2.3. Procedure of double immunofluor

2.3. Procedure of double immunofluorescence

Sections were used for double immunofluorescence to identify the areas that contained both kisspeptin and NKB immunoreactivity. Sections were washed 3 times for 5 min with phosphate buffer saline (PBS), and treated with 1% Triton X-100 in PBS for 15–20 min. Nonspecific antibody binding was reduced by treatment in 10% normal donkey serum (Golden Bridge International, Beijing, China) in PBS for 10–15 min.
Sections were incubated overnight in a mixture of pri- mary antisera: rabbit anti-kisspeptin antibody (ab19028, Abcam) at 1:400 and goat anti-NKB (sc-14109, Santa Cruz)
at a 1:500 dilution at 4 ◦ C. After washing 3 times for 5 min
in PBS, sections were immersed in donkey anti-rabbit IgG- PerCP (Golden Bridge International, Beijing, China) at 1:300 and donkey anti-goat IgG-FITC at 1:200 (Golden Bridge International, Beijing, China) and incubated for 0.5–1 h at room temperature. After rinsing with PBS, sections were mounted onto glass slides with 10% glycerol. In all reac- tions, negative controls were run in parallel by omitting the mixture of primary antisera (substituted by PBS) to demonstrate the absence of specific immunoreactivity.



Tissue sections of hypothalamus in geese were processed in the same conditions as the test slides for positive control.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

2.3. ขั้นตอนของคู่ immunofluorescenceส่วนที่ใช้สำหรับคู่ immunofluorescence เพื่อระบุพื้นที่ที่อยู่ kisspeptin และ NKB immunoreactivity ส่วนที่ล้างครั้งใน 5 นาทีด้วยเกลือฟอสเฟตบัฟเฟอร์ (PBS), และรักษา ด้วย 1% Triton X-100 ใน PBS 15 – 20 นาที Nonspecific แอนติบอดีรวมลดลง โดยการรักษาในลาปกติ 10% ซีรั่ม (โกลเด้นบริดจ์อินเตอร์เนชั่นแนล ปักกิ่ง จีน) ใน PBS 10 – 15 นาทีส่วนได้รับการกกข้ามคืนของแมรี่ pri antisera: กระต่ายป้องกัน kisspeptin แอนติบอดี (ab19028, Abcam) ที่ 1: 400 และแพะป้องกัน-NKB (sc-14109 ซานตาครูซ)ที่เจือจาง 1: 500 ที่โรคปาก 4 เซลเซียส หลังจากล้าง 3 ครั้งสำหรับ 5 นาทีใน PBS ส่วนที่ถูกแช่อยู่ในลาป้องกันกระต่ายหา igg จำเพาะ - PerCP (โกลเด้นบริดจ์อินเตอร์เนชั่นแนล ปักกิ่ง จีน) ที่ 1:300 และลาป้องกันแพะ FITC หา igg จำเพาะที่ 1: 200 (โกลเด้นบริดจ์อินเตอร์เนชั่นแนล ปักกิ่ง จีน) และได้รับการกก 0.5 – 1 h ที่อุณหภูมิห้อง หลังจากล้างด้วย PBS ส่วนติดตั้งลงบนกระจกสไลด์ด้วย 10% กลีเซอรอล ในทั้งหมด reac-ทุกระดับ ควบคุมลบถูกเรียกใช้พร้อมกัน โดยไม่ใส่ส่วนผสมของหลัก antisera (แทน โดย PBS) แสดงให้เห็นถึงการขาดงานของ specific immunoreactivity ส่วนเนื้อเยื่อของ hypothalamus ในห่านถูกประมวลผลในเงื่อนไขเดียวกันเป็นภาพนิ่งทดสอบควบคุมบวก

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

2.3 ขั้นตอนของคู่ FL ภูมิคุ้มกัน uorescence ส่วนถูกนำมาใช้สำหรับภูมิคุ้มกันคู่ FL uorescence เพื่อระบุพื้นที่ที่มีทั้ง kisspeptin และ NKB ภูมิคุ้มกัน ส่วนที่ถูกล้าง 3 ครั้งเป็นเวลา 5 นาทีด้วยฟอสเฟตบัฟเฟอร์น้ำเกลือ (พีบีเอส) และรับการรักษาด้วย 1% Triton X-100 ในพีบีเอสประมาณ 15-20 นาที Nonspeci Fi C แอนติบอดีผูกพันลดลงในการรักษา 10% ลาในเลือดปกติ (Golden Bridge นานาชาติกรุงปักกิ่งประเทศจีน) ในพีบีเอสประมาณ 10-15 นาที. ส่วนถูกบ่มค้างคืนในส่วนผสมของ antisera ขั้นต้น: กระต่ายป้องกัน kisspeptin แอนติบอดี (ab19028 , Abcam) ที่ 1: 400 และแพะป้องกัน NKB (SC-14109, Santa Cruz) ที่ 1: 500 เจือจางที่ 4 ◦ C. หลังจากล้าง 3 ครั้งเป็นเวลา 5 นาทีในพีบีเอสส่วนถูกแช่อยู่ในลาต่อต้านกระต่าย IgG - PerCP (Golden Bridge นานาชาติกรุงปักกิ่งประเทศจีน) 1: 300 และลาต่อต้านแพะ IgG-FITC ที่ 1: 200 (Golden Bridge นานาชาติกรุงปักกิ่งประเทศจีน) และบ่มเป็นเวลา 0.5-1 ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้อง หลังจากล้างด้วยพีบีเอสส่วนที่ถูกติดตั้งลงบนกระจกสไลด์ 10% กลีเซอรอล ใน tions reac- ทั้งหมดควบคุมเชิงลบทำงานแบบขนานโดยเลี่ยงส่วนผสมของ antisera หลัก (แทนพีบีเอส) เพื่อแสดงให้เห็นถึงตัวตนของ speci Fi C ภูมิคุ้มกันได้. ส่วนเนื้อเยื่อของมลรัฐในห่านที่ถูกประมวลผลในสภาพเช่นเดียวกับภาพนิ่งสำหรับการทดสอบในเชิงบวก ควบคุม.

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

2.3 มมูโนfl uorescence ขั้นตอนของคู่ส่วนที่ใช้เป็นคู่มมูโนfl uorescence เพื่อระบุพื้นที่ที่มีทั้ง kisspeptin NKB และการ . บางส่วนถูกล้าง 3 ครั้งเป็นเวลา 5 นาทีด้วยฟอสเฟตบัฟเฟอร์น้ำเกลือ ( PBS ) และรักษาด้วย 1% Triton X-100 ใน PBS 15 – 20 นาทีจึงผูก nonspeci ซีแอนติบอดีลดลง 10% เซรั่มรักษาปกติลา ( สะพานโกลเด้นอินเตอร์เนชั่นแนล , ปักกิ่ง , จีน ) ใน PBS 10 – 15 นาทีส่วนที่ถูกบ่มค้างคืนในส่วนผสมของ PRI - แมรี่ แอนติ : กระต่ายแอนติบอดีต่อต้าน kisspeptin ( ab19028 ABCAM , ) ที่ 1 : 400 และแพะ anti NKB ( sc-14109 Santa Cruz )ที่ 1 : 500 ( ที่ 4 ◦ C หลังจากล้าง 3 ครั้ง เป็นเวลา 5 นาทีใน PBS , ส่วนถูกแช่อยู่ในลาแอนตี้กระต่าย IgG - percp ( สะพานโกลเด้นอินเตอร์เนชั่นแนล ปักกิ่ง ประเทศจีน ) และ IgG anti 1:300 ลาแพะ fitc ที่ 1:200 ( สะพานโกลเด้นอินเตอร์เนชั่นแนล ปักกิ่ง ประเทศจีน ) และบ่ม 0.5 – 1 ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้อง หลังจากล้างด้วย pbs , ส่วนติดบนกระจกสไลด์ 10% กลีเซอรอล . ทั้งหมดให้การ - ยินดีด้วย การควบคุมเป็นลบวิ่งขนาน โดยใส่ส่วนผสมของแอนติหลัก ( ใช้ PBS ) เพื่อแสดงให้เห็นถึงการขาดการถ่ายทอดวัค .เนื้อเยื่อส่วนในของ hypothalamus ห่านถูกประมวลผลในเงื่อนไขเดียวกันเป็นแบบสไลด์เพื่อการควบคุมที่ดี