Structured illumination microscopy

Structured illumination microscopy (SIM) does not require special sample preparation compared to other super resolution imaging techniques. It does, however, require implementation of best practices in your routine sample preparation. This Quick Reference discusses best practices for experimental design, selection of supported sample types and mounting medium, as well as sample mounting considerations for successful SIM imaging on both OMX V4 and SR models.
Experimental Design
1.
Verify which laser lines are available on your OMX system.
2.
Choose bright and photostable fluorophores, fluorescent proteins (FPs), and stains that are compatible with the available laser lines (see table at right).
3.
Choose the shortest wavelength possible for the finest structures within your sample, as SIM resolution is wavelength dependent (i.e., 488 and 568 laser lines for 2-color IF).
4.
Optimize your immunofluorescence (IF) protocol for high signal-to-noise ratio by imaging with a widefield or confocal microscope. A formaldehyde post fix is recommended.
Note: Artifacts can be introduced into SIM Reconstruction when background is high.
Supported Sample Types
Microscope objectives are optimized for #1.5 thickness coverglass (170mm thick). To succeed in SIM imaging, it is essential to use #1.5 coverglass and that the sample be mounted on the coverglass, NOT the slide. For cellular samples, grow your cells on the coverglass and for tissue samples, mount directly onto the coverslip. For tissue samples, imaging the first 50mm from the coverslip is possible and limiting single experiments to 30mm is recommended.
#1.5 coverglass
•
For all OMX samples, slides should be prepared to avoid a tilted coverslip. Two common causes of tilt are stickers/labels on the edge of the slide and breaking a coverslip while mounting (see schematic at right).
•
For the V4, use 22mm square or circular coverslips. Mount the sample in the middle 25mm of the slide (see schematic at right).
•
For the SR, a longer coverglass, such as 22mm x 40mm may be used due to the longer stage travel. Mount in the middle 50mm of a non-frosted slide (see figures at right).
•
Consider using high precision coverglass. These are more uniform in thickness compared to regular coverslips (170 ± 5mm rather than ± 20mm), which can make oil selection more consistent across a single slide AND between samples.
35mm dishes
•
35mm dishes that have a #1.5 coverglass bottom are compatible with the V4 and SR.
Chambered coverglass
•
Lab-TekTMII 8 well Chambered Coverglass samples with 2, 4, or 8 wells (155409) may be imaged on both the V4 and SR.
Note: The chambered coverglass adapter is designed to specifically fit Lab-Tek II chambers.
•
For the V4, use ONLY the middle 4 wells of an 8-well-chambered-coverglass sample.
Laser Lines
Common Fluorophores,
FPs, and Stains
405
DAPI, Hoechst, CFTM405M
445
CFP, mTurquoise
488
GFP, mNeonGreen, EmGFP, Alexa Fluor® 488, ATTO-488
514
YFP, Venus
568
mCherry, mApple, tdTomato, TMR, Alexa Fluor® 568,
640/642
TO-PRO®-3, Cy5®, Alexa Fluor® 647, SiR
Why

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

กล้องจุลทรรศน์ส่องสว่างที่มีโครงสร้าง (SIM) ไม่ต้องการเตรียมตัวอย่างพิเศษเมื่อเทียบกับสุดยอดความละเอียดอื่น ๆ เทคนิคการถ่ายภาพ อย่างไรก็ตาม มัน ต้องการแนวทางปฏิบัติในการเตรียมตัวอย่างกิจวัตรประจำวันของคุณ การอ้างอิงอย่างรวดเร็วนี้กล่าวถึงแนวทางปฏิบัติสำหรับการออกแบบการทดลอง ตัวเลือกของประเภทตัวอย่างที่สนับสนุน และยึดกลาง เป็นตัวอย่างการติดตั้งข้อควรพิจารณาสำหรับการถ่ายภาพซิประสบความสำเร็จในรุ่น OMX V4 และ SRออกแบบการทดลอง1ตรวจสอบบรรทัดเลเซอร์ที่มีอยู่บนระบบของคุณ OMX2เลือกที่สดใส และ fluorophores จากการทำร้าย โปรตีนฟลูออเรสเซนต์ (FPs), และคราบที่เข้ากันได้กับบรรทัดบริการเลเซอร์ (ดูตารางด้านขวา)3เลือกความยาวคลื่นสั้นสุดสำหรับโครงสร้างที่ดีที่สุดภายในชิ้นงานตัวอย่าง SIM ความละเอียดซึ่ง ขึ้นกับความยาวคลื่น (เช่น 488 568 เลเซอร์บรรทัด และถ้าสี)4เพิ่มประสิทธิภาพของโพรโทคอล immunofluorescence (ถ้า) สำหรับอัตราส่วนสัญญาณรบกวนสูง โดยการถ่ายภาพกับ widefield หรือกล้องจุลทรรศน์โฟคอ แนะนำการแก้ไขโพสต์ฟอร์มาลดีไฮด์หมายเหตุ: สิ่งประดิษฐ์สามารถนำเข้าไปใน SIM บูรณะเมื่อพื้นหลังสูงประเภทตัวอย่างสนับสนุนวัตถุประสงค์ของกล้องจุลทรรศน์เหมาะสำหรับ coverglass #1.5 ความหนา (หนา 170 มม.) สำเร็จใน SIM ภาพ คุณจำเป็นต้องใช้ coverglass #1.5 และให้ตัวอย่างการติดตั้ง coverglass ภาพนิ่งไม่ ตัวอย่างโทรศัพท์มือถือ เติบโตเซลล์ของคุณ coverglass และ สำหรับตัวอย่างเนื้อเยื่อ ติดตั้งโดยตรงลงบน coverslip การ ตัวอย่างเนื้อเยื่อ ภาพแรก 50 มม.จาก coverslip เป็นไปได้ และการจำกัดการทดลองเดียวถึง 30 มม.แนะนำcoverglass #1.5•สำหรับตัวอย่างทั้งหมดใน OMX ควรเตรียมสไลด์เพื่อหลีกเลี่ยงการ coverslip เอียง สองสาเหตุใหญ่ของการเอียงมีสติกเกอร์/ฉลากบนขอบของภาพนิ่งและทำลาย coverslip ในขณะติดตั้ง (ดู schematic ด้านขวา)•สำหรับ V4 ใช้ 22 มม.สี่เหลี่ยมหรือวงกลม coverslips ติดตัวอย่างอยู่ตรงกลางของภาพนิ่ง 25 มม. (ดู schematic ด้านขวา)•สำหรับ SR อาจใช้เป็น coverglass อีกต่อไป เช่น 22 x 40 มม.เนื่องจากการเดินทางระยะยาว ติดตรงกลางของภาพนิ่งไม่ใช่ฝ้า 50 มม. (ดูตัวเลขด้านขวา)•พิจารณาใช้ความแม่นยำสูง coverglass เหล่านี้เป็นรูปแบบมากขึ้นเมื่อเทียบกับปกติ coverslips (170 ± 5 มม.มากกว่า± 20 มม.), ซึ่งสามารถทำน้ำมันเลือกมากขึ้น ในภาพนิ่งเดียว และ ระหว่างตัวอย่าง หนาอาหาร 35 มม.•อาหาร 35 มม.ที่มีด้านล่าง #1.5 coverglass เข้ากันได้กับ V4 และซีเนียร์ยุคลำ coverglass•อย่างยุคลำ Coverglass ดี TekTMII แล็บ 8 มี 2, 4 หรือ 8 หลุม (155409) อาจถ่ายภาพทั้ง V4 และซีเนียร์หมายเหตุ: อะแดปเตอร์ coverglass ยุคลำถูกออกแบบให้ห้องแล็บ-Tek II•สำหรับ V4 ใช้เฉพาะกลาง 4 หลุมตัวอย่าง 8-ดียุคลำ-coverglassเส้นเลเซอร์Fluorophores ทั่วไปFPs และคราบ405DAPI, Hoechst, CFTM405M445CFP, mTurquoise488GFP, mNeonGreen, EmGFP ฟลูออ Alexa® 488 บีบ-488514YFP วีนัส568mCherry เมเปิลเล tdTomato, TMR ฟลูออ Alexa® 568640/642-PRO®-3, Cy5®, Alexa Fluor® 647 ที่รักทำไม

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

ไฟส่องสว่างกล้องจุลทรรศน์ที่มีโครงสร้าง มันไม่ แต่จำเป็นต้องมีการดำเนินการตามแนวปฏิบัติที่ดีในการจัดทำตัวอย่างประจำวันของคุณ อ้างอิงด่วนนี้กล่าวถึงการปฏิบัติที่ดีที่สุดสำหรับการออกแบบการทดลองเลือกประเภทของกลุ่มตัวอย่างที่ได้รับการสนับสนุนการติดตั้งและขนาดกลางเช่นเดียวกับการพิจารณาติดตั้งตัวอย่างสำหรับการถ่ายภาพซิมที่ประสบความสำเร็จทั้งใน
การออกแบบการทดลอง
1.
ตรวจสอบว่าสายเลเซอร์ที่มีอยู่ในระบบ
2.
เลือก
3.
เลือกความยาวคลื่นที่สั้นที่สุดที่ดีที่สุดสำหรับโครงสร้างภายในของคุณตัวอย่างเช่นความละเอียดของซิมเป็นความยาวคลื่นขึ้น
4.
เพิ่มประสิทธิภาพของอิมมูโนของคุณ แก้ไขโพสต์ไฮด์ขอแนะนำ
หมายเหตุ
สนับสนุนตัวอย่างประเภท
วัตถุประสงค์กล้องจุลทรรศน์จะเหมาะสำหรับ ประสบความสำเร็จในการถ่ายภาพซิมมันเป็นสิ่งสำคัญที่จะใช้ สำหรับตัวอย่างเซลล์เติบโตเซลล์ของคุณบน สำหรับตัวอย่างเนื้อเยื่อ
# 1.5 coverglass
•
สำหรับทุกตัวอย่าง สองสาเหตุที่พบบ่อยของความลาดเอียงที่มีสติกเกอร์
•
สำหรับ ติดตัวอย่างที่อยู่ตรงกลางของภาพนิ่ง
•
สำหรับอาร์มี ภูเขาอยู่ตรงกลาง - สไลด์น้ำค้างแข็ง
•
พิจารณาใช้ เหล่านี้เป็นเหมือนกันมากขึ้นในความหนาเมื่อเทียบกับ ± 5mm ± 20mm)
35mm
•
35mm
ลำ
•
Lab - TekTMII 8
หมายเหตุ
•
สำหรับ - ดี- ลำ- ตัวอย่าง
เลเซอร์สาย
สามัญ
เฟรมต่อวินาทีและคราบ
405
DAPI, Hoechst, CFTM405M
445
CFP, mTurquoise
488
GFP, mNeonGreen, EmGFP, Alexa Fluor ® 488 ATTO - 488
514
YFP
568
mCherry, Mapple, tdTomato, TMR, Alexa Fluor ® 568,
640/642
TO - PRO ® - 3 Cy5 ® , Alexa Fluor ® 647
ทำไม

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

กล้องจุลทรรศน์แบบแสง ( SIM ) ไม่ต้องพิเศษ การเตรียมตัวเมื่อเทียบกับเทคนิคการถ่ายภาพความละเอียดสุด ๆ มันไม่ แต่ต้องมีการใช้วิธีปฏิบัติที่ดีที่สุดในการเตรียมตัวของคุณตามปกติ อ้างอิงด่วนนี้อธิบายวิธีปฏิบัติที่ดีที่สุดสำหรับการออกแบบการทดลอง การเลือกสนับสนุนประเภทตัวอย่างและติดตั้งสื่อ ตลอดจนการพิจารณาตัวอย่างการใช้งานซิมรุ่นทั้งปลอดภัยและประสบความสำเร็จ / SR .การออกแบบการทดลอง1 .ตรวจสอบที่เส้นเลเซอร์จะพร้อมใช้งานในระบบปลอดภัยของคุณ2 .เลือกที่สดใสและ photostable fluorophores โปรตีนเรืองแสง ( FPS ) และคราบที่เข้ากันได้กับสายเลเซอร์ใช้ได้ ( ดูจากตารางที่ด้านขวา )3 .เลือกความยาวคลื่นที่สั้นที่สุดสำหรับโครงสร้างที่ดีที่สุดในตัวอย่างของคุณ เป็นซิม ความละเอียดขึ้นอยู่กับความยาวคลื่น ( เช่น แล้วดูเลเซอร์เส้นสีถ้า )4 .วิธีเพิ่มประสิทธิภาพของคุณ ( ถ้า ) โปรโตคอลสำหรับสูงอัตราส่วนสัญญาณจากภาพถ่ายด้วยกล้องจุลทรรศน์ widefield หรือด้วย . ฟอร์มาลดีไฮด์โพสต์แก้ไข แนะนําหมายเหตุ : สิ่งประดิษฐ์สามารถเข้าไปในซิมการบูรณะเมื่อพื้นหลังสูงสนับสนุนประเภทตัวอย่างกล้องจุลทรรศน์มีวัตถุประสงค์เหมาะสำหรับ # 1.5 หนา coverglass ( 170mm หนา ) ประสบความสำเร็จในการถ่ายภาพ ซิม มันเป็นสิ่งจำเป็นที่จะใช้ # 1.5 coverglass และตัวอย่างที่ได้รับการติดตั้งบน coverglass ไม่สไลด์ สำหรับตัวอย่างเซลล์เติบโตเซลล์ของคุณใน coverglass และตัวอย่างเนื้อเยื่อที่ติดโดยตรงลงบนปิดสไลด์ . สำหรับตัวอย่างเนื้อเยื่อ imaging 50mm แรกจากปิดสไลด์ได้ และการ จำกัด การทดลองเดียว 30mm แนะนํา# 1.5 coverglass-สำหรับตัวอย่าง OMX , สไลด์ควรเตรียมที่จะหลีกเลี่ยงการเอียงปิดสไลด์ . สองสาเหตุที่พบบ่อยของเอียงเป็นสติกเกอร์ / ฉลากบนขอบของภาพนิ่งและแบ่งปิดสไลด์ในขณะที่การติดตั้ง ( ดูแผนผังที่ด้านขวา )-สำหรับต้น ใช้ 22mm สี่เหลี่ยมหรือวงกลม coverslips . เมาท์ ตัวอย่างในขนาดกลางของภาพนิ่ง ( ดูแผนผังที่ด้านขวา )-สำหรับส่วนที่ยาว coverglass เช่น 22mm x 40mm อาจใช้เนื่องจากอีกต่อไประยะเดินทาง ภูเขาใน 50mm กลางไม่ใช่ฝ้าสไลด์ ( เห็นตัวเลขที่ถูกต้อง )-ควรใช้ความละเอียดสูง coverglass . เหล่านี้เป็นชุดมากขึ้นในความหนาเมื่อเทียบกับ coverslips ปกติ ( 170 ± 5mm มากกว่า± 20mm ) ซึ่งสามารถเลือกน้ำมันมากขึ้นสอดคล้องกันระหว่างภาพนิ่งเดียวและระหว่างตัวอย่างจาน 35 มม.-35 มม. จานที่มี # 1.5 coverglass ด้านล่างจะเข้ากันได้กับ V4 แล้วครับที่ดัดแปลงให้ใช้ coverglass-ห้องปฏิบัติการ tektmii 8 ก็ดัดแปลงให้ใช้ coverglass ตัวอย่างกับ 2 , 4 หรือ 8 หลุม ( 155409 ) อาจจะอื่นๆทั้งในและ V4 ครับหมายเหตุ : coverglass ดัดแปลงให้ใช้อะแดปเตอร์ถูกออกแบบมาเฉพาะกับแล็บเทค 2 ห้อง-สำหรับต้น ใช้เฉพาะกลาง 4 บ่อของ 8-well-chambered-coverglass ตัวอย่างเส้นเลเซอร์fluorophores ทั่วไปอัตราเฟรมและคราบ405dapi Hoechst cftm405m , ,445mturquoise CFP ,488mneongreen GFP emgfp , , , Alexa Fluor ® 488 atto-488 ,514yfp ดาวศุกร์568mcherry mapple tdtomato 3 , , , , Alexa Fluor ®เอย ,640 / 480to-pro ® - 3 , cy5 ® , Alexa Fluor ® 647 ครับทำไม