2. Materials andmethods2.1. Animal

2. Materials andmethods
2.1. Animal husbandry and acclimation
Juvenile C. punctatum(3–6months old,mass=36.37±29.1 g; n=
15) were collected from a captive bred population at UnderWater
World (Mooloolaba, QLD, Australia) and transported by car to The University
of Queensland, Brisbane. Sharks were divided across nine 40 L
aquaria (25 °C, 34‰) and allowed to acclimatise for a week. Salinity
was monitored daily using a portable optical refractometer. Saltwater
was made using reverse osmosis water and commercial sea salt
(Ocean Nature, Aquasonic). Sharks were fed daily with raw prawns
and fish. Each of the sharks were then assigned to one of three experimental
salinities: hyposaline (25‰; n = 5), hypersaline (40‰; n = 4)
or control (34‰; n = 6) SW. Tanks were adjusted to these salinities
slowly over a period of 10 days through the addition of reverse osmosis
water (hyposaline) or extra salt (hypersaline).When appropriate salinities
were attained for all treatments, the sharks were allowed to acclimate
for a period of two weeks. Sharks were fasted for 72 h before
being anaesthetised in clove oil (Sigma Aldrich, Australia; 175 mg/L)
and then pithed.
2.2. Tissue sampling
A blood sample was taken from each euthanized animal via caudal
puncture. The first hemibranch of the gills were then excised and snap
frozen in liquid nitrogen before being stored at −80 °C until required
for NKA activity analyses. The second hemibranch on each side were
also excised and fixed in neutral buffered formalin (NBF) overnight at
4 °C. Fixed samples were placed into 70% ethanol and stored until
processing at −20 °C. The rectal gland was also removed from each
shark, snap frozen and stored at −80 °C.
2.3. Haematocrit and plasma solute concentrations
Blood samples were immediately centrifuged at 5000 g for 3 min
and the plasma was removed and stored at −20 °C prior to analysis. A
small capillary tube of whole blood was centrifuged at 10,000 g for
1 min to determine haematocrit (HCT). The osmolality of the plasma
was determined in triplicate using a Vapro 5520 vapour pressure
osmometer (Wescor, Logan, UT, USA). Osmolality of the aquarium
water was also measured. Plasma samples were diluted by 55% in
ultrapure water (Millipore) and ion concentrations (Na+, Cl− and
K+) were determined using an iStat Analyser (Abaxis, USA) and
EC8+cartridges. Plasma urea concentration was determined in triplicate
using a Quantichrom™ Urea Assay Kit (BioAssay Systems, USA). Briefly,
plasma samples were diluted 1:60 in ultrapure water (Millipore) with
5 μL then added to 200 μL of working reagent. This reaction mixture
was allowed to incubate at roomtemperature for 30 min and absorbance
read at 485 nm.
2.4. NKA activity
The activity of NKA in samples of rectal gland and gill tissue was
measured as per Else et al. (1996) as described in Cramp et al. (2009).
Briefly, samples of rectal gland and gill tissue were taken from storage
at −80 °C, weighed and suspended in ice-cold homogenisation buffer
(in mmol L−1: 250 sucrose, 5 EDTA, 20 imidazole and 2.4 sodium
deoxycholate, pH 7.4) at a concentration of 2.5% w/v and 5% w/v,
respectively. Homogenates (50 μL) were incubated for 10 min at room
temperature in assay buffer (in mmol L−1: 80 Tris (hydroxymethyl)
aminomethane HCl, 5 MgCl·6H2O, 120 NaCl, 20 KCl and 5 NaN3,
pH 7.5) with or without ouabain (1 mmol L−1). The difference in

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

2. วัสดุ andmethods2.1. สัตวบาลและ acclimationเยาวชน C. punctatum (มวลเก่า 3 – 6months = 36.37±29.1 g; n =15) ถูกเก็บรวบรวมจากประชากร bred ภายในกิจการและในห้องใต้ท้องทะเลโลก (มูลูลาบา QLD ออสเตรเลีย) และขนส่ง โดยรถยนต์ที่มหาวิทยาลัยของรัฐควีนส์แลนด์ บริสเบน ปลาฉลามถูกแบ่งระหว่างเก้า 40 Lอควาเรีย (25 ° C, 34‰) และ acclimatise สำหรับสัปดาห์ เค็มมีการตรวจสอบทุกวันโดยใช้ refractometer แสงแบบพกพา น้ำเค็มทำใช้น้ำออสโมซิสผันกลับและเกลือทะเลเชิงพาณิชย์(ทะเลธรรมชาติ Aquasonic) ปลาฉลามที่เลี้ยงทุกวันกุ้งดิบและปลา ของปลาฉลามแล้วถูกกำหนดให้หนึ่งในสามที่ทดลองsalinities: hyposaline (25‰; n = 5), hypersaline (40‰; n = 4)หรือตัวควบคุม (34‰; n = 6) ได้ปรับปรุงถัง SW. salinities เหล่านี้ช้ากว่าระยะเวลา 10 วันโดยการเพิ่มการออสโมซิสผันกลับน้ำ (hyposaline) หรือเกลือเพิ่มเติม (hypersaline) เมื่อเหมาะสม salinitiesได้บรรลุการรักษาทั้งหมด ปลาฉลามได้รับอนุญาตให้ acclimateสำหรับรอบระยะเวลาสองสัปดาห์ ปลาฉลามได้อดสำหรับ h 72 ก่อนกำลัง anaesthetised ในน้ำมันกานพลู (Aldrich ซิก ออสเตรเลีย 175 mg/L)แล้ว pithed2.2. เนื้อเยื่อสุ่มตัวอย่างตัวอย่างเลือดที่ได้มาจากสัตว์แต่ละ euthanized ผ่าน caudalเจาะ Hemibranch แรกของ gills ถูกแล้ว excised และ snapแช่แข็งในไนโตรเจนเหลวก่อนที่จะถูกเก็บไว้ที่ −80 ° C จนกว่าจำเป็นสำหรับ NKA กิจกรรมวิเคราะห์ Hemibranch สองด้านได้นอกจากนี้ excised และถาวรในกลางถูกบัฟเฟอร์ formalin (NBF) ค้างคืนที่4 องศาเซลเซียส ตัวอย่างถาวรอยู่ในเอทานอล 70% และเก็บไว้จนประมวลผลที่ −20 องศาเซลเซียส ต่อมไส้ได้ถูกเอาออกจากแต่ละปลาฉลาม snap แช่แข็ง และเก็บไว้ที่ −80 องศาเซลเซียส2.3 ความเข้มข้นตัว Haematocrit และพลาสม่าตัวอย่างเลือดได้ทันที centrifuged ที่ 5000 g ใน 3 นาทีและสม่าถูกเอาออก และเก็บไว้ที่ −20 ° C ก่อนวิเคราะห์ Aหลอดเส้นเลือดฝอยขนาดเล็กของเลือดทั้งหมดถูก centrifuged ที่ g 10000 สำหรับ1 นาทีกำหนด haematocrit (HCT) Osmolality ของพลาสมากำหนดในการใช้ความดันไอ Vapro 5520 triplicateosmometer (Wescor โล UT สหรัฐอเมริกา) Osmolality ของพิพิธภัณฑ์สัตว์น้ำนอกจากนี้ยังมีวัดน้ำ ตัวอย่างพลาสมาถูกทำให้เจือจาง โดย 55% ในน้ำ ultrapure (มาก) และความเข้มข้นของไอออน (Na + Cl− และK+) ถูกกำหนดโดยใช้การ iStat Analyser (Abaxis สหรัฐอเมริกา) และEC8 + ตลับ กำหนดความเข้มข้นของยูเรียพลาสมาใน triplicateใช้แบบ Quantichrom ™ Urea Assay Kit (BioAssay ระบบ สหรัฐอเมริกา) สั้น ๆตัวอย่างพลาสม่าดี 1:60 แตกออกน้ำ ultrapure (มาก) ด้วยΜL 5 ที่เพิ่มเข้าไป μL 200 ของรีเอเจนต์ในการทำงาน ส่วนผสมของปฏิกิริยานี้ได้รับอนุญาตให้ฟักที่ roomtemperature absorbance และ 30 นาทีอ่านที่ 485 nm2.4. กิจกรรม NKAมีกิจกรรมของ NKA ในตัวอย่างของไส้ต่อมและเนื้อเยื่อเหงือกวัดตาม Else และ al. (1996) ตามที่อธิบายไว้ในตะคริว et al. (2009)สั้น ๆ ตัวอย่างของเนื้อเยื่อต่อมและเหงือกไส้ที่ถ่ายเก็บที่ −80 ° C, homogenisation ฉ่ำชั่งน้ำหนัก และระงับในบัฟเฟอร์(ใน mmol L−1: 250 ซูโครส 5 EDTA อิมิดาโซล 20 และโซเดียม 2.4deoxycholate, pH 7.4) ที่ความเข้มข้น 2.5% w/v และ 5% w/vตามลำดับ Homogenates (50 μL) มี incubated สำหรับห้อง 10 นาทีอุณหภูมิในวิเคราะห์บัฟเฟอร์ (ใน mmol L−1: 80 ตรี (hydroxymethyl)aminomethane HCl, 5 MgCl·6H2O, 120 NaCl, 20 KCl และ 5 NaN3pH 7.5) หรือ ouabain (1 mmol L−1) ไม่ ความแตกต่าง

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

2. วัสดุ andmethods
2.1 การเลี้ยงสัตว์และการปรับตัว
ของเด็กและเยาวชนซี punctatum (3-6months เก่ามวล = 36.37 ± 29.1 กรัม; n =
15) ที่ถูกเก็บรวบรวมจากประชากรพันธุ์เชลยที่ใต้น้ำ
โลก (Mooloolaba, QLD, ออสเตรเลีย) และการขนส่งโดยรถยนต์ไปยังมหาวิทยาลัย
ของ รัฐควีนส์แลนด์บริสเบน ฉลามถูกแบ่งออกทั่วเก้า 40 L
ตู้ (25 ° C, 34 ‰) และได้รับอนุญาตให้ acclimatise เป็นเวลาหนึ่งสัปดาห์ ความเค็ม
ได้รับการตรวจสอบเป็นประจำทุกวันโดยใช้เครื่องวัดแสงแบบพกพา น้ำเค็ม
ที่ถูกสร้างขึ้นโดยใช้น้ำการ Reverse Osmosis และเกลือทะเลเชิงพาณิชย์
(มหาสมุทรธรรมชาติ, Aquasonic) ฉลามได้รับการเลี้ยงดูทุกวันด้วยกุ้งดิบ
และปลา แต่ละฉลามที่ได้รับมอบหมายจากนั้นหนึ่งในสามของการทดลอง
ความเค็ม: hyposaline (25 ‰; n = 5) hypersaline (40 ‰; n = 4)
หรือการควบคุม (34 ‰; n = 6) SW ถังได้รับการปรับเปลี่ยนเพื่อความเค็มเหล่านี้
อย่างช้า ๆ ในช่วง 10 วันที่นอกเหนือจากการ Reverse Osmosis
น้ำ (hyposaline) หรือเกลือพิเศษ (hypersaline) ความเค็มที่เหมาะสม .When
ถูกบรรลุสำหรับการรักษาทุกฉลามได้รับอนุญาตให้ปรับ
ระยะเวลาสอง สัปดาห์ที่ผ่านมา ฉลามถูกอดอาหารเป็นเวลา 72 ชั่วโมงก่อนที่จะ
ได้รับการดมยาสลบในน้ำมันกานพลู (ซิกม่าดิช, ออสเตรเลีย 175 มก. / ลิตร)
. และ pithed แล้ว
2.2 เนื้อเยื่อสุ่มตัวอย่าง
ตัวอย่างเลือดถูกนำมาจากสัตว์แต่ละ euthanized ผ่านหาง
เจาะ hemibranch แรกของเหงือกที่ถูกตัดแล้วและสแน็ป
แช่แข็งในไนโตรเจนเหลวก่อนที่จะถูกเก็บไว้ที่ -80 องศาเซลเซียสจนต้อง
NKA สำหรับการวิเคราะห์กิจกรรม hemibranch สองในแต่ละด้านที่ถูก
ตัดและยังแก้ไขในฟอร์มาลินบัฟเฟอร์ที่เป็นกลาง (NBF) ค้างคืนที่
4 องศาเซลเซียส ตัวอย่างคงที่ถูกวางลงในเอทานอล 70% และเก็บไว้จนกว่าจะถึง
การประมวลผลที่อุณหภูมิ -20 องศาเซลเซียส ต่อมทวารหนักนอกจากนี้ยังจะถูกลบออกจากแต่ละ
ฉลามสแน็ปแช่แข็งและเก็บไว้ที่ -80 องศาเซลเซียส.
2.3 ฮีมาโตและความเข้มข้นของตัวถูกละลายพลาสม่า
ตัวอย่างเลือดหมุนเหวี่ยงได้ทันทีที่ 5,000 กรัมเป็นเวลา 3 นาที
และพลาสม่าจะถูกลบออกและเก็บไว้ที่อุณหภูมิ -20 องศาเซลเซียสก่อนที่จะมีการวิเคราะห์
หลอดเส้นเลือดฝอยเล็ก ๆ ของเลือดทั้งหมดถูกหมุนเหวี่ยงที่ 10,000 กรัม
1 นาทีเพื่อตรวจสอบฮี (HCT) osmolality ของพลาสม่า
ถูกกำหนดในการใช้เพิ่มขึ้นสามเท่า Vapro 5520 ความดันไอ
Osmometer (Wescor โลแกน, ยูทาห์สหรัฐอเมริกา) osmolality ของพิพิธภัณฑ์สัตว์น้ำ
น้ำยังวัด ตัวอย่างพลาสมาถูกปรับลดจาก 55% ใน
น้ำบริสุทธิ์ (ค) และความเข้มข้นของไอออน (Na + และ Cl-
K +) ได้รับการพิจารณาโดยใช้ iStat วิเคราะห์ (Abaxis สหรัฐอเมริกา) และ
EC8 + ตลับ พลาสม่าเข้มข้นของยูเรียถูกกำหนดในเพิ่มขึ้นสามเท่า
โดยใช้ยูเรีย Quantichrom ™ Assay Kit (ชีวภาพ Systems, USA) สั้น ๆ ,
ตัวอย่างพลาสมาถูกเจือจาง 1:60 ในน้ำบริสุทธิ์ (ค) มี
5 ไมโครลิตรแล้วเพิ่มถึง 200 ไมโครลิตรของสารทำงาน ผสมปฏิกิริยานี้
ได้รับอนุญาตในการฟักไข่ที่ roomtemperature เป็นเวลา 30 นาทีและการดูดกลืนแสง
ที่อ่าน 485 นาโนเมตร.
2.4 กิจกรรม NKA
กิจกรรมของ NKA ในตัวอย่างของต่อมทวารหนักและเนื้อเยื่อเหงือกได้รับการ
วัดตาม et al, อื่น ๆ (1996) ตามที่อธิบายไว้ในตะคริว et al, . (2009)
สั้น ๆ ตัวอย่างของต่อมทวารหนักและเนื้อเยื่อเหงือกถูกนำมาจากการจัดเก็บ
ที่ -80 องศาเซลเซียสและชั่งน้ำหนักที่ถูกระงับในบัฟเฟอร์ homogenisation เย็น
(ในมิลลิโมล L-1: 250 ซูโครส 5 EDTA, 20 imidazole 2.4 และโซเดียม
Deoxycholate ค่า pH 7.4) ที่ความเข้มข้น 2.5% w / v และ 5% w / v,
ตามลำดับ homogenates (50 ไมโครลิตร) ถูกบ่มเป็นเวลา 10 นาทีในห้อง
อุณหภูมิในบัฟเฟอร์ทดสอบ (มิลลิโมลใน L-1: 80 Tris (hydroxymethyl)
aminomethane HCl 5 MgCl · 6H2O 120 โซเดียมคลอไรด์ 20 KCl และ 5 NaN3,
ค่า pH 7.5) มีหรือ โดยไม่ต้อง ouabain (1 มิลลิโมล L-1) ความแตกต่างใน

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

2 . วิธีการวัสดุ
2.1 . การเลี้ยงสัตว์ และเยาวชน punctatum acclimation
C ( 3 – 6 เดือนเก่า มวล = 36.37 ±ภาค G ; n =
15 ) ถูกเก็บจากประชากรที่เป็นเชลยพันธุ์โลกใต้น้ำ
( Mooloolaba , QLD , ออสเตรเลีย ) และเดินทางโดยรถยนต์ไปยังมหาวิทยาลัย
ของรัฐควีนส์แลนด์บริสเบน ปลาฉลามแบ่งข้ามเก้า 40 L
นุกูล ( 25 ° C , 34 ‰ ) และอนุญาตให้ acclimatise สำหรับสัปดาห์ ความเค็ม
คือตรวจสอบทุกวันใช้แบบพกพาแสง Refractometer . หลด
ถูกสร้างโดยใช้การ Reverse Osmosis น้ำและพาณิชย์
เกลือทะเล ( ธรรมชาติ , aquasonic มหาสมุทร ) ฉลามกินทุกวันด้วย
กุ้งดิบ และปลา แต่ละของปลาฉลามที่ได้รับมอบหมายแล้วหนึ่งในสามของความเค็มทดลอง
: hyposaline ( 25 ‰ ; n = 5 ) , hypersaline ( 40 ‰
; n = 4 ) หรือควบคุม ( 34 ‰ ; n = 6 ) SW .รถถังถูกปรับความเค็มเหล่านี้
ช้าในช่วง 10 วัน ผ่านการเพิ่มของน้ำการ Reverse Osmosis
( hyposaline ) หรือเกลือเสริม ( hypersaline ) เมื่อระดับความเค็มที่เหมาะสมคือบรรลุทั้งหมด
รักษาฉลามได้รับอนุญาตให้ปรับ
เป็นระยะเวลา 2 สัปดาห์ ฉลามอดอาหารนาน 72 ชั่วโมงก่อน
ถูก anaesthetised ในน้ำมันกานพลู ( ซิกม่า Aldrich ออสเตรเลีย ; 175 mg / L )