This confirms that the HRM assay is

This confirms that the HRM assay is fit for its intended use.
Validation
The assay could detect as low as 0.05ag for a total reaction volume of 200. The primers were specific for NDV F gene and had no relationship with other organisms as stated in the วิธีology.
Analysis of more NDV vaccines using HRM
More NDV vaccine สายพันธุ์ were analysed by HRM. These vaccines include: Avinew (Merial Limited), Clone 30 (Intervet), KBNP- Dalguban (KBNP, Korea), ND-Bl (Merial Limited), and Mukteswar (Malaysian Vaccine Pharmaceuticals).
The assay consisted of 1111 of the highly saturated fluorescent dye master mix, 2121 of 25mM MgC12, 12.5111 of HRM mastermix, 1111 of the primer pair (SEQ ID NO:31 and 32),
template and PCR grade water. The samples were loaded into the 384-well microwell plate and subjected to PCR amplification in a real time PCR machine (LightCycler 480, Roche). The
thermal cycling reactions consisted of an initial การทำให้เสียสภาพ (3 sec at 95°C). The amplification consisted of การทำให้เสียสภาพ (1 mM at 95°C), annealing (1 นาทีที่ 56°C) and extension (1 นาทีที่ 72°C). The PCR was immediately followed by วีวีing curve analysis.
The HRM assay was able to differentiate the vaccine-types tested (รูป 20). A portion of the นิวคลีโอไทด์ การเทียบเรียงลำดับ of the whole genome of the five vaccine-type สายพันธุ์ of NDV is shown in รูป 21. Various นิวคลีโอไทด์ differences can be observed throughout the genome of the viruses which account for the distinction of the melting curves. Multiple
alignment of the amino acid sequence of the fusion protein gene of the five vaccine-type สายพันธุ์ of NDV is shown in รูป 22. Similarly various differences could be observed at various sites.
The ความเหมือนกันของลำดับ matrix of the whole genome of the vaccine-type NDV and the ความเหมือนกันของลำดับ matrix of the amino acids for the fusion (F) protein of the vaccine-type NDV are depicted in รูป 23.
The results showed that the HRM (วีวี) analysis could distinctly separate the melting curves into exclusive groups for each vaccine-type. Multiple alignments of the
sequences of the whole genome and amino acid of the fusion protein gene of the five vaccine-
types showed various นิวคลีโอไทด์ variations at multiple sites throughout the whole genome. Of the five studies, the KBNP-vaccine type showed six นิวคลีโอไทด์ insertions "CGTACG" at



นิวคลีโอไทด์ position 4500 to 4506. None of the other vaccines tested had this sequence. It is
reported that KBNP is a recombinant La Sota สายพันธุ์ (KBNP-C4152R2L) in which fusion (F) and hemagglutinin-neuraminidase (HN) genes were replaced with the F and HN gene from genotype

VIId virus by mutating the F cleavage motif from 112RRQKR

116


(SEQ ID NO:45) to

112GRQAR116 (SEQ ID NO:46) (รูป 22). The six นิวคลีโอไทด์ sequence was inserted into the intergenic region between the matrix protein and F genes for attenuation without breaking the "rule of six" as a marker (Cho et al., Clinical and Vaccine Immunology, 15(10):1572-9, 2008). This serves as a good marker for differentiating the KBNP vaccine with Avinew. Similarly, the other vaccines have นิวคลีโอไทด์ differences at various sites making it possible to differentiate the vaccine-types by HRM.
Scoring of the sequences by identity matrices tool for the whole virus genome showed 99% similarity between Avinew and ND Clone 30 (Intervet), 87.7% between Avinew and
Mukteswar (MVP), 94.9% between Avinew and KBNP (Korea Dalguban) and 99.5% between Avinew and ND-B 1 (Merial).
Scoring of the amino acid sequence by identity matrices tool for the fusion protein gene of the vaccine-types showed 99% similarity between Avinew and ND Clone 30 (Intervet), 88.9% between Avinew and Mukteswar (MVP), 88.6% between Avinew and KBNP (Korea Dalguban) and 99% between Avinew and ND-B 1 (Merial).
The scoring matrices suggest that the dissimilarity between the NDV viruses are varying at 12.7% between Avinew and Mukteswar (MVP) based on นิวคลีโอไทด์ dissimilarity and 11.4% between Avinew and KBNP (Korea Dalguban) and 11.1% between Avinew and Mukteswar
(MVP) based on amino acid sequence dissimilarity of its fusion protein gene.
Validations were carried to assess the assay and the assay was found to fit for its intended use in terms of sensitivity and specificity.
The results further demonstrated that the HRM assay was able to generate unique melting profiles to distinctly identify each vaccine-type.

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

นี้จะยืนยันว่า การทดสอบ หรือเหมาะกับการใช้งานของมัน .

( จะตรวจสอบการเป็นต่ำเป็น 0.05ag สำหรับปริมาตรปฏิกิริยารวมของ 200 ไพรเมอร์มีเฉพาะ ndv F ยีนและมีความสัมพันธ์กับสิ่งมีชีวิตอื่น ๆ ตามที่ระบุไว้ในวิธี ology .
การวิเคราะห์เพิ่มเติม ndv วัคซีนใช้ HRM
ndv เพิ่มเติมวัคซีนสายพันธุ์วิเคราะห์โดยวิธี . วัคซีนเหล่านี้รวมถึง :avinew ( เมอเรียล จำกัด ) , โคลน 30 ( intervet ) kbnp - dalguban ( kbnp เกาหลี ) , และ BL ( เมอเรียล จำกัด ) และ mukteswar ( ยาวัคซีน มาเลเซีย ) .
( จำนวน 1111 ของไขมันอิ่มตัวสูงเรืองแสงย้อมต้นแบบผสม , 2 , 121 mgc12 25mm , mastermix 1111 12.5111 ของ HRM , ของ ไพรเมอร์คู่ ( seq id : 31 และ 32 ) ,
แม่แบบและน้ำเกรด PCRจำนวนโหลดลงเครื่องก็ microwell จาน และต้องเพิ่มปริมาณเชื้อในเวลาจริงจากเครื่อง ( lightcycler 480 , โรช )
ปฏิกิริยาจักรยานความร้อนประกอบด้วยการทำให้เสียสภาพเริ่มต้น ( 3 วินาทีที่ 95 องศา C ) โดยการเพิ่มจำนวนการทำให้เสียสภาพ ( 1 มม. ที่ 95 องศา C )การอบอ่อน ( 1 นาทีที่ 56 ° C ) และนามสกุล ( 1 นาทีที่ 72 ° C ) pcr ได้ทันทีตามด้วยวีวีไอเอ็นจีกราฟการวิเคราะห์
( HRM ก็แยกแยะได้ วัคซีนชนิดทดสอบ ( 20 รูป ) ส่วนของการเทียบเรียงลำดับนิวคลีโอไทด์ของจีโนมทั้งหมดของห้าชนิดของวัคซีนสายพันธุ์ ndv แสดงใน 21 รูป .ความแตกต่างนิวคลีโอไทด์ต่างๆสามารถสังเกตทั่วจีโนมของไวรัส ซึ่งบัญชีสำหรับความแตกต่างของการหลอมเส้นโค้ง หลาย
การเรียงตัวของลำดับกรดอะมิโนของยีนของโปรตีนของห้าชนิดของวัคซีนสายพันธุ์ ndv แสดงใน 22 รูป . ในทำนองเดียวกันความแตกต่างต่าง ๆ สามารถสังเกตได้ในเว็บไซต์ต่างๆ
การความเหมือนกันของลำดับเมทริกซ์ของจีโนมทั้งหมดของชนิดของวัคซีน ndv และความเหมือนกันของลำดับเมทริกซ์ของกรดอะมิโนสำหรับฟิวชั่น ( F ) โปรตีนชนิดวัคซีน ndv เป็นที่ปรากฎใน 23 รูป .
พบว่า HRM ( วีวี ) การวิเคราะห์ทำได้อย่างชัดเจนแยกละลายโค้งออกเป็นกลุ่มสำหรับวัคซีนแต่ละชนิดหลาย การลำดับของจีโนมของ
รวมและกรดอะมิโนของยีนของโปรตีน 5 ชนิดพบว่าวัคซีน --
นิวคลีโอไทด์รูปแบบต่าง ๆ ที่เว็บไซต์หลายเว็บไซต์ทั่วจีโนมทั้งหมด ของห้าเรียน kbnp วัคซีนชนิดใหม่พบหกนิวคลีโอไทด์ " cgtacg "



นิวคลีโอไทด์ตำแหน่ง 4500 กับเครื่องมือ .ไม่มีของอื่น ๆสามารถทดสอบได้ลำดับนี้ มีรายงานว่า kbnp
เป็น recombinant ลาโซต้าสายพันธุ์ ( kbnp-c4152r2l ) ที่ผสม ( F ) และฮีมแอกลูตินิน ( HN ) ยีนนิวรามินิเดสถูกแทนที่ด้วย F และ HN ยีนจากไวรัสจี

viid โดยกรรมวิธี F การแม่ลายจาก 112rrqkr 116




( seq id : 45 )

112grqar116 ( seq id : 46 ) ( 22 รูป )6 นิวคลีโอไทด์ลำดับถูกแทรกลงในภูมิภาคส่าระหว่างโปรตีน แมทริกซ์และ F ยีนการโดยไม่ทำลายกฎ " หก " เป็นเครื่องหมาย ( โช et al . , วัคซีนทางคลินิกและภูมิคุ้มกันวิทยา ( 15 : 10 ) 1572-9 , 2008 ) ซึ่งเป็นเครื่องหมายที่ดีสำหรับความแตกต่าง kbnp วัคซีนกับ avinew . ในทํานองเดียวกันวัคซีนอื่น ๆ มีความแตกต่างนิวคลีโอไทด์ที่เว็บไซต์ต่าง ๆ ทำให้สามารถแยกแยะประเภทวัคซีนโดย HRM .
คะแนนลำดับ โดยตัวเครื่องมือเมทริกซ์สำหรับจีโนมไวรัสทั้งหมดมีความคล้ายคลึงกันระหว่าง avinew 99% และโคลน 30 ครั้ง ( intervet ) ร้อยละ 87.7 และระหว่าง avinew และ
mukteswar ( MVP ) avinew 94.9 และระหว่าง kbnp ( เกาหลี dalguban ) และ 995 % และระหว่าง avinew nd-b 1 ( ต่างๆ ) .
คะแนนลำดับกรดอะมิโน โดยตัวเครื่องมือเมทริกซ์สำหรับส่วนของโปรตีนของยีนชนิดวัคซีน พบว่า 99% และความคล้ายคลึงกันระหว่าง avinew ครั้งที่ 30 ( intervet โคลน ) และ 88.9 % ระหว่าง avinew mukteswar ( MVP ) ร้อยละ 88.6 % ระหว่าง avinew kbnp ( เกาหลี dalguban และ ) และ 99% และระหว่าง avinew nd-b 1
( ต่างๆ )คะแนนเมทริกซ์แสดงให้เห็นว่าความแตกต่างระหว่าง ndv ไวรัสจะแตกต่างกันที่ 12.7% และระหว่าง avinew mukteswar ( MVP ) บนพื้นฐานของความแตกต่างและนิวคลีโอไทด์ 11.4% และระหว่าง avinew kbnp ( เกาหลี dalguban ) และ 11.1% และระหว่าง avinew mukteswar
( MVP ) ตามลำดับกรดอะมิโนของโปรตีนความแตกต่างของยีน
EditBy Z ! : ศึกษาเพื่อประเมินการทดสอบและการทดสอบพบว่าเหมาะกับการใช้งานของมันในแง่ของความไวและความจำเพาะ .
ผลลัพธ์เพิ่มเติมพบว่า การทดสอบ หรือก็สามารถที่จะสร้างโปรไฟล์ที่ชัดเจนระบุเอกลักษณ์ละลายวัคซีนแต่ละชนิด