Table 10: HPLC method (ZX-THF50) fo

Table 10: HPLC method (ZX-THF50) for analysis of glucose, succinic acid, formic acid,
lactic acid, acetic acid, pyruvic acid, propionic acid and ethanol.

HPLC column Aminex HPX-87 H, 300*7.8 mm (BioRad)
Precolumn Cation H
Temperature 50 °C
Eluent flow rate 0.50 ml/min
Injection volume 5.0 pl
Diode array detector RI-Detector
Runtime 28 min
max. pressure 140 bar
Eluent A 5 mM H2SO4
Eluent B 5 mM H2SO4
Gradient Time [min] A[%] B[%] Flow [ml/min]
0.0 50 50 0.50
28.0 50 50 0.50
10





Table 11: HPLC method AA-Alanin for analysis of alanine.

HPLC column Precolumn
Temperature
Eluent flow rate
Injection volume
Diode array detector Runtime
max. pressure Eluent A
Eluent B
Gradient

Gemini C18, 150*4,6 mm (Phenomenex) C18 Gemini
40 °C
1.50 ml/min
0.5 ml
UV-Detector
12 min
300 bar
40 mM NaH2PO4 x H2O (pH 7,8, 1,85 m1/I NaOH [50%]) Acetonitril:Methanol:Water 45:45:10
Time [min] A[%] B[%] Flow [ml/min]
0 80 20 1.5
6 80 20 1.5
7 0 100 1.5
11.5 0 100 1.5
12.5 80 20 1.5


Example 5: Measurement of activity of alanine ดีไฮโดรจีเนส (alaD)

5 Enzyme activity assay Enzyme activities were measured spectrophotometrically at 33°C.
Cells before starting alanine production were harvested by centrifugation (5,000xg, 4°C; 10 min). The cell pellet was washed once with extraction buffer (100 mM Tris-HCI, pH 7.5, 20 mM KCI, 20 mM MgCl2, 0.1 mM EDTA, 2 mM DTT). The resulting cell suspensions were
sonicated using an ultrasonic homogenizer in an ice-water bath for 15 min. Cell debris was 10 removed by centrifugation (10,000xg, 4°C; 30 min). The cell lysates, thus, produced were
subsequently used as crude extracts for enzyme assays. Protein concentrations were
measured using a protein assay kit (Bio-Rad, USA). AIaDH catalyzes formation of alanine
from ไพรูเวต and ammonium ion with consuming NADH. AIaDH activity was measured by
following the decrease in absorbance of NADH at 340 nm, using a spectrophotometer. An 15 assay mixture contained 0.5 mM NADH, 2 mM ไพรูเวต, 100 mM NH4C1 in 100 mM Tris-
HCI, pH 8.5. The reaction was started by the addition of the crude extracts to the assay
mixture (Jojima et al. (2010): Engineering of sugar metabolism of Corynebacterium
glutamicum for production of amino acid L-alanine under oxygen deprivation, AppL
Microbiol. 87, 159-165.
20





25



PF 75583
28
SEQUENCES

SEQ ID NO: 1 (ลำดับนิวคลีโอไทด์ of 16 S rDNA of strain DD1)

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

ตาราง 10: HPLC วิธี (ZX-THF50) สำหรับการวิเคราะห์ของกลูโคส กรด กรดกรด กรดอะซิติก กรดไพรูวิก propionic กรด และเอทานอลคอลัมน์ HPLC 87 Aminex HPX H, 300 * 7.8 มม. (BioRad)Precolumn Cation Hอุณหภูมิ 50 องศาเซลเซียสกระแส Eluent อัตรา 0.50 ml/minฉีดปริมาณ 5.0 plไดโอดอาร์เรย์จับจับ RIรันไทม์ 28 นาทีสูงสุด แรงดัน 140 บาร์กำมะถัน Eluent A 5 มม.กำมะถัน Eluent B 5 มม.เวลาไล่โทนสี [นาที] กระแส [%] B [%] [ml/min]0.0 50 50 0.5028.0 50 50 0.5010ตาราง 11: HPLC วิธีเอเอ Alanin สำหรับการวิเคราะห์ของอะลานีน คอลัมน์ HPLC Precolumnอุณหภูมิ อัตราการไหลของ Eluentปริมาณการฉีด ไดโอดอาร์เรย์จับรันไทม์สูงสุด ความดัน Eluent AEluent Bการไล่ระดับสี ราศีเมถุน C18, 150 * 4, 6 mm (Phenomenex) เมถุน C1840 ° C1.50 ml/min0.5 mlเครื่องตรวจจับรังสียูวี12 นาที300 บาร์40 mM NaH2PO4 x H2O (pH 7,8, 1,85 m1 / ฉัน NaOH [50%]) Acetonitril:Methanol:Water 45:45:10เวลา [นาที] กระแส [%] B [%] [ml/min]0 80 20 1.56 80 20 1.57 0 100 1.50 100 ขนาด 11.5 1.512.5 80 20 1.5 ตัวอย่างที่ 5: การวัดกิจกรรมของดีไฮโดรจีเนสอะลานีน (alaD)5 เอนไซม์ assay เอนไซม์กิจกรรมมีวัด spectrophotometrically องศาเซลเซียสมีการเก็บเกี่ยวเซลล์ก่อนที่จะเริ่มผลิตอะลานีน โดย centrifugation (5, 000xg, 4° C; 10 นาที) เม็ดเซลล์ถูกล้างครั้งเดียว ด้วยบัฟเฟอร์สกัด (100 mM ตรี hci, pH 7.5, 20 มม. KCI, MgCl2, EDTA, 0.1 มม. 20 มม. 2 มม. DTT) บริการเซลล์ผลลัพธ์ได้sonicated ใช้ homogenizer การอัลตราโซนิคในการอาบน้ำแข็งสำหรับ 15 นาทีเศษเซลล์ถูกเอาออก โดย centrifugation 10 (10, 000xg, 4° C; 30 นาที) Lysates เซลล์ ดังนั้น ผลิตได้ ต่อมาใช้เป็นสารสกัดหยาบสำหรับเอนไซม์ assays มีความเข้มข้นของโปรตีน วัดโดยใช้ชุดทดสอบโปรตีน (Bio Rad สหรัฐอเมริกา) AIaDH catalyzes การก่อตัวของอะลานีน จากไพรูเวตและแอมโมเนียไอออนกับใช้ NADH AIaDH กิจกรรมถูกวัดโดย ต่อการลดลงของ absorbance ของ NADH ที่ 340 nm เครื่องทดสอบกรดด่างใช้ การผสมทดสอบ 15 ประกอบด้วย NADH ไพรูเวต 2 มม. 100 มม. NH4C1 มม. 100 ตรี - 0.5 mM Hci, pH 8.5 ปฏิกิริยาเริ่มต้น โดยการเพิ่มสารสกัดจากน้ำมันเพื่อทดสอบการ ส่วนผสม (Jojima et al. (2010): วิศวกรรมของการเผาผลาญน้ำตาลของ Corynebacterium glutamicum การผลิตของกรดอะมิโนอะลานีน L ภายใต้ภาวะขาดออกซิเจน AppL Microbiol 87, 159-1652025 PF 7558328ลำดับลำดับรหัส NO: 1 (ลำดับนิวคลีโอไทด์ของ rDNA S 16 ของต้องใช้ DD1)

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

ตารางที่ 10: วิธี HPLC (ZX-THF50)
สำหรับการวิเคราะห์ของกลูโคสกรดซักรดฟอร์มิ. กรดแลคติกกรดอะซิติกกรด pyruvic กรดโพรพิโอนิและเอทานอลคอลัมน์HPLC Aminex HPX-87 H, 300 * 7.8 มิลลิเมตร (BioRad) Precolumn ไอออนบวก H อุณหภูมิ 50 ° C ตัวชะอัตราการไหล 0.50 มล. / นาทีปริมาณการฉีด5.0 พีอาร์เรย์ไดโอดเครื่องตรวจจับRI-ตรวจจับRuntime 28 นาทีสูงสุด ความดัน 140 บาร์ตัวชะ 5 มิลลิ H2SO4 ตัวชะ B 5 มิลลิ H2SO4 เวลาไล่โทนสี [นาที] เป็น [%] B [%] ไหล [มล. / นาที] 0.0 50 50 0.50 28.0 50 50 0.50 10 ตารางที่ 11: วิธี HPLC AA-Alanin สำหรับ การวิเคราะห์อะลานีน. คอลัมน์ HPLC Precolumn อุณหภูมิตัวชะอัตราการไหลของปริมาณการฉีดเครื่องตรวจจับอาร์เรย์ไดโอดRuntime สูงสุด ดันตัวชะตัวชะ B ไล่โทนสีราศีเมถุน C18 150 * 4,6 มิลลิเมตร (Phenomenex) C18 ราศีเมถุน 40 ° C 1.50 มล. / นาที0.5 มล. UV-ตรวจจับ12 นาที300 บาร์40 มิลลิ NaH2PO4 x H2O (pH 7,8, 1,85 m1 / I NaOH [50%]) Acetonitril: เมทานอล: น้ำ 45:45:10 เวลา [นาที] เป็น [%] B [%] ไหล [มล. / นาที] 0 80 20 1.5 6 1.5 80 20 7 0 100 1.5 11.5 0 100 1.5 12.5 80 1.5 20 ตัวอย่างที่ 5: การวัดการทำงานของอะลานีนดีไฮโดรจีเนส (alaD) 5 การวิเคราะห์กิจกรรมของเอนไซม์กิจกรรมเอนไซม์วัด spectrophotometrically ที่ 33 ° C. เซลล์ก่อนที่จะเริ่มต้นการผลิตอะลานีนถูกเก็บเกี่ยวโดยการหมุนเหวี่ยง (5,000xg 4 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 10 นาที) ตะกอนเซลล์ที่ได้รับการล้างครั้งเดียวกับกันชนสกัด (100 มิลลิ Tris-HCI พีเอช 7.5, 20 มิลลิ KCI 20 มิลลิ MgCl2 0.1 มิลลิ EDTA, 2 มิลลิ DTT) แขวนลอยเซลล์ส่งผลให้ถูกsonicated ใช้ homogenizer ล้ำในห้องอาบน้ำน้ำแข็งน้ำเป็นเวลา 15 นาที เศษเซลล์ 10 ลบออกโดยการหมุนเหวี่ยง (10,000xg 4 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 30 นาที) lysates เซลล์จึงผลิตได้ถูกนำมาใช้เป็นสารสกัดสำหรับการตรวจเอนไซม์ ความเข้มข้นของโปรตีนที่ถูกวัดโดยใช้ชุดทดสอบโปรตีน (Bio-Rad สหรัฐอเมริกา) AIaDH กระตุ้นการก่อตัวของอะลานีนจากไพรูเวตและแอมโมเนียมไอออนที่มีการบริโภคNADH กิจกรรม AIaDH วัดโดยต่อไปนี้การลดลงของการดูดกลืนแสงของNADH ที่ 340 นาโนเมตรโดยใช้สเปก ส่วนผสมทดสอบ 15 มี 0.5 มิลลิ NADH 2 มิลลิไพรูเวต 100 มิลลิ NH4C1 100 มิลลิ Tris- HCI ค่า pH 8.5 ปฏิกิริยาที่เริ่มต้นจากการเพิ่มขึ้นของสารสกัดในการทดสอบที่ผสม (Jojima, et al (2010). วิศวกรรมของการเผาผลาญน้ำตาล Corynebacterium glutamicum สำหรับการผลิตกรดอะมิโน L-อะลานีนภายใต้การกีดกันออกซิเจน Appl. Microbiol 87, 159- 165 20 25 PF 75583 28 ลำดับSEQ ID NO: 1 (ลำดับนิวคลีโอไทด์ของ 16 S rDNA ของสายพันธุ์ DD1)

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

ตารางที่ 10 : วิธี HPLC ( zx-thf50 ) สำหรับการวิเคราะห์ของกลูโคส , น้ำตาล , กรดกรด , กรดอะซิติก , กรดโพรพิออนิก และกรดไพรูวิก , เอทานอลคอลัมน์ HPLC aminex hpx-87 H , 300 * 7.8 มม. ( biorad )precolumn Cation Hอุณหภูมิ 50 องศาซีอัตราการไหลของสารละลาย 0.50 มิลลิลิตรต่อนาทีการฉีดปริมาณ 5.0 .เครื่องตรวจจับเครื่องตรวจจับไดโอด เรย์ริRuntime 28 นาทีแม็กซ์ แรงดัน 140 บาร์ตัว 5 กรดซัลฟิวริกมม.ตัว B 5 มม. กรดซัลฟิวริกการไล่ระดับสีเวลา [ มิน ] [ % ] b [ % ] กระแส [ มิลลิลิตรต่อนาที ]0.0 50 50 0.5028 50 50 0.5010ตารางที่ 11 : HPLC วิธีลานิน AA สำหรับการวิเคราะห์อะลานีน .precolumn คอลัมน์ HPLCอุณหภูมิอัตราการไหลของสารละลายปริมาณการฉีดเครื่องตรวจจับตัวไดโอดอาร์เรย์แม็กซ์ ความดันนี้เป็นตัวบีการไล่ระดับสีราศีเมถุน c18 150 * 6 มิลลิเมตร ( phenomenex ) c18 ราศีเมถุน40 ° C1.50 มิลลิลิตร / นาที0.5 มล.เครื่องตรวจจับรังสียูวี12 นาที300 บาร์nah2po4 x 40 มม. ( pH 7 , 8 1,85 h2o , M1 / ผมใช้ [ 50% ] ) acetonitril : เมทานอล : น้ำ 45:45:10เวลา [ มิน ] [ % ] b [ % ] กระแส [ มิลลิลิตรต่อนาที ]0 80 20 สำหรับ6 80 20 สำหรับ7 0 100 สำหรับ11.5 0 100 สำหรับ12.5 80 20 สำหรับตัวอย่างที่ 5 การวัดกิจกรรมของอะลานีนดีไฮโดรจีเนส ( พิษ )5 ) กิจกรรมเอนไซม์เอนไซม์ชนิดนี้ที่ 33 องศาเซลล์ก่อนที่จะเริ่มการผลิตอะลานีนถูกเก็บเกี่ยวโดยการปั่นเหวี่ยง ( 5000xg 4 ° C ; 10 นาที ) เซลล์เม็ดซักครั้งกับบัฟเฟอร์การสกัด ( 100 มม. โดยกรดไฮโดรคลอริก pH 7.5 , 20 mm KCl , 20 มม. ชุด 0.1 mM EDTA , 2 - 20 ) ส่งผลให้เซลล์แขวนลอยอยู่sonicated โดยใช้ Ultrasonic Homogenizer ในน้ำแข็ง น้ำที่อาบ 15 นาทีเศษเซลล์ 10 ลบด้วย 3 ( 10000xg 4 ° C ; 30 นาที ) เซลล์ lysates จึงผลิตคือต่อมาใช้เป็นสารสกัดสำหรับตรวจเอนไซม์ . ความเข้มข้นของโปรตีน คือวัดโดยใช้โปรตีน 3 ชุด ( USA ชีวภาพราด ) aiadh กระตุ้นการก่อตัวของอะลานีนจากไพรูเวตและแอมโมเนียมไอออนด้วยการบริโภคแอมโมเนีย กิจกรรม aiadh วัดด้วยต่อไปนี้การลดลงของค่าแอมโมเนียที่ 340 นาโนเมตรโดยใช้วัสดุ มี 15 วิธีผสมมี NADH 0.5 มม. , 2 มม. ไพรูเวต 100 มม. nh4c1 ในบริษัท - 100 มิลลิเมตรกรดไฮโดรคลอริก pH 8.5 . ปฏิกิริยาเริ่มต้น โดยการเพิ่มสารสกัดหยาบไป การทดสอบส่วนผสม ( jojima et al . ( 2010 ) : วิศวกรรมน้ำตาลการเผาผลาญโคโรนีแบคทีเรียมglutamicum ผลิตกรดอะมิโนอะลานีนภายใต้การกีดกันออกซิเจน แอปเปิ้ลธนิดา เหรียญทอง B Sc . 87 , 159-165 .2025PF 7558328 .ลําดับseq id : 1 ( ลำดับนิวคลีโอไทด์ 16 S rDNA ของ DD1 เมื่อย )