2.3. Identification of meat species

2.3. Identification of meat species using multiplex PCR
A consensusmultiplex PCRmethod, whichwas firstly established by Matsunaga et al. (1999), was used to assay pork, beef, chicken and mutton in the food samples with minor modification. A common forward primer SIM1 (50-GACCTCCCAGCTCCATCAAACATCTCATCTTGATGAAA-30) and 4 species-specific reverse primers [mutton primer M1 (50-GCCTATGAATGCTGTGGCTATTGTCGC-30),
chicken primer C1 (50-AAGATACAGATGAAGAAGAATGAGGCG-30),
beef primer B1 (50-CTAGAAAAGTGTAAGACCCGTAATATAAG-30),
pork primer P1 (50-GCTGATAGTAGATTTGTGATGACCGTA-30)
were synthesized, targeting the regions on the mitochondrial cytochrome b genes (Fig. 1). Compared to Matsunaga’s method, we designed a common reverse primer M1 to simultaneously identify goat and
sheep (mutton) due to the almost equivalent prices of these 2 meats. Besides, the horsemeatwas not examined because itwas rare on the market. The multiplex PCR reactions were run on an ABI Veritee 96-
well PCR System (ABI, USA). The experimental parameters optimized by Matsunaga et al. (1999), including the ratio of primers and the PCR conditions,were used in the present assay. Themultiplex PCR
reactionwas run in a 50 mL volume: 25 mL of 2_PCR reaction master mix (Takara, Japan), 1 mL DNA template and the mix of 5 primes containing SIM1, M1, C1, B1 and P1 (1:0.2:3:0.6:0.6) (the ratio 1
means 20pmol primer/50ml PCR solution). The PCR conditionswere as follows: denaturation at 94 _C for 3 min, followed by 35 cycles of 30 s at 94 _C, 30 s at 60 _C, 30 s at 72 _C, and a final polymerization at
72 _C for 7 min. After amplification, 15 mL of the PCR products were electrophoresed on 2% agarose gel with 0.5 mg/ml ethidium bromide.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

2.3 การระบุพันธุ์เนื้อใช้ multiplex PCRConsensusmultiplex PCRmethod, whichwas แรก ก่อตั้งขึ้นโดย Matsunaga et al. (1999), ที่ใช้ assay หมู เนื้อ ไก่ และ mutton ในตัวอย่างอาหารที่มีการแก้ไขเล็กน้อย พื้นไปข้างหน้าทั่วไป SIM1 (50-GACCTCCCAGCTCCATCAAACATCTCATCTTGATGAAA-30) และ 4 species-specific กลับไพรเมอร์ [พื้น mutton M1 (50-GCCTATGAATGCTGTGGCTATTGTCGC-30),ไก่รองพื้น C1 (50-AAGATACAGATGAAGAAGAATGAGGCG-30),เนื้อรองพื้น B1 (50-CTAGAAAAGTGTAAGACCCGTAATATAAG-30), หมูพื้น P1 (50-GCTGATAGTAGATTTGTGATGACCGTA-30) ถูกสังเคราะห์ ภูมิภาคบนยีน mitochondrial cytochrome b (Fig. 1) กำหนดเป้าหมาย เมื่อเทียบกับวิธีการของ Matsunaga เราออกแบบทั่วไปกลับพื้น M1 พร้อมระบุแพะ และแกะ (mutton) เนื่องจากราคาเกือบเท่าของเนื้อสัตว์เหล่านี้ 2 นอกจาก horsemeatwas ไม่ตรวจสอบ เพราะมันหายากในตลาด ปฏิกิริยา PCR multiplex ถูกเรียกใช้ในการลักชัวรี่ Veritee 96-ด้วย PCR ระบบ (ABI สหรัฐอเมริกา) ทดลองการใช้พารามิเตอร์ที่เหมาะโดย Matsunaga et al. (1999), รวมทั้งอัตราส่วนของไพรเมอร์และเงื่อนไข PCR ถูกใช้ในการวิเคราะห์นำเสนอ Themultiplex PCRreactionwas รันในปริมาตร 50 mL: 25 mL 2_PCR ปฏิกิริยาหลักผสม (Takara ญี่ปุ่น), 1 mL ดีเอ็นเอแม่แบบ และผสมผสานของโรงแรมไพรม์ 5 ประกอบด้วย SIM1, M1, C1, B1 และ P1 (1:0.2:3:0.6:0.6) (อัตราส่วน 1หมายความว่า โซลูชัน PCR 50 ml รองพื้น 20pmol) Conditionswere PCR ดัง: denaturation ที่ _C 94 สำหรับ 3 นาที ตาม ด้วยรอบ 35 30 s ที่ 94 _C, 30 s ที่ 60 _C, 30 s ที่ 72 _C, polymerization ขั้นสุดท้ายที่_C 72 ใน 7 นาที หลังจากขยาย 15 mL ผลิตภัณฑ์ PCR ถูก electrophoresed ใน 2% agarose เจกับโบรไมด์ ethidium 0.5 mg/ml

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

2.3 บัตรประจำตัวของสายพันธุ์เนื้อ multiplex PCR โดยใช้
consensusmultiplex PCRmethod, whichwas แรกที่จัดตั้งขึ้นโดย Matsunaga et al, (1999) ถูกใช้ในการ assay เนื้อหมูเนื้อไก่และเนื้อแกะในตัวอย่างอาหารที่มีการปรับเปลี่ยนเล็กน้อย ไพรเมอร์ไปข้างหน้าร่วมกันซิม 1 (50 GACCTCCCAGCTCCATCAAACATCTCATCTTGATGAAA-30) และ 4 สายพันธุ์เฉพาะไพรเมอร์กลับ [ไพรเมอร์เนื้อแกะ M1 (50 GCCTATGAATGCTGTGGCTATTGTCGC-30),
ไพรเมอร์ไก่ C1 (50 AAGATACAGATGAAGAAGAATGAGGCG-30),
ไพรเมอร์เนื้อ B1 (50 CTAGAAAAGTGTAAGACCCGTAATATAAG- 30)
ไพรเมอร์เนื้อหมู P1 (50 GCTGATAGTAGATTTGTGATGACCGTA-30)
ถูกสังเคราะห์เป้าหมายภูมิภาคในยีน cytochrome ขยล (รูปที่ 1). เมื่อเทียบกับวิธีการ Matsunaga ของเราได้รับการออกแบบไพรเมอร์กลับร่วมกันไปพร้อม ๆ กัน M1
ระบุแพะและแกะ(แกะ) เนื่องจากราคาเทียบเท่าเกือบทั้ง 2 เนื้อสัตว์ นอกจากนี้ horsemeatwas ไม่ตรวจสอบเพราะหายาก itwas ในตลาด ปฏิกิริยา PCR multiplex วิ่งบน ABI Veritee 96
ดี PCR ระบบ (ABI สหรัฐอเมริกา) พารามิเตอร์การทดลองเพิ่มประสิทธิภาพโดย Matsunaga et al, (1999) รวมถึงอัตราส่วนของไพรเมอร์และสภาพ PCR ที่ถูกนำมาใช้ในการวิเคราะห์ในปัจจุบัน Themultiplex PCR
reactionwas ทำงานในปริมาณ 50 มล: 25 มิลลิลิตร 2_PCR ปฏิกิริยาผสมต้นแบบ (Takara ญี่ปุ่น) แม่แบบดีเอ็นเอ 1 มิลลิลิตรและผสม 5 ช่วงเวลาที่มีซิม 1, M1, C1, B1 และ P1 (1: 0.2: 3: 0.6: 0.6) (อัตราส่วน 1
หมายถึง 20pmol ไพรเมอร์ / 50ml แก้ปัญหา PCR) PCR conditionswere ดังนี้ denaturation ที่ 94 _C เป็นเวลา 3 นาทีตามด้วย 35 รอบของ 30 วินาทีที่ 94 _C, 30 วินาทีที่ 60 _C, 30 วินาทีที่ 72 _C และพอลิเมอสุดท้าย
72 _C 7 นาที หลังจากที่ขยาย 15 มิลลิลิตรผลิตภัณฑ์ PCR ถูก electrophoresed เมื่อวันที่ 2% agarose เจล 0.5 mg / ml ethidium bromide

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

2.3 การจำแนกชนิดโดยใช้ multiplex PCR
เป็นเนื้อ consensusmultiplex pcrmethod ซึ่งเดิมทีสร้างโดยมัตสึ et al . ( 1999 ) , ใช้ว่า หมู , เนื้อ , ไก่และเนื้อแกะในตัวอย่างอาหารด้วยการปรับเปลี่ยนเล็กน้อยเป็นสีรองพื้น sim1 ไปข้างหน้าร่วมกัน ( 50-gacctcccagctccatcaaacatctcatcttgatgaaa-30 ) และไพรเมอร์รองพื้น 4 เผ่าพันธุ์ - เฉพาะย้อนกลับ [ เนื้อแกะ M1 ( 50-gcctatgaatgctgtggctattgtcgc-30 )
ไก่สี C1 ( 50-aagatacagatgaagaagaatgaggcg-30 )
รองพื้นเนื้อ B1 ( 50-ctagaaaagtgtaagacccgtaatataag-30 )
P1 ไพรเมอร์สังเคราะห์หมู ( 50-gctgatagtagatttgtgatgaccgta-30 )
,การกำหนดเป้าหมายภูมิภาคในไมโตคอนเดรีย - B ยีน ( รูปที่ 1 ) เมื่อเทียบกับวิธีของ มัตสึนากะ เราได้ออกแบบไพรเมอร์พบกลับ M1 พร้อมกันระบุแพะและแกะ
( เนื้อแกะ ) เนื่องจากราคาเกือบเท่ากับทั้ง 2 เนื้อ นอกจากนี้ horsemeatwas ไม่ตรวจสอบ เพราะจากที่หายากในตลาด ปฏิกิริยา PCR PCR ถูกวิ่งบน veritee 96 -
อาบีระบบ PCR ( ABI , USA ) จำนวนพารามิเตอร์ที่เหมาะสม จากมัตสึ et al . ( 1999 ) ได้แก่ อัตราส่วนของไพรเมอร์และสภาวะในการทดสอบ PCR ที่ใช้ปัจจุบัน themultiplex PCR
พบว่าวิ่งใน 50 มิลลิลิตร ปริมาณ 25 ml ของ 2_pcr ปฏิกิริยาหลักผสม ( Takara , ญี่ปุ่น ) 1 ml ดีเอ็นเอแม่แบบและการผสมผสานของจำนวนเฉพาะที่มี sim1 5 , C1 , และ B1 M1 P1 ( 1:0.2:3:0.6:0.6 ) ( อัตราส่วน 1
หมายถึง 20pmol / 50ml รองพื้นโดยโซลูชั่น ) การตรวจสภาวะมีดังนี้ ( ที่ 94 _c นาน 3 นาที แล้วตามด้วย 35 รอบ 30 s ที่ 94 _c 30 เป็น 60 _c 30 s 72 _c และสุดท้ายพอลิเมอไรเซชันที่
72 _c สำหรับ 7 นาที หลังจากขยาย 15 ml ผลิตภัณฑ์ PCR เป็น electrophoresed 2 % เจล 0.5 มก. / มล.
ทิเดียมโบรไมด์ .