Traditional PCR amplificationPCR re

Traditional PCR amplification
PCR reactions were performed in 10 μL volumes using the FastStart High Fidelity Reaction Kit (Roche) with the addition of 0.5 μM of each PCR primer. Resolight Dye (Roche) was added to measure DNA amplification in real-time using a LightCycler 480 instrument (Roche). The 16 S V3–V5 regions were amplified by PCR using modified 357F and 926R primers to allow for a two-step amplification strategy, using the following cycling conditions: initial denaturation at 95 °C for 2 minutes followed by 35 cycles of PCR, with cycling conditions of 30 seconds at 95 °C, 30 seconds at 55 °C, and 60 seconds at 72 °C. After PCR amplification, the amplicons were purified from unincorporated dNTPs, primers, primer dimers and salts using magnetic AMPure XP beads (Agencourt). The purified 16 S amplicons were re-amplified to incorporate 454 sequencing-specific nucleotides and specimen-specific MIDs. All PCR reactions were performed in 10 μL reaction volumes using the FastStart High Fidelity Reaction Kit with the addition of 0.5 μM of each PCR primer and the Resolight Dye. The PCR reactions were performed on a LightCycler 480 instrument, but under modified conditions: initial denaturation at 95 °C for 2 minutes followed by 35 cycles of PCR, with cycling conditions of 30 seconds at 95 °C, 30 seconds at 50 °C, and 60 seconds at 72 °C. During the first 10 cycles of PCR, the annealing temperature was increased by 0.5 °C per cycle to an annealing temperature of 55 °C. Bar-coded amplicons were mixed in equimolar concentrations and the complete pool was purified by gel extraction using the QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen), followed by a second purification with magnetic AMPure XP beads.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

ขยาย PCR ดั้งเดิมปฏิกิริยา PCR ได้ดำเนินการในไดรฟ์ μL 10 ใช้ชุดปฏิกิริยาความชัดสูง FastStart (Roche) 0.5 μM พื้น PCR แต่ละแห่ง Resolight ย้อม (Roche) มีเพิ่มขยายดีเอ็นเอในเวลาจริงโดยใช้เครื่องมือ LightCycler 480 (Roche) วัด ภาค S V3 – V5 16 ถูกขยาย โดย PCR ที่ใช้ไพรเมอร์ 357F และ 926R สำหรับสองขั้นตอนขยายกลยุทธ์ ใช้ต่อไปนี้ให้ปรับเปลี่ยนเงื่อนไขการขี่จักรยาน: denaturation เริ่มต้นที่ 95 องศาเซลเซียส 2 นาทีตาม ด้วยรอบ 35 ของ PCR มีเงื่อนไขขี่จักรยาน 30 วินาทีที่ 95 ° C, 30 วินาทีที่ 55 ° C และ 60 วินาทีที่ 72 องศาเซลเซียส หลังจากขยาย PCR, amplicons มีบริสุทธิ์จาก unincorporated dNTPs ไพรเมอร์ รองพื้น dimers และเกลือที่ใช้แม่เหล็ก AMPure XP ประคำ (Agencourt) 16 บริสุทธิ์ S amplicons มีเอาต์ใหม่จะรวมเฉพาะลำดับนิวคลีโอไทด์และสิ่งส่งตรวจเฉพาะ MIDs 454 ปฏิกิริยา PCR ทั้งหมดถูกทำในวอลุ่มปฏิกิริยา μL 10 ใช้ชุดปฏิกิริยาความชัดสูง FastStart แห่ง μM 0.5 ของแต่ละพื้น PCR และย้อม Resolight ปฏิกิริยา PCR ถูกดำเนินการบนเครื่องมือ LightCycler 480 แต่ภายใต้เงื่อนไขการปรับเปลี่ยน: denaturation เริ่มต้นที่ 95 องศาเซลเซียส 2 นาทีตาม ด้วยรอบของ PCR มีเงื่อนไขขี่จักรยาน 30 วินาทีที่ 95 ° C, 30 วินาทีที่ 50 ° C, 35 และ 60 วินาทีที่ 72 องศาเซลเซียส ในรอบแรก 10 ของ PCR อุณหภูมิหลอมถูกเพิ่มขึ้น 0.5 ° C ต่อวงจรอุณหภูมิการหลอมของ 55 องศาเซลเซียส Amplicons ที่มีบาร์โค้ดถูกนำมาผสมในความเข้มข้น equimolar และสระว่ายน้ำสมบูรณ์ที่บริสุทธิ์ โดยเจลสกัดโดยใช้การ QIAquick เจแยกชุด (Qiagen), ตาม ด้วยฟอกสองกับลูกปัด AMPure XP แม่เหล็ก

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

ขยาย PCR
แบบดั้งเดิมปฏิกิริยาPCR ได้ดำเนินการใน 10 ไมโครลิตรปริมาณการใช้ความจงรักภักดีสูง FastStart ปฏิกิริยา Kit (Roche) ด้วยนอกเหนือจาก 0.5 ไมครอนไพรเมอร์ของแต่ละวิธี PCR Resolight ย้อม (Roche) ถูกบันทึกอยู่ในวัดดีเอ็นเอในเวลาจริงโดยใช้เครื่องมือ LightCycler 480 (Roche) 16 S ภูมิภาค V3-V5 ถูกขยายโดยวิธี PCR โดยใช้การปรับเปลี่ยน 357F และ 926R ไพรเมอร์เพื่อให้กลยุทธ์การขยายสองขั้นตอนโดยใช้เงื่อนไขการขี่จักรยานต่อไปนี้: denaturation เริ่มต้นที่ 95 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 2 นาทีตามด้วย 35 รอบของ PCR ด้วย การขี่จักรยานเงื่อนไขของ 30 วินาทีที่ 95 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 30 วินาทีที่ 55 องศาเซลเซียสและ 60 วินาทีที่ 72 ° C หลังจากที่ขยาย PCR, amplicons ถูกบริสุทธิ์จาก dNTPs หน่วยงานไพรเมอร์, dimers ไพรเมอร์และเกลือโดยใช้ลูกปัดแม่เหล็ก AMPure XP (Agencourt) บริสุทธิ์ 16 S amplicons เป็นอีกครั้งที่การขยายเพื่อรวม 454 นิวคลีโอลำดับที่เฉพาะเจาะจงและตัวอย่างเฉพาะ MIDs ทุกปฏิกิริยา PCR ได้ดำเนินการใน 10 ไมโครลิตรปริมาณการเกิดปฏิกิริยาโดยใช้ความจงรักภักดีสูง FastStart ปฏิกิริยา Kit ด้วยนอกเหนือจาก 0.5 ไมครอนของแต่ละไพรเมอร์ PCR และ Resolight ย้อม ปฏิกิริยา PCR ได้ดำเนินการในตราสาร 480 LightCycler แต่ภายใต้เงื่อนไขที่การแก้ไข: denaturation เริ่มต้นที่ 95 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 2 นาทีตามด้วย 35 รอบของ PCR กับเงื่อนไขการขี่จักรยานของ 30 วินาทีที่ 95 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 30 วินาทีที่ 50 องศาเซลเซียส และ 60 วินาทีที่ 72 ° C ในช่วงแรก 10 รอบของ PCR อุณหภูมิการหลอมที่เพิ่มขึ้น 0.5 องศาเซลเซียสต่อวงจรกับอุณหภูมิการอบ 55 องศาเซลเซียส amplicons บาร์โค้ดถูกผสมในระดับความเข้มข้น equimolar และสระว่ายน้ำที่สมบูรณ์บริสุทธิ์โดยการสกัดโดยใช้เจลเจลสกัด QIAquick Kit (Qiagen) ตามด้วยการทำให้บริสุทธิ์ที่สองด้วยลูกปัดแม่เหล็ก AMPure XP

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

แบบ PCR (
) ปฏิกิริยา ( 10  μ L ปริมาณการใช้ faststart ความจงรักภักดีสูงปฏิกิริยา Kit ( โรช ) ด้วยการเพิ่ม 0.5  μ M ของแต่ละวิธี PCR ไพรเมอร์ resolight ย้อม ( โรช ) คือเพิ่มมาตรการขยาย DNA ในเวลาจริงโดยใช้เครื่องมือ lightcycler 480 ( โรช )16   S V3 และ V5 ภูมิภาคถูกขยายโดยวิธี PCR โดยใช้ primers และแก้ไข 357f 926r เพื่อให้กลยุทธ์การสื่อสารแบบสองขั้นตอนโดยใช้เงื่อนไขตามจักรยาน : เริ่มต้นที่ 95 (  ° C 2  นาทีตามด้วย 35 รอบของ PCR กับจักรยานเงื่อนไขของ 30 วินาที  95  ° C 30  วินาที 55  ° C , และ 60 วินาที  72  ° C ( หลัง ) ,การ amplicons มีความบริสุทธิ์จากหน่วยงาน dntps ไพรเมอร์ , รองพื้น , สายและเกลือใช้แม่เหล็กเขตอำเภอเมือง XP ลูกปัด ( agencourt ) และ 16   S amplicons เป็นกำลังขยายเพื่อรวมเบสและเสียงกลางที่เฉพาะเจาะจงเฉพาะเจาะจง 454 ชิ้นงานของ ปฏิกิริยา PCR มีการปฏิบัติใน 10  μ L ปฏิกิริยาปริมาณการใช้ faststart ความจงรักภักดีสูงของชุดด้วยนอกจาก 05  μ M ของแต่ละวิธี PCR ไพรเมอร์และ resolight ย้อม การตรวจปฏิกิริยาที่แสดงใน lightcycler 480 เครื่อง แต่ภายใต้เงื่อนไขที่แก้ไข : เริ่มต้นที่ 95 (  ° C เป็นเวลา 2 นาที ตามด้วย  35 รอบของ PCR กับจักรยานเงื่อนไขของ 30 วินาที  95  ° C วินาที 30   50  ° C , และ 60 วินาที  72  ° C ในช่วง 10 รอบแรกของ PCR ,เผาที่อุณหภูมิเพิ่มขึ้น 0.5  ° C ต่อวงจรที่อุณหภูมิการอบอ่อนของ amplicons รหัส 55  °ซี. บาร์ผสมๆความเข้มข้นและสระว่ายน้ำที่สมบูรณ์บริสุทธิ์ โดยการสกัดด้วย qiaquick เจลเจลสกัดชุด ( เพิ่ม ) ตามด้วยฟอกที่สองกับแม่เหล็กเขตอำเภอเมือง XP ลูกปัด