2.4. Preparation of brush border me

2.4. Preparation of brush border membranes

Brush border membranes (BBM) were generated according to a modified protocol after Chang et al. (1991), Kaune et al. (1992), and Schröder et al. (1998). In brief, thawed mucosal homogenates were mixed with 10 ml ice-cold preparation buffer +20 μl 0.2 mM PMSF, homogenized and subsequently transferred into centrifugation tubes. An aliquot of the homogenate was used for mRNA extraction. The remaining homogenate was used for BBM preparation by precipitation in 1.5 M MgSO4 solution. Briefly, MgSO4 was added to the samples while stirring for 15 min on ice. Samples were centrifuged for 15 min at 10,000 × g to precipitate basolateral membranes, mitochondria and other cell compounds. The supernatant was centrifuged for 30 min at 47,000 × g and the pellet re-dissolved in 25 ml of preparation buffer with 80 μl 0.2 mM PMSF in a manually operated glass homogenizer (Sartorius, Göttingen, Germany) at 1000 rpm and transferred into new centrifugation tubes for a second precipitation in 1.5 M MgSO4. Samples were centrifuged again for 15 min at 10,000 × g to precipitate basolateral membranes, mitochondria and other cell compounds again. The supernatant was centrifuged for 30 min at 47,000 × g and the pellet re-dissolved in 1 ml of Tris–HCl buffer (20 mM, pH 7.4). Aliquots (100 μl) of the BBM containing suspension were stored in Eppendorff tubes at −80 °C for enzyme activity analysis

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

2.4 การเตรียมเยื่อหุ้มขอบแปรงเยื่อหุ้มขอบแปรง (BBM) เกิดตามโพรโทคอลที่ถูกปรับเปลี่ยนหลังจากช้างและ al. (1991), Kaune et al. (1992), และ Schröder et al. (1998) สังเขป thawed mucosal homogenates ผสมกับ 10 ml ฉ่ำเตรียมบัฟเฟอร์ +20 μl 0.2 mM PMSF, homogenized เป็นกลุ่ม และต่อมาโอนเข้า centrifugation หลอด เป็นส่วนลงตัวของ homogenate ถูกใช้สำหรับสกัด mRNA Homogenate ที่เหลือถูกใช้สำหรับการเตรียม BBM โดยฝนในโซลูชัน MgSO4 1.5 M สั้น ๆ MgSO4 ถูกเพิ่มเข้าไปตัวอย่างขณะกวนสำหรับ 15 นาทีบนน้ำแข็ง ตัวอย่างที่ centrifuged สำหรับ 15 นาทีที่ 10000 × g เพื่อ precipitate basolateral เข้า mitochondria และสารประกอบอื่น ๆ เซลล์ Supernatant ถูก centrifuged สำหรับ 30 นาที 47,000 × g และเม็ดละลายอีกครั้งใน 25 ml การเตรียมบัฟเฟอร์ด้วย μl 80 0.2 mM PMSF ใน homogenizer เป็นแก้วดำเนินด้วยตนเอง (บริษัทซาร์โทเรียส Göttingen เยอรมนี) ได้ที่ 1000 rpm และเป็นหลอด centrifugation ใหม่สำหรับฝนที่สองในระยะ 1.5 เมตร MgSO4 ตัวอย่างมี centrifuged อีกใน 15 นาทีที่ 10000 × g เพื่อ precipitate basolateral เข้า mitochondria และสารประกอบอื่น ๆ เซลล์อีก Supernatant ถูก centrifuged สำหรับ 30 นาที 47,000 × g และเม็ดละลายอีกครั้งใน 1 ml ของบัฟเฟอร์ตรี – HCl (20 มม. pH 7.4) Aliquots (100 μl) ของ BBM ประกอบด้วยระบบกันสะเทือนถูกเก็บไว้ในหลอด Eppendorff ที่ −80 ° C สำหรับการวิเคราะห์กิจกรรมของเอนไซม์

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

2.4 การเตรียมการของเยื่อชายแดนแปรงเยื่อชายแดนแปรง (BBM) ถูกสร้างขึ้นตามโปรโตคอลการแก้ไขหลังจากที่ช้าง et al, (1991), et al, Kaune (1992) และSchröder et al, (1998) ในช่วงสั้น ๆ ละลาย homogenates เยื่อเมือกถูกผสมกับ 10 มล. เย็นเตรียมบัฟเฟอร์ 20 ไมโครลิตร 0.2 มิลลิ PMSF, ปั่นและต่อมาย้ายเข้าไปในหลอดหมุนเหวี่ยง aliquot ของ homogenate ถูกนำมาใช้ในการสกัด mRNA homogenate ที่เหลือถูกนำมาใช้ในการจัดทำ BBM โดยการตกตะกอนใน 1.5 M MgSO4 การแก้ปัญหา สั้น ๆ , MgSO4 ถูกบันทึกอยู่ในตัวอย่างในขณะที่กวนเป็นเวลา 15 นาทีบนน้ำแข็ง ตัวอย่างที่ถูกปั่นเป็นเวลา 15 นาทีที่ 10,000 × g เพื่อตะกอนเยื่อ basolateral, mitochondria และสารประกอบเซลล์อื่น ๆ ใสถูกปั่นเป็นเวลา 30 นาทีที่ 47,000 ×กรัมและเม็ดใหม่กลืนหายไปใน 25 มล. ของ buffer เตรียม 80 ไมโครลิตร 0.2 มิลลิ PMSF ในแก้วดำเนินการด้วยตนเอง homogenizer (ซาร์โทเรีย, Göttingen, เยอรมนี) ที่ 1000 รอบต่อนาทีและย้ายไปหมุนเหวี่ยงใหม่ ท่อสำหรับฝนที่สองใน 1.5 M MgSO4 ตัวอย่างหมุนเหวี่ยงอีกครั้งเป็นเวลา 15 นาทีที่ 10,000 × g เพื่อตะกอนเยื่อ basolateral, mitochondria และสารประกอบเซลล์อื่น ๆ อีกครั้ง ใสถูกปั่นเป็นเวลา 30 นาทีที่ 47,000 ×กรัมและเม็ดใหม่ละลายใน 1 มิลลิลิตรของบัฟเฟอร์ Tris-HCl (20 มิลลิค่า pH 7.4) aliquots (100 ไมโครลิตร) ของ BBM ที่มีช่วงล่างที่ถูกเก็บไว้ในหลอด Eppendorff ที่ -80 องศาเซลเซียสสำหรับการวิเคราะห์กิจกรรมของเอนไซม์

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

2.4 . การเตรียมเยื่อแปรงชายแดนแปรงชายแดน

+ ( BBM ) ถูกสร้างขึ้นตามการแก้ไขพิธีสารหลังจากชาง et al . ( 1991 ) , kaune et al . ( 1992 ) และ schr ö der et al . ( 1998 ) ในช่วงสั้น ๆละลาย ( homogenates ผสม 10 ml เย็นเตรียมบัฟเฟอร์ 20 μล. 0.2 มม. PMSF และต่อมาย้ายมาปั่นบด , หลอดเป็นส่วนลงตัวของปริมาณที่ใช้ในการสกัดเอ็มอาร์เอ็นเอ . ส่วนปริมาณที่เหลือใช้ BBM เตรียมโดยการตกตะกอนในสารละลาย MgSO4 ใ 1.5 m . สั้น ๆ , MgSO4 ใเติมตัวอย่างในขณะที่กวน 15 นาทีบนน้ำแข็ง จำนวนระดับ 15 นาทีที่ 10 × G ตกตะกอน basolateral membranes เซลล์ไมโตคอนเดรียและสารประกอบอื่น ๆผู้ที่นำอยู่ที่ระดับ 30 นาทีที่ 47 , ×กรัมเม็ดละลายใน 25 มิลลิลิตร เป็นบัฟเฟอร์การ 80 μล. 0.2 มม. PMSF ในตนเองการโฮโมจิไนซ์ ( แก้ว Sartorius G ö ttingen , เยอรมนี ) ที่ 1000 รอบต่อนาทีและย้ายลงในหลอดที่ 3 ใหม่ สำหรับการตกตะกอนที่สองใน 1.5 M MgSO4 ใ . จำนวนระดับอีก 15 นาทีที่ 10000 × G ตกตะกอน basolateral membranes เซลล์ไมโตคอนเดรียและสารประกอบอื่น ๆอีก ผู้ที่นำอยู่ที่ระดับ 30 นาทีที่ 47 , ×กรัมเม็ดจะละลายใน 1 มิลลิลิตรโดยไฮโดรคลอไรด์บัฟเฟอร์ ( 20 มม. ( pH 7.4 ) เฉยๆ ( 100 μ L ) ของ BBM มีช่วงล่างที่ถูกเก็บไว้ในหลอด eppendorff − 80 °องศาเซลเซียสสำหรับการวิเคราะห์กิจกรรมของเอนไซม์