We investigated effects of malic en

We investigated effects of malic enzyme on ethanol production by Synechocystis sp. PCC 6803 under autotrophic conditions. Deletion of me, which encodes malic enzyme, decreased ethanol production, whereas its overexpression had no effect. Our results suggest that maintaining optimal malic enzyme activity controls ethanol production by Synechocystis sp. PCC 6803.
Key words

Synechocystis sp. PCC 6803; Malic enzyme; Ethanol; Cyanobacteria; Bioproduction

Because of the increase in atmospheric carbon dioxide concentration and global warming, bioproduction of fuels and chemicals will be necessary for achieving a sustainable society. Cyanobacteria are photosynthetic microorganisms that produce chemicals from carbon dioxide and sunlight. Using cyanobacteria for bioproduction instead of other microorganisms offers advantages such as not competing with food resources; this has attracted increasing attention to cyanobacteria as host organisms for bioproduction. Recently, cyanobacteria have been used successfully to produce various fuels and chemicals such as ethanol 1, 2 and 3, butanol (4), carbohydrates (5), and other compounds (6).

Because ethanol is one of the most promising alternatives to fossil fuels, our study focused on producing ethanol by using the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803 (hereafter, PCC 6803). Ethanol-producing strains of cyanobacteria were constructed by introducing genes encoding pyruvate decarboxylase (pdc) and alcohol dehydrogenase II (adh) from Zymomonas mobilis 1 and 2. Recently, ethanol production by PCC 6803 was improved by overexpressing slr1192, which encodes an NADPH-dependent alcohol dehydrogenase (ADH), instead of expressing the gene encoding NADH-dependent ADH of Z. mobilis (3). However, the effects on ethanol production of deleting or overexpressing genes in cyanobacteria have not been investigated. One key strategy to enhance the production of a target compound is to increase the supply of a precursor. Malic enzyme catalyzes the reversible conversion of malate and pyruvate, and pyruvate is a precursor of ethanol production 7 and 8. In PCC 6803, metabolic flux analysis using 13C-labeled carbon dioxide suggested that the malic enzyme is active and coverts malate to pyruvate under autotrophic conditions (9). Therefore, we analyzed the effect of deleting and overexpressing me (slr0721), the gene encoding malic enzyme, on ethanol production by PCC 6803 under autotrophic conditions.

The glucose-tolerant strain of PCC 6803 (10) was used as the host in this study. PCC 6803 was cultivated in modified BG-11 medium (11), whose pH was adjusted to 7.5 using 1 M KOH. Cells were cultivated autotrophically in 100-mL Erlenmeyer flasks with 20 mL of modified BG-11 medium at 34°C with rotary agitation at 150 rpm (BR-43FL shaker; TAITEC Co., Ltd., Japan) under continuous illumination (approximately 100 μmol of photons/m2/s) by white light-emitting diodes (LC-LED450W, TAITEC Co., Ltd., Japan).

We constructed 4 ethanol-producing strains of PCC 6803 (Table 1). The details of the construction of these strains are described in Supplementary materials (Figs. S1 and S2 and Table S1). Briefly, the me-deleted strain (Δme) was constructed by replacing me with a kanamycin-resistance gene. To construct the ethanol-producing strains, pdc and adh were obtained from Z. mobilis as previously described 1 and 2. These genes were introduced into the neutral site located downstream from ndhB (sll0223) (12) in both wild-type PCC 6803 and the Δme strain to generate the 6803/EtOH strain and the Δme/EtOH strain, respectively. pdc and adh were controlled by the promoter of nblA (ssl0452) via its role in phycobilisome degradation. In the previous studies, the strong promoters, such as psbA2 and rbcLS, were used for expression of pdc and adh 1 and 2. We also tried to construct the ethanol producing strains using the strong psbA2 promoter for pdc and adh. However, the transformants showed sever growth inhibition, and we could not obtained the ethanol producing strains. Thus the lower expression promoter, nblA promoter used in other study (13), was applied in the present study. To check whether the deleted me could be complemented, me with its own promoter region was obtained from the genomic DNA of PCC 6803, and the DNA fragment was introduced into the neutral site located in slr0168 (14) of the Δme/EtOH strain to generate the Δme/me/EtOH strain. The me-overexpressing strain (6803/ME/EtOH) was constructed by introducing me with the strong psbA2 promoter into the neutral site (slr0168) of the 6803/EtOH strain. Transformation was performed as previously described (15). Transformants were repeatedly streaked on BG11 plates supplemented with appropriate antibiotics such as 20 μg/mL kanamycin, 20 μg/mL streptomycin, and 2 μg/mL ampicillin, until complete segregation of each mutant was confirmed by disparity in the sizes of the PCR products ( Supplementary Fig. S2).

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

เราตรวจสอบผลของเอนไซม์ malic ผลิตเอทานอล โดย Synechocystis sp. PCC 6803 autotrophic สภาวะ การลบของฉัน ซึ่งจแมปเอนไซม์ malic ลดการผลิตเอทานอล ขณะ overexpression ของก็ไม่มีผล ผลของเราแนะนำว่า รักษาเอนไซม์ malic เหมาะสมควบคุมการผลิตเอทานอล โดย Synechocystis sp. PCC 6803คำสำคัญ Synechocystis sp. PCC 6803 เอนไซม์ malic เอทานอล Cyanobacteria Bioproductionเนื่องจากการเพิ่มขึ้นในบรรยากาศคาร์บอนไดออกไซด์ความเข้มข้นและภาวะโลกร้อน bioproduction ของเชื้อเพลิงและเคมีภัณฑ์จะจำเป็นสำหรับการบรรลุสังคมอย่างยั่งยืน Cyanobacteria เป็นจุลินทรีย์ที่ผลิตสารเคมีคาร์บอนไดออกไซด์และแสงแดด ใช้ cyanobacteria bioproduction แทนจุลินทรีย์อื่น ๆ มีข้อดีเช่นไม่แข่งขันกับทรัพยากรอาหาร นี้ได้ดึงดูดความสนใจเพิ่มขึ้น cyanobacteria เป็นสิ่งมีชีวิตในการโฮสต์สำหรับ bioproduction ล่าสุด cyanobacteria ใช้ประสบความสำเร็จในการผลิตเชื้อเพลิงต่าง ๆ และสารเคมีเช่นเอทานอล 1, 2 และ 3 บิวทานอ (4), คาร์โบไฮเดรต (5), และสารอื่น ๆ (6)เนื่องจากเอทานอลเป็นหนึ่งในตัวแทนว่าเชื้อเพลิงฟอสซิล เรามุ่งเน้นในการผลิตเอทานอลโดยใช้ sp. Synechocystis cyanobacterium PCC 6803 (โดย PCC 6803) สายพันธุ์ที่ผลิตเอทานอลของ cyanobacteria ถูกสร้าง โดยการแนะนำยีนเข้ารหัส pyruvate decarboxylase (pdc) และแอลกอฮอล์ dehydrogenase II (อัซ) จาก Zymomonas mobilis 1 และ 2 ผลิตเอทานอล โดย PCC 6803 ถูกปรับปรุง โดย overexpressing slr1192 ซึ่งจแมปขึ้นอยู่กับการ NADPH แอลกอฮอล์ dehydrogenase (อัซ), แทนแสดงยีน mobilis อัซ z.ขึ้นอยู่กับ NADH (3) การเข้ารหัส ล่าสุด อย่างไรก็ตาม ผลผลิตเอทานอลบ หรือ overexpressing ยีนใน cyanobacteria ได้ไม่ถูกตรวจสอบ กลยุทธ์หนึ่งที่สำคัญเพื่อเพิ่มประสิทธิภาพการผลิตของสารประกอบเป้าหมายคือการ เพิ่มอุปทานของสารตั้งต้น เอนไซม์ malic catalyzes แปลงกลับมาลาและ pyruvate และ pyruvate เป็นสารตั้งต้นของการผลิตเอทานอล 7 และ 8 PCC 6803 วิเคราะห์เผาผลาญฟลักซ์ที่ใช้ป้าย 13C คาร์บอนไดออกไซด์แนะนำว่า เอนไซม์ malic ใช้งานอยู่และ coverts มาลาไป pyruvate autotrophic สภาวะ (9) ดังนั้น เราสามารถวิเคราะห์ผลของการลบ และ overexpressing ฉัน (slr0721), ยีนเอนไซม์ malic ในการผลิตเอทานอลโดย PCC 6803 autotrophic สภาวะการเข้ารหัสมีใช้พันธุ์ทนกับกลูโคสของ PCC 6803 (10) เป็นโฮสต์ในการศึกษานี้ PCC 6803 ถูกปลูกในปรับเปลี่ยน BG-11 กลาง (11), pH ถูกปรับปรุงให้ 7.5 ใช้ M 1 เกาะ เซลล์ถูกปลูก autotrophically ในน้ำ Erlenmeyer 100 mL มีปริมาณ 20 mL ของปรับเปลี่ยน BG-11 กลางที่ 34° C มีอาการกังวลต่อโรตารี่ที่ 150 rpm (เชคเกอร์ BR-43FL ญี่ปุ่น TAITEC Co., Ltd. ) ภายใต้แสงสว่างต่อเนื่อง (ประมาณ 100 μmol photons/m2/s) โดยสีขาวไฟ–เปล่ง diodes (LC-LED450W, TAITEC Co., Ltd. ญี่ปุ่น)เราสร้าง 4 ผลิตเอทานอลสายพันธุ์ของ PCC 6803 (ตาราง 1) รายละเอียดการก่อสร้างของสายพันธุ์เหล่านี้ไว้ในวัสดุเสริม (มะเดื่อ S1 และ S2 แล้วตาราง S1) สั้น ๆ ฉันถูกสายพันธุ์ (Δme) ถูกสร้าง โดยแทนฉันกับยีนต้านทานกานามัยซิน การสร้างสายพันธุ์ที่ผลิตเอทานอล pdc และอัซได้รับมาจาก mobilis z. 1 และ 2 อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ ยีนเหล่านี้ถูกนำเข้าสู่เว็บไซต์กลางห้องน้ำจาก ndhB (sll0223) (12) ในป่าชนิด PCC 6803 และ Δme สายพันธุ์เพื่อสร้างพันธุ์ 6803/EtOH และพันธุ์ Δme/EtOH ตามลำดับ pdc และอัซถูกควบคุม โดยโปรโมเตอร์ของ nblA (ssl0452) ผ่านบทบาทของมันในการลด phycobilisome ในการศึกษาก่อนหน้านี้ ก่อแข็งแรง psbA2 และ rbcLS ถูกใช้ในนิพจน์ของ pdc และอัซ 1 และ 2 นอกจากนี้เรายังพยายามสร้างเอทานอลที่ผลิตสายพันธุ์โดยใช้โปรโมเตอร์ psbA2 แข็งแรงสำหรับ pdc และอัซ อย่างไรก็ตาม transformants แสดงให้เห็นว่า ตัดยับยั้งการเจริญเติบโต และเราไม่ได้รับเอทานอลที่ผลิตสายพันธุ์ โปรโมเตอร์นิพจน์ล่าง โปรโมเตอร์ nblA ที่ใช้ในการศึกษาอื่น ๆ (13), จึง นำมาใช้ในการศึกษาปัจจุบัน การตรวจสอบว่า ถูกลบผมไม่ครบครัน ฉันกับภูมิภาคโปรโมเตอร์ของตนเองถูกได้รับจากที่ genomic DNA ของ PCC 6803 และดีเอ็นเอส่วนถูกนำลงในเว็บไซต์กลางที่ตั้งอยู่ใน slr0168 (14) ของ Δme/EtOH สายพันธุ์เพื่อสร้างพันธุ์ Δme/ฉัน/EtOH ฉัน-overexpressing พันธุ์ (6803/ME/EtOH) ถูกสร้าง โดยการแนะนำฉันกับโปรโมเตอร์ psbA2 แข็งแรงเข้าไปในไซต์ที่เป็นกลาง (slr0168) ของพันธุ์ 6803/EtOH การเปลี่ยนแปลงที่ดำเนินการอธิบายไว้ก่อนหน้านี้ (15) Transformants มีลายซ้ำ ๆ กันบนแผ่น BG11 เสริม ด้วยยาปฏิชีวนะที่เหมาะสมเช่นกานามัยซิน μg/mL 20, 20 μg/mL streptomycin และแอมพิซิลลิ น μg 2 mL จนกว่าจะมีการแบ่งแยกแต่ละ mutant สมบูรณ์ได้รับการยืนยัน โดย disparity ขนาดผลิตภัณฑ์ PCR (ฟิกเสริม S2)

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

เราตรวจสอบผลกระทบของเอนไซม์มาลิกในการผลิตเอทานอลโดย Synechocystis SP PCC 6803 ภายใต้เงื่อนไข autotrophic การลบฉันซึ่งเข้ารหัสเอนไซม์ malic ลดลงการผลิตเอทานอลในขณะที่แสดงออกมันก็ไม่มีผล ผลของเราแสดงให้เห็นว่าการรักษาที่ดีที่สุดกิจกรรมของเอนไซม์ malic ควบคุมการผลิตเอทานอลโดย Synechocystis SP PCC 6803.
คำสำคัญSynechocystis SP PCC 6803; เอนไซม์ Malic; เอทานอล; ไซยาโนแบคทีเรีย; ผลิตภัณฑ์ชีวภาพเนื่องจากการเพิ่มขึ้นของความเข้มข้นของก๊าซคาร์บอนไดออกไซด์ในชั้นบรรยากาศและภาวะโลกร้อนของเชื้อเพลิงชีวภาพและสารเคมีที่จะมีความจำเป็นเพื่อให้บรรลุสังคมที่ยั่งยืน ไซยาโนแบคทีเรียเป็นจุลินทรีย์สังเคราะห์แสงที่ผลิตสารเคมีจากก๊าซคาร์บอนไดออกไซด์และแสงแดด สำหรับการใช้ไซยาโนแบคทีเรียชีวภาพแทนจุลินทรีย์อื่น ๆ มีข้อได้เปรียบเช่นไม่ได้แข่งขันกับทรัพยากรอาหาร นี้ได้รับความสนใจเพิ่มขึ้นเพื่อเป็นไซยาโนแบคทีเรียมีชีวิตเจ้าภาพชีวภาพ เมื่อเร็ว ๆ นี้ไซยาโนแบคทีเรียที่ได้รับการใช้ประสบความสำเร็จในการผลิตเชื้อเพลิงต่างๆและสารเคมีเช่นเอทานอลที่ 1, 2 และ 3 บิวทานอ (4), คาร์โบไฮเดรต (5) และสารประกอบอื่น ๆ (6). เพราะเอทานอลเป็นหนึ่งในทางเลือกที่มีแนวโน้มมากที่สุดที่จะฟอสซิล เชื้อเพลิงการศึกษาของเรามุ่งเน้นไปที่การผลิตเอทานอลโดยใช้ไซยาโนแบคทีเรีย Synechocystis SP PCC 6803 (ต่อ PCC 6803) สายพันธุ์เอทานอลที่ผลิตของไซยาโนแบคทีเรียที่ถูกสร้างขึ้นโดยการแนะนำยีนเข้ารหัส decarboxylase ไพรู (PDC) และเครื่องดื่มแอลกอฮอล์ dehydrogenase II (ADH) จาก Zymomonas mobilis 1 และ 2 เมื่อเร็ว ๆ นี้โดยการผลิตเอทานอล PCC 6803 ได้รับการปรับปรุงโดย overexpressing slr1192 ซึ่ง encodes NADPH ขึ้นอยู่กับ dehydrogenase แอลกอฮอล์ (ADH) แทนการแสดงยีน NADH ขึ้นอยู่กับดะห์ของซี mobilis (3) อย่างไรก็ตามผลกระทบต่อการผลิตเอทานอลในการลบหรือ overexpressing ยีนในไซยาโนแบคทีเรียไม่ได้รับการตรวจสอบ กลยุทธ์หนึ่งที่สำคัญในการเพิ่มประสิทธิภาพการผลิตของสารประกอบเป้าหมายคือการเพิ่มอุปทานของสารตั้งต้น เอนไซม์ Malic เร่งปฏิกิริยาย้อนกลับของการแปลง malate และไพรูและไพรูเป็นสารตั้งต้นของการผลิตเอทานอล 7 และ 8 ใน PCC 6803 การวิเคราะห์การไหลของการเผาผลาญอาหารที่ใช้ก๊าซคาร์บอนไดออกไซด์ 13C ที่มีข้อความบอกว่าเอนไซม์ malic การใช้งานและการ coverts malate ไพรูภายใต้ autotrophic เงื่อนไข (9) ดังนั้นเราจึงวิเคราะห์ผลกระทบของการลบและ overexpressing ฉัน (slr0721) ยีนเอนไซม์มาลิกในการผลิตเอทานอลโดย PCC 6803 ภายใต้เงื่อนไข autotrophic. สายพันธุ์ที่ทนต่อกลูโคสของ PCC 6803 (10) ถูกนำมาใช้เป็นเจ้าภาพในการศึกษานี้ . PCC 6803 ได้รับการปลูกฝังในการปรับเปลี่ยนขนาดกลาง BG-11 (11) ซึ่งมีการปรับค่า pH 7.5 ใช้ M 1 เกาะ เซลล์ที่ถูกปลูก autotrophically ใน Erlenmeyer 100 มิลลิลิตรขวด 20 มิลลิลิตรปรับเปลี่ยนขนาดกลาง BG-11 ที่ 34 ° C มีการกวนหมุนที่ 150 รอบต่อนาที (BR-43FL ปั่น; TAITEC จำกัด ประเทศญี่ปุ่น) ภายใต้การส่องสว่างต่อเนื่อง (ประมาณ 100 ไมโครโมลโฟตอน / m2 / s) โดยไดโอดเปล่งแสงสีขาว (LC-LED450W, TAITEC จำกัด ญี่ปุ่น). เราสร้าง 4 สายพันธุ์เอทานอลที่ผลิตจาก PCC 6803 (ตารางที่ 1) รายละเอียดของการก่อสร้างสายพันธุ์เหล่านี้ได้อธิบายไว้ในวัสดุเสริม (มะเดื่อ. S1 และ S2 และตาราง S1) สั้น ๆ , ความเครียดฉันลบ (Δme) ถูกสร้างขึ้นโดยการเปลี่ยนฉันด้วยยีน kanamycin ต้านทาน ในการสร้างสายพันธุ์เอทานอลที่ผลิต, PDC และ adh ที่ได้รับจาก Z. mobilis ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ที่ 1 และ 2 ยีนเหล่านี้ถูกนำเข้าสู่เว็บไซต์ที่เป็นกลางอยู่ล่องจาก ndhB (sll0223) (12) ทั้งในป่าชนิด PCC 6803 และ สายพันธุ์เพื่อสร้างΔme 6803 / EtOH ความเครียดและความเครียดΔme / EtOH ตามลำดับ PDC adh และถูกควบคุมโดยโปรโมเตอร์ของ nblA (ssl0452) ผ่านบทบาทในการย่อยสลาย phycobilisome ในการศึกษาก่อนหน้านี้ผู้สนับสนุนที่แข็งแกร่งเช่น psbA2 rbcLS และถูกนำมาใช้สำหรับการแสดงออกของ PDC และ adh 1 และ 2 นอกจากนี้เรายังพยายามที่จะสร้างสายพันธุ์การผลิตเอทานอลโดยใช้ก่อการ psbA2 ที่แข็งแกร่งสำหรับการ PDC และ adh แต่แสดงให้เห็น transformants ตัดการยับยั้งการเจริญเติบโตและเราไม่สามารถได้รับการผลิตเอทานอลสายพันธุ์ ดังนั้นการแสดงออกที่ต่ำกว่าผู้ก่อการก่อการ nblA ใช้ในการศึกษาอื่น ๆ (13) ถูกนำมาใช้ในการศึกษาปัจจุบัน เพื่อตรวจสอบว่าลบฉันจะได้รับการเสริม, ฉันกับภูมิภาคโปรโมเตอร์ของตัวเองที่ได้รับจากดีเอ็นเอของ PCC 6803 และชิ้นดีเอ็นเอถูกนำเข้าสู่เว็บไซต์ที่เป็นกลางอยู่ใน slr0168 (14) ของสายพันธุ์Δme / EtOH ในการสร้าง Δme / ฉัน / ความเครียด EtOH ความเครียดฉัน overexpressing (6803 / ME / EtOH) ถูกสร้างขึ้นโดยการแนะนำผมด้วยโปรโมเตอร์ psbA2 แข็งแกร่งในเว็บไซต์ที่เป็นกลาง (slr0168) ของ 6803 / ความเครียด EtOH การเปลี่ยนแปลงที่ได้ดำเนินการตามที่ระบุไว้ก่อนหน้านี้ (15) Transformants ถูกลายซ้ำ ๆ บนจาน BG11 เสริมด้วยยาปฏิชีวนะที่เหมาะสมเช่น 20 ไมโครกรัม / มิลลิลิตร kanamycin 20 ไมโครกรัม streptomycin / มิลลิลิตรและ 2 ไมโครกรัม ampicillin / มิลลิลิตรจนถึงแยกที่สมบูรณ์ของแต่ละกลายพันธุ์ได้รับการยืนยันจากความแตกต่างในขนาดของผลิตภัณฑ์ PCR ( เสริมรูป. S2)

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

เราศึกษาผลของเอนไซม์มาลิคการผลิตเอทานอลโดย synechocystis sp . หรือ 6803 ภายใต้เงื่อนไขโตโทรฟ . ตัดผมที่ encodes malic enzyme ลดลง การผลิตเอทานอล ส่วนของ overexpression ไม่มีผลเลย จากผลการศึกษานี้ การรักษาที่เหมาะสมเอนไซม์มาลิคการควบคุมการผลิตเอทานอลโดย synechocystis sp . หรือคำสำคัญ 6803 .

synechocystis sp .PCC 6803 ; malic enzyme ; เอทานอล ; ต้นกล้า ; ปฏกริยาตอบสนอง

เนื่องจากการเพิ่มขึ้นของความเข้มข้นของก๊าซคาร์บอนไดออกไซด์ในชั้นบรรยากาศ และภาวะโลกร้อน ปฏกริยาตอบสนองของเชื้อเพลิงและสารเคมีจะเป็นขบวนการสังคมที่ยั่งยืน ไซยาโนแบคทีเรียเป็นจุลินทรีย์สังเคราะห์แสงผลิตสารเคมีจากคาร์บอนไดออกไซด์ และ แสงแดดการใช้ต้นกล้าปฏกริยาตอบสนองของเชื้อจุลินทรีย์อื่น ๆแทน มีข้อดี เช่น ไม่แข่งขันกับแหล่งอาหาร นี้ได้ดึงดูดความสนใจเพิ่มขึ้นในไซยาโนแบคทีเรียเป็นสิ่งมีชีวิตปฏกริยาตอบสนองของโฮสต์สำหรับ . เมื่อเร็ว ๆนี้ กฟภ. ได้เรียบร้อยแล้วใช้ผลิตเชื้อเพลิงและเคมีภัณฑ์ต่าง ๆ เช่น เอทานอล 1 , 2 และ 3 , บิวทานอล ( 4 ) , ( 5 ) , คาร์โบไฮเดรตและสารประกอบอื่น ๆ ( 6 ) .

เพราะเอทานอลเป็นหนึ่งในทางเลือกที่เป็นไปได้มากที่สุดกับเชื้อเพลิงฟอสซิล , การศึกษาของเราเน้นการผลิตเอทานอลโดยใช้ไซยาโนแบคทีเรีย synechocystis sp . หรือ 6803 ( ต่อจากนี้ , PCC 6803 )ผลิตเอทานอลของไซยาโนแบคทีเรียสายพันธุ์ถูกสร้างโดยการนำยีนไพรูเวทใช้รหัสอักขระ ( PDC ) และแอลกอฮอล์ dehydrogenase ( ADH ) จาก Zymomonas mobilis ครั้งที่ 1 และ 2 เมื่อเร็วๆ นี้ การผลิตเอทานอลโดย PCC 6803 ปรับปรุง overexpressing slr1192 ซึ่งเข้ารหัสเป็น nadph ขึ้นอยู่กับยาถ่าย ( ADH ) แทนที่จะแสดงยีนขึ้นอยู่กับการเข้ารหัสของ NADH กายินทรีย์ Zmobilis ( 3 ) อย่างไรก็ตาม ผลกระทบต่อการผลิตเอทานอลของการลบหรือ overexpressing ยีนในไซยาโนแบคทีเรียยังไม่ได้ตรวจสอบ กลยุทธ์หนึ่งที่สำคัญในการเพิ่มประสิทธิภาพการผลิตของสารประกอบที่เป็นเป้าหมายการเพิ่มอุปทานของโปรตีน . malic enzyme และแปลงกลับของ Malate และไพรูเวทและไพรูเวตเป็นสารตั้งต้นของการผลิตเอทานอลที่ 7 และ 8 ใน 6803 PCC ,