสักครู่..
การเก็บและรักษาก่อนฉีดเซรั่ม
ผลิตแอนติ 3-4 เดือนกระต่ายเก่าสีขาว ( 2.5 -
3 กิโลกรัม ) สุ่มและเก็บไว้ในกรงแยก
ข้อความที่ถูกต้อง ก่อนการฉีดซีรั่มของกระต่าย
ที่ใช้สำหรับการทดสอบครั้งนี้ ก่อน 7 วันของการเป็น ntigens แตกต่างกัน
กระต่าย เพื่อยืนยันว่า ไม่ได้มีแอนติ . โดยหลอด
ประกอบด้วยสดวาดเลือดที่ถูกเก็บไว้ที่อุณหภูมิห้อง
1-2 H สำหรับการพัฒนาลิ่มเลือด ที่อุดตันอยู่
กวนด้วยแท่งแก้ว และถูกเก็บไว้ค้างคืนในตู้เย็นให้แข็งตัว
การหดตัว ระดับพลาสมาถูก
( 3000 รอบต่อนาที 15 นาที ) หลอดสี เซรั่ม
ถูกถอนไปฆ่าเชื้อหลอด centrifuge ซึ่ง
ข้อความที่ถูกต้อง สำหรับการเก็บรักษาเลือดมันเพิ่มด้วย
002 เดียมไซด์ ( nanh2 ) เพื่อให้ความเข้มข้นสุดท้าย
ของ 1:5000 และเก็บไว้ในลึกแช่แข็งที่ - 20 องศาเซลเซียส เพื่อการใช้งานต่อไป
.
เตรียมทดสอบระบบของแอนติเจนเซลล์ทั้งหมด : แอนติเจนคือ
เตรียมจากสด ๆโตแบคทีเรียวัฒนธรรม
แบคทีเรียถูกเพาะเลี้ยงในหลอดทดลองที่หน่วยข่าวกรองกลาง 27 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 24 ชั่วโมง หลอดทดลองที่เต็มไปด้วย PBS หรือน้ำเกลือ
วัฒนธรรม คือ การฆ่าเชื้อเข็มขูดด้วย
การถลอกแบคทีเรียด้วยน้ำเกลือถูก
โอนไปยัง centrifuge หลอด
การเจริญเติบโตแบคทีเรียผสมอย่างทั่วถึงด้วยความช่วยเหลือของ vortex ผสม
ทำให้มันสมบูรณ์บด . เซลล์ทั้งหมดของ
แบคทีเรียไฟฟ้า ( 3000 รอบต่อนาที , 30 นาทีที่อุณหภูมิห้อง )
) และน่านถูกทิ้งและ
เม็ดระงับได้อีกครั้งด้วยน้ำเกลือและ
ไฟฟ้า . กระบวนการทำซ้ำสามครั้ง
ทำให้แบคทีเรียฟรีจากวัสดุต่างประเทศใด ๆ หลังจาก
แบคทีเรีย 3 ที่แล้ว Re แขวนลอยในปกติ
น้ำเกลือ / พ่อบ้านน้ำเกลือฆ่าเชื้อเก็บในหลอดทดลอง
ติดป้ายอย่างถูกต้อง , การรักษาและเก็บไว้ในลึกแช่แข็งที่ - 20 องศาเซลเซียส เพื่อใช้ต่อ
.การเตรียมแอนติเจนสำหรับการทดสอบการจับกลุ่ม :
แอนติเจนเตรียมระงับแบคทีเรียอยู่ในบัฟเฟอร์น้ำเกลือตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้
เตรียมยกเว้นแอนติเจนคือเข้มข้นกว่า มีแสง
ความหนาแน่น 0.5 ใช้กัลเลนแคมพ์คัลเลอริมิเตอร์ที่ 520
.
ภูมิคุ้มกันโรคของกระต่ายสำหรับการผลิตแอนติซีรั่มและการเก็บเกี่ยว 5
: กระต่าย
โดยภายในกล้ามเนื้อและได้รับการฉีด .
ทั้งขวาและขาซ้าย ถูกใช้สำหรับฉีดภายในกล้ามเนื้อ
ในกรณีของการฉีดทางหลอดเลือดดำ , เส้นเลือดชายขอบของ
หูที่ใช้ 3 ปริมาณแอนติเจน ( 0.5 มล. 1.0 มล.
1.5 มิลลิลิตรฉีดภายในเกี่ยวกับกล้ามเนื้อในช่วงเวลาสี่วัน
. สำหรับใช้ขยายเส้นเลือด
ออกแบบปริมาณการฉีดช้าๆเข้าไปในระบบเลือด
ฉีดเพิ่มให้ 4 วัน หลังจากฉีดสุดท้าย
เพื่อเร่งการผลิตแอนติบอดี ห้า หรือเจ็ด
วันหลังฉีดบูสเตอร์ กระต่ายที่ถูกจัดขึ้นโดย
เจาะหัวใจสำหรับคอลเลกชันของแอนติ . กระบวนการของการแยกและรวบรวมเลือด
การทำปฏิกิริยาเช่นเดียวกับที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ แอนติเจนแอนติบอดีปฏิกิริยาทดสอบ
และส่วนผสมของแอนติเจนแอนติบอดีที่แสดงปฏิกิริยาบวก ส่งผลให้มีการตกตะกอนเนื่องจากผูกพัน
ของตนกับของแอนติบอดีต่อแอนติเจน การทดสอบที่แตกต่างกันสองระบบ
มีวัตถุประสงค์เพื่อบันทึกตะกอนหรือปฏิกิริยาบวก
ของแอนติเจนและแอนติบอดี เจลแบบทดสอบ
แสดงตามแบบเดิม
อธิบายโดย ouchterlony ( 1958 , 1962 ) ในขณะที่หลอด
การทดสอบการเกาะกลุ่มพบว่าแอนติเจนชนิดความคล้ายคลึงและ
วิธีการมาตรฐานแห่งชาติ ( NHS ) ) .
ยาปฏิชีวนะยาปฏิชีวนะการทดสอบความไวของการทดสอบความไวของการระบุแบคทีเรียถูก
ซ้ำ 3 ครั้งสำหรับแต่ละสายพันธุ์โดยใช้ที่แตกต่างกัน 10
ยาปฏิชีวนะคือ norfloxacin , tetracycline ไซโปรฟลอกซาซิน
นีโอมัยซิน , สะพานกรุงธน , ออฟลอกซาซิน , chloramphenicol ,
ไน , ,ยารักษา และ amoxicillin ( ไฮ - สื่อ
มุมไบ , อินเดีย ) โดยวิธีกระจายดิสก์ ( บาวเออร์ et al . , 1966 ) ยาปฏิชีวนะกิจกรรมวัดในแง่ของ zoneinhibition ( เส้นผ่าศูนย์กลาง มม.
แยกดีเอ็นเอดีเอ็นเอเจลอิเลคโตรโฟรีซีสและ
การสลายเป็นด่างขนาดเล็กเตรียมวิธี ( พ่อมดบวก
minipreps ระบบ บำบัดน้ำเสีย ดีเอ็นเอ promega , USA ) คือ
ใช้พลาสมิดการสกัดจากทั้งหมดสี่แบคทีเรีย
เชื้อ ค้างคืนที่ปลูกวัฒนธรรมแบคทีเรีย ( 3-5 มิลลิลิตร
เม็ดโดยการเหวี่ยงแยก ( 10 , 000 x G 10 นาที ) ,
น่านรินและ เม็ดจะแขวนลอยอยู่ในสารละลายแขวนลอย 300 ol
เซลล์อีกครั้ง ( 50 มม. โดย pH 7.5 , 10
100 mM EDTA ; Y / ml เลส ) เรื่องระงับเซลล์
โอน 1.5 ml หลอด
ระดับไมโครที่ 300 ol ของโซลูชั่นการสลายเซลล์ ( 0.2 M NaOH 1 %
SDS ) คือการเพิ่มและผสมอย่างทั่วถึง การล้าง lysate
300 ol ของการแก้ปัญหา ( 1.32 m
โพแทสเซียม acetate pH 4.8 ) คือการเพิ่มและผสม
อย่างถูกต้อง การ lysate คือระดับ ( 10 , 000 x G , 5 นาที ) และบำบัดน้ำเสีย พบว่าพลาสมิด
ใช้เครื่องดูดฝุ่นอเนก ( USA promega Vac คน ) นำตัวอย่าง
ถูก electrophoresed ใช้ 0.7 และ 1.0 เปอร์เซ็นต์เจล
ตามด้วยทิเดียมโบรไมด์ ( 0.5 และ / ml ) .
( sambrook et al . , 1989 ) วิธีดำเนินการใน 1 x
บริษัทบอเรต EDTA ( ทีบี ) บัฟเฟอร์ที่ 120 v
3 H หรือจนกว่าโหลดย้อม ( มารเมอร์ค บังกาลอร์ , อินเดีย )
อยู่ใกล้ด้านล่างของเจล เจลเป็นปรากฏการณ์และ
ถ่ายภาพภายใต้ระบบ 9000 หมอเจล ( ไบแรด
, USA )
ผลิตแอนติ 3-4 เดือนกระต่ายเก่าสีขาว ( 2.5 -
3 กิโลกรัม ) สุ่มและเก็บไว้ในกรงแยก
ข้อความที่ถูกต้อง ก่อนการฉีดซีรั่มของกระต่าย
ที่ใช้สำหรับการทดสอบครั้งนี้ ก่อน 7 วันของการเป็น ntigens แตกต่างกัน
กระต่าย เพื่อยืนยันว่า ไม่ได้มีแอนติ . โดยหลอด
ประกอบด้วยสดวาดเลือดที่ถูกเก็บไว้ที่อุณหภูมิห้อง
1-2 H สำหรับการพัฒนาลิ่มเลือด ที่อุดตันอยู่
กวนด้วยแท่งแก้ว และถูกเก็บไว้ค้างคืนในตู้เย็นให้แข็งตัว
การหดตัว ระดับพลาสมาถูก
( 3000 รอบต่อนาที 15 นาที ) หลอดสี เซรั่ม
ถูกถอนไปฆ่าเชื้อหลอด centrifuge ซึ่ง
ข้อความที่ถูกต้อง สำหรับการเก็บรักษาเลือดมันเพิ่มด้วย
002 เดียมไซด์ ( nanh2 ) เพื่อให้ความเข้มข้นสุดท้าย
ของ 1:5000 และเก็บไว้ในลึกแช่แข็งที่ - 20 องศาเซลเซียส เพื่อการใช้งานต่อไป
.
เตรียมทดสอบระบบของแอนติเจนเซลล์ทั้งหมด : แอนติเจนคือ
เตรียมจากสด ๆโตแบคทีเรียวัฒนธรรม
แบคทีเรียถูกเพาะเลี้ยงในหลอดทดลองที่หน่วยข่าวกรองกลาง 27 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 24 ชั่วโมง หลอดทดลองที่เต็มไปด้วย PBS หรือน้ำเกลือ
วัฒนธรรม คือ การฆ่าเชื้อเข็มขูดด้วย
การถลอกแบคทีเรียด้วยน้ำเกลือถูก
โอนไปยัง centrifuge หลอด
การเจริญเติบโตแบคทีเรียผสมอย่างทั่วถึงด้วยความช่วยเหลือของ vortex ผสม
ทำให้มันสมบูรณ์บด . เซลล์ทั้งหมดของ
แบคทีเรียไฟฟ้า ( 3000 รอบต่อนาที , 30 นาทีที่อุณหภูมิห้อง )
) และน่านถูกทิ้งและ
เม็ดระงับได้อีกครั้งด้วยน้ำเกลือและ
ไฟฟ้า . กระบวนการทำซ้ำสามครั้ง
ทำให้แบคทีเรียฟรีจากวัสดุต่างประเทศใด ๆ หลังจาก
แบคทีเรีย 3 ที่แล้ว Re แขวนลอยในปกติ
น้ำเกลือ / พ่อบ้านน้ำเกลือฆ่าเชื้อเก็บในหลอดทดลอง
ติดป้ายอย่างถูกต้อง , การรักษาและเก็บไว้ในลึกแช่แข็งที่ - 20 องศาเซลเซียส เพื่อใช้ต่อ
.การเตรียมแอนติเจนสำหรับการทดสอบการจับกลุ่ม :
แอนติเจนเตรียมระงับแบคทีเรียอยู่ในบัฟเฟอร์น้ำเกลือตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้
เตรียมยกเว้นแอนติเจนคือเข้มข้นกว่า มีแสง
ความหนาแน่น 0.5 ใช้กัลเลนแคมพ์คัลเลอริมิเตอร์ที่ 520
.
ภูมิคุ้มกันโรคของกระต่ายสำหรับการผลิตแอนติซีรั่มและการเก็บเกี่ยว 5
: กระต่าย
โดยภายในกล้ามเนื้อและได้รับการฉีด .
ทั้งขวาและขาซ้าย ถูกใช้สำหรับฉีดภายในกล้ามเนื้อ
ในกรณีของการฉีดทางหลอดเลือดดำ , เส้นเลือดชายขอบของ
หูที่ใช้ 3 ปริมาณแอนติเจน ( 0.5 มล. 1.0 มล.
1.5 มิลลิลิตรฉีดภายในเกี่ยวกับกล้ามเนื้อในช่วงเวลาสี่วัน
. สำหรับใช้ขยายเส้นเลือด
ออกแบบปริมาณการฉีดช้าๆเข้าไปในระบบเลือด
ฉีดเพิ่มให้ 4 วัน หลังจากฉีดสุดท้าย
เพื่อเร่งการผลิตแอนติบอดี ห้า หรือเจ็ด
วันหลังฉีดบูสเตอร์ กระต่ายที่ถูกจัดขึ้นโดย
เจาะหัวใจสำหรับคอลเลกชันของแอนติ . กระบวนการของการแยกและรวบรวมเลือด
การทำปฏิกิริยาเช่นเดียวกับที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ แอนติเจนแอนติบอดีปฏิกิริยาทดสอบ
และส่วนผสมของแอนติเจนแอนติบอดีที่แสดงปฏิกิริยาบวก ส่งผลให้มีการตกตะกอนเนื่องจากผูกพัน
ของตนกับของแอนติบอดีต่อแอนติเจน การทดสอบที่แตกต่างกันสองระบบ
มีวัตถุประสงค์เพื่อบันทึกตะกอนหรือปฏิกิริยาบวก
ของแอนติเจนและแอนติบอดี เจลแบบทดสอบ
แสดงตามแบบเดิม
อธิบายโดย ouchterlony ( 1958 , 1962 ) ในขณะที่หลอด
การทดสอบการเกาะกลุ่มพบว่าแอนติเจนชนิดความคล้ายคลึงและ
วิธีการมาตรฐานแห่งชาติ ( NHS ) ) .
ยาปฏิชีวนะยาปฏิชีวนะการทดสอบความไวของการทดสอบความไวของการระบุแบคทีเรียถูก
ซ้ำ 3 ครั้งสำหรับแต่ละสายพันธุ์โดยใช้ที่แตกต่างกัน 10
ยาปฏิชีวนะคือ norfloxacin , tetracycline ไซโปรฟลอกซาซิน
นีโอมัยซิน , สะพานกรุงธน , ออฟลอกซาซิน , chloramphenicol ,
ไน , ,ยารักษา และ amoxicillin ( ไฮ - สื่อ
มุมไบ , อินเดีย ) โดยวิธีกระจายดิสก์ ( บาวเออร์ et al . , 1966 ) ยาปฏิชีวนะกิจกรรมวัดในแง่ของ zoneinhibition ( เส้นผ่าศูนย์กลาง มม.
แยกดีเอ็นเอดีเอ็นเอเจลอิเลคโตรโฟรีซีสและ
การสลายเป็นด่างขนาดเล็กเตรียมวิธี ( พ่อมดบวก
minipreps ระบบ บำบัดน้ำเสีย ดีเอ็นเอ promega , USA ) คือ
ใช้พลาสมิดการสกัดจากทั้งหมดสี่แบคทีเรีย
เชื้อ ค้างคืนที่ปลูกวัฒนธรรมแบคทีเรีย ( 3-5 มิลลิลิตร
เม็ดโดยการเหวี่ยงแยก ( 10 , 000 x G 10 นาที ) ,
น่านรินและ เม็ดจะแขวนลอยอยู่ในสารละลายแขวนลอย 300 ol
เซลล์อีกครั้ง ( 50 มม. โดย pH 7.5 , 10
100 mM EDTA ; Y / ml เลส ) เรื่องระงับเซลล์
โอน 1.5 ml หลอด
ระดับไมโครที่ 300 ol ของโซลูชั่นการสลายเซลล์ ( 0.2 M NaOH 1 %
SDS ) คือการเพิ่มและผสมอย่างทั่วถึง การล้าง lysate
300 ol ของการแก้ปัญหา ( 1.32 m
โพแทสเซียม acetate pH 4.8 ) คือการเพิ่มและผสม
อย่างถูกต้อง การ lysate คือระดับ ( 10 , 000 x G , 5 นาที ) และบำบัดน้ำเสีย พบว่าพลาสมิด
ใช้เครื่องดูดฝุ่นอเนก ( USA promega Vac คน ) นำตัวอย่าง
ถูก electrophoresed ใช้ 0.7 และ 1.0 เปอร์เซ็นต์เจล
ตามด้วยทิเดียมโบรไมด์ ( 0.5 และ / ml ) .
( sambrook et al . , 1989 ) วิธีดำเนินการใน 1 x
บริษัทบอเรต EDTA ( ทีบี ) บัฟเฟอร์ที่ 120 v
3 H หรือจนกว่าโหลดย้อม ( มารเมอร์ค บังกาลอร์ , อินเดีย )
อยู่ใกล้ด้านล่างของเจล เจลเป็นปรากฏการณ์และ
ถ่ายภาพภายใต้ระบบ 9000 หมอเจล ( ไบแรด
, USA )
การแปล กรุณารอสักครู่..
ภาษาอื่น ๆ
การสนับสนุนเครื่องมือแปลภาษา: กรีก, กันนาดา, กาลิเชียน, คลิงออน, คอร์สิกา, คาซัค, คาตาลัน, คินยารวันดา, คีร์กิซ, คุชราต, จอร์เจีย, จีน, จีนดั้งเดิม, ชวา, ชิเชวา, ซามัว, ซีบัวโน, ซุนดา, ซูลู, ญี่ปุ่น, ดัตช์, ตรวจหาภาษา, ตุรกี, ทมิฬ, ทาจิก, ทาทาร์, นอร์เวย์, บอสเนีย, บัลแกเรีย, บาสก์, ปัญจาป, ฝรั่งเศส, พาชตู, ฟริเชียน, ฟินแลนด์, ฟิลิปปินส์, ภาษาอินโดนีเซี, มองโกเลีย, มัลทีส, มาซีโดเนีย, มาราฐี, มาลากาซี, มาลายาลัม, มาเลย์, ม้ง, ยิดดิช, ยูเครน, รัสเซีย, ละติน, ลักเซมเบิร์ก, ลัตเวีย, ลาว, ลิทัวเนีย, สวาฮิลี, สวีเดน, สิงหล, สินธี, สเปน, สโลวัก, สโลวีเนีย, อังกฤษ, อัมฮาริก, อาร์เซอร์ไบจัน, อาร์เมเนีย, อาหรับ, อิกโบ, อิตาลี, อุยกูร์, อุสเบกิสถาน, อูรดู, ฮังการี, ฮัวซา, ฮาวาย, ฮินดี, ฮีบรู, เกลิกสกอต, เกาหลี, เขมร, เคิร์ด, เช็ก, เซอร์เบียน, เซโซโท, เดนมาร์ก, เตลูกู, เติร์กเมน, เนปาล, เบงกอล, เบลารุส, เปอร์เซีย, เมารี, เมียนมา (พม่า), เยอรมัน, เวลส์, เวียดนาม, เอสเปอแรนโต, เอสโทเนีย, เฮติครีโอล, แอฟริกา, แอลเบเนีย, โคซา, โครเอเชีย, โชนา, โซมาลี, โปรตุเกส, โปแลนด์, โยรูบา, โรมาเนีย, โอเดีย (โอริยา), ไทย, ไอซ์แลนด์, ไอร์แลนด์, การแปลภาษา.
- Hi thanks for your message. I'm just get
- Can i take your coat
- สนุกกับพวกเขา หลังจากออกกำลังกายเสร็จแล้
- ครับผม
- first time i ever
- We must work hard to promote world peace
- what was the limiting reactant from Ques
- ในสังคมสมัยนี้ไม่ได้ มีแต่เครื่องมือไฮเท
- หลังจากนั้น
- ฉันไม่ได้กินเลย
- rotate
- เราไม่ได้อยู่ด้วยกัน เขาทำงาน ฉันเรียน
- Heavily forest Region
- Thanks for your follow, it's greatly app
- Quên?
- Professionalism is the extent to which a
- what will you do if you make mistake?
- พรุ่งนี้สอน5คลาส
- นะ
- they talking about body some were else .
- คุณพิมพ์ภาษาอังกฤษได้ไหม
- : deserving attention, admiration, or re
- nice to meet you
- sticky drink
