In vitro cytokine analysis. The mur

In vitro cytokine analysis. The murine macrophage-like cell line RAW264.7
was cultured as monolayers in RPMI 1640 medium (Invitrogen) supplemented
with 10% (vol/vol) fetal bovine serum, 50 g of penicillin ml1, and 50 g of
streptomycin ml1 (complete medium) in an atmosphere with 90% humidity
containing 5% CO2 at 37°C. Two days before use, the cells were detached by
gentle scraping and seeded into six-well disposable plates in the same medium.
Two-day-old macrophages were cultured with probiotics at a ratio of 10 spores
per macrophage in complete medium. At different times, the culture medium
was removed, the macrophages were washed and lysed in situ and were homogenized
by passing the cell extract five times through a 20-gauge needle, and the
total RNAs were extracted and purified with a Qiagen RNeasy mini kit used as
described by the manufacturer.
In vivo cytokine analysis. Specific-pathogen-free female BALB/c mice that
were 8 weeks old were inoculated with 1010 spores. A naı¨ve, nonimmunized
group of mice was also included. Spleens, livers, MLN, and submandibular
glands (SMG) were removed from sacrificed mice at different times and frozen
immediately at 80°C until they were needed. To extract total RNAs, organs and
tissues were thawed, disrupted by pressing them between two glass slides, lysed
in RLT buffer (Qiagen) containing 1% -mercaptoethanol, and homogenized by
passing them twice through a QIAshredder column (Qiagen). Total RNAs were
extracted from the lysates and purified with a Qiagen RNeasy mini kit used as
described by the manufacturer.
RT-PCR for cytokine detection. Total RNAs were quantified with a
GeneQuant spectrophotometer (Amersham Biosciences). RT-PCR was carried
out by using 1 g of total RNA per reaction mixture as described by the
manufacturer (Amersham Biosciences Ready-To-Go RT-PCR beads). Primers
specific for -actin and various cytokines have been described elsewhere (32).
The reaction conditions were as follows: first-strand cDNA synthesis at 42°C for
15 min, reverse transcriptase inactivation at 95°C for 5 min, and PCR at 95°C for
30 s, 55°C for 30 s, and 72°C for 1 min. RT-PCR products were electrophoresed
on a 2% agarose gel and subjected to UV visualization and densitometric analysis
with a Bio-Rad Gel Doc system.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

การวิเคราะห์อย่างไร cytokine ใน รายการเซลล์ macrophage เช่น murine RAW264.7มีอ่างเป็น monolayers ใน RPMI 1640 (Invitrogen) เสริมกับ 10% (vol/vol) เซรั่มวัวครรภ์ 50 g ของยาเพนนิซิลลิน ml 1, 50 g ของml streptomycin 1 (สมบูรณ์ปานกลาง) ในบรรยากาศมีความชื้น 90%ประกอบด้วย 5% CO2 ที่ 37 องศาเซลเซียส สองวันก่อนที่จะใช้ เซลล์ถูกแยกออกโดยอ่อนโยน scraping และ seeded เป็นผ้าอ้อมดีหกแผ่นในสื่อเดียวกันบังเอิญอายุ 2 วันมีอ่าง ด้วย probiotics ที่อัตราส่วนของเพาะเฟิร์น 10ต่อ macrophage ในสมบูรณ์ เวลาแตกต่างกัน สื่อวัฒนธรรมถูกเอาออก บังเอิญถูกล้างใน situ lysed และถูก homogenized เป็นกลุ่มโดยผ่านเซลล์สารสกัดจากห้าครั้งเข็มมาตรวัด 20 และรวม RNAs สกัด และบริสุทธิ์ ด้วยชุดมินิ Qiagen RNeasy ใช้เป็นอธิบาย โดยผู้ผลิตการวิเคราะห์อย่างไร cytokine ในสัตว์ทดลอง หนู BALB/c เฉพาะการศึกษาฟรีหญิงที่มีอายุ 8 สัปดาห์มี inoculated กับเพาะเฟิร์น 1010 Naı¨ve, nonimmunizedนอกจากนี้ยังรวมกลุ่มของหนูได้ Spleens, livers, MLN และ submandibularต่อม (SMG) ถูกเอาออกจากหนูที่เสียสละเวลาที่แตกต่างกัน และแช่แข็งทันทีที่ 80° C จนกว่าจะถูกต้อง แยกรวม RNAs อวัยวะ และเนื้อเยื่อถูก thawed ระหว่างสองวัน โดยกดให้นิ่งแก้ว 2, lysedใน RLT บัฟเฟอร์ (Qiagen) ประกอบด้วย 1% - mercaptoethanol และ homogenized เป็นกลุ่มโดยผ่านไปสองคอลัมน์ QIAshredder (Qiagen) RNAs รวมได้สกัดจาก lysates และบริสุทธิ์ ด้วยชุดมินิ Qiagen RNeasy ใช้เป็นอธิบาย โดยผู้ผลิตRT-PCR ตรวจอย่างไร cytokine รวม RNAs ถูก quantified ด้วยการGeneQuant เครื่องทดสอบกรดด่าง (เวลาออก Amersham) ทำ RT-PCRออกโดย 1 กรัมของอาร์เอ็นเอรวมต่อปฏิกิริยาผสมตามที่อธิบายไว้โดยผู้ผลิต (ลูกปัด Amersham เวลาออกพร้อมไป RT-PCR) ไพรเมอร์เฉพาะสำหรับ - แอกตินและ cytokines ต่าง ๆ ได้รับการอธิบายอื่น ๆ (32)เงื่อนไขของปฏิกิริยาได้ดังนี้: การสังเคราะห์ cDNA สแตรนด์แรกที่ 42° C สำหรับ15 นาที ยกเลิกการเรียกกลับ transcriptase ที่ 95° C สำหรับ 5 นาที และ PCR ที่ 95° C สำหรับ30 s, 55° C ถูก electrophoresed ผลิตภัณฑ์สำหรับ 30 s, 72° C สำหรับ 1 นาที RT-PCR2% agarose เจ และการแสดงภาพประกอบเพลง UV และการวิเคราะห์ densitometricด้วยระบบชีวภาพ Rad เจอก

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

ในการวิเคราะห์ไซโตไคน์หลอดทดลอง เซลล์ macrophage เหมือนหมาสาย RAW264.7
เป็นที่เพาะเลี้ยงเป็น monolayers ใน RPMI 1640 กลาง (Invitrogen)
เสริมด้วย10% (ปริมาตร / ปริมาตร) ซีรั่มวัวของทารกในครรภ์ 50 กรัมยาปฏิชีวนะมล. 1 และ 50 กรัมของ
streptomycin มล. 1 (กลางสมบูรณ์) ในชั้นบรรยากาศที่มีความชื้น 90%
จากที่มีCO2 5% ที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส สองวันก่อนการใช้งานเซลล์ที่ถูกถอดออกจากการขูดอ่อนโยนและเมล็ดออกเป็นหกดีแผ่นทิ้งในสื่อเดียวกัน. ขนาดใหญ่สองวันเก่าเพาะเลี้ยงที่มีโปรไบโอติกในอัตราส่วน 10 สปอร์ต่อmacrophage ในสื่อที่สมบูรณ์แบบ ในช่วงเวลาที่แตกต่างกันกลางวัฒนธรรมถูกลบออกขนาดใหญ่ที่ถูกล้างและ lysed ในแหล่งกำเนิดและได้รับการปั่นโดยการส่งผ่านสารสกัดจากเซลล์ห้าครั้งผ่านเข็ม20 วัดและRNAs รวมสกัดและทำให้บริสุทธิ์ด้วย Qiagen RNeasy ชุดมินิที่ใช้ เป็นที่อธิบายไว้โดยผู้ผลิต. ในร่างกายการวิเคราะห์ไซโตไคน์ เฉพาะเชื้อโรคฟรีหญิงหนู Balb / c ที่8 สัปดาห์ได้รับเชื้อด้วย 1010 สปอร์ ไร้เดียงสา, nonimmunized กลุ่มของหนูก็รวม ม้าม, ตับ, MLN และ submandibular ม (SMG) ที่ถูกถอดออกจากหนูเสียสละในช่วงเวลาที่แตกต่างกันและแช่แข็งทันทีที่? 80 องศาเซลเซียสจนกว่าพวกเขาจะเป็นสิ่งที่จำเป็น เพื่อดึง RNAs รวมอวัยวะและเนื้อเยื่อที่ถูกละลายหยุดชะงักโดยกดพวกเขาระหว่างสองสไลด์แก้วlysed ในบัฟเฟอร์ RLT (Qiagen) ที่มี 1%? -mercaptoethanol และหดหายโดยผ่านพวกเขาสองครั้งผ่านคอลัมน์QIAshredder (Qiagen) RNAs ทั้งหมดถูกสกัดจากlysates และบริสุทธิ์กับชุด Qiagen RNeasy ขนาดเล็กใช้เป็นที่อธิบายไว้โดยผู้ผลิต. RT-PCR ในการตรวจหาไซโตไคน์ RNAs ทั้งหมดถูกวัดด้วยspectrophotometer GeneQuant (Amersham ชีววิทยาศาสตร์) RT-PCR ได้ดำเนินการโดยใช้1 กรัมของอาร์เอ็นเอรวมต่อผสมปฏิกิริยาตามที่อธิบายไว้โดยผู้ผลิต(Amersham ชีววิทยาศาสตร์พร้อม-To-Go ลูกปัด RT-PCR) ไพรเมอร์?. ที่เฉพาะเจาะจงสำหรับ -actin และ cytokines ต่างๆได้รับการอธิบายที่อื่น ๆ (32) เงื่อนไขการเกิดปฏิกิริยามีดังนี้การสังเคราะห์ยีนแรกสาระที่ 42 องศาเซลเซียสเป็นเวลา15 นาทีใช้งาน transcriptase ย้อนกลับที่ 95 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 5 นาทีและ PCR ที่ 95 ° C เป็นเวลา30 วินาที, 55 ° C เป็นเวลา 30 วินาทีและ 72 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 1 นาที ผลิตภัณฑ์ RT-PCR ถูก electrophoresed บน agarose เจล 2% และอยู่ภายใต้การสร้างภาพรังสียูวีและการวิเคราะห์ densitometric กับเจล Bio-Rad ระบบหมอ

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

การวิเคราะห์ไซโตไคน์ในหลอดแก้ว ที่เหมือนเซลล์แมคโครฟาจ ~
raw264.7 สายเลี้ยง RPMI 1640 ที่ monolayers ในกลาง ( Invitrogen ) เสริม
10 % ( ปริมาตร / ปริมาตร ) ของวัว ซีรั่ม 50 ml  เพนนิซิลิน  กรัมและ 50 กรัม 1 
streptomycin ml  1 ( complete medium ) ในบรรยากาศที่มีความชื้น
90% ที่ประกอบด้วยคาร์บอนไดออกไซด์ 5% ที่ 37 องศา สองวัน ก่อนใช้ เซลล์ถูกแยกออกโดย
อ่อนโยนขูดและเมล็ดเป็นหกก็ทิ้งแผ่นในตัวกลางเดียวกัน .
macrophages เก่าสองวันถูกเลี้ยงด้วยโปรไบโอติกในอัตราส่วน 10 สปอร์
ต่อแมคโครฟาจในสื่อสมบูรณ์ ในช่วงเวลาที่แตกต่างกัน วัฒนธรรมสื่อ
ถูกลบออก , macrophages ถูกล้างและ lysed ในแหล่งกำเนิดและถูกบด
โดยผ่านเซลล์แยกห้าครั้งผ่านเข็ม 20 วัดและ
RNAs ทั้งหมดสกัดบริสุทธิ์ด้วยการเพิ่มชุด rneasy ขนาดเล็กใช้เป็น
บรรยายโดยผู้ผลิต .
ในการวิเคราะห์ไคสิ่งมีชีวิต เฉพาะเชื้อโรคฟรีหญิงหนูสายพันธุ์ Balb / C ที่
มีอายุ 8 สัปดาห์ถูก inoculated กับ 1010 สปอร์ นะı¨ VE nonimmunized
กลุ่มของหนูไว้ด้วย ม้าม , ตับและมิน submandibular
, ,ต่อม ( SMG ) ถูกถอดออกจากเสียสละหนูในเวลาที่แตกต่างกันและแช่แข็ง
ทันทีที่  80 °องศาเซลเซียสจนกว่าพวกเขาต้องการ เพื่อสกัด RNAs รวมอวัยวะและเนื้อเยื่อถูกทำลาย โดยละลาย
, กดพวกเขาระหว่างกระจกสองแผ่น lysed
ใน RLT บัฟเฟอร์ ( เพิ่ม ) ที่ประกอบด้วย 1%  - mercaptoethanol และบดโดย
ผ่านพวกเขาสองครั้งผ่าน qiashredder คอลัมน์ ( เพิ่ม ) RNAs ทั้งสิ้น
สกัดจาก lysates บริสุทธิ์กับเพิ่ม rneasy มินิชุดใช้เป็น
บรรยายโดยผู้ผลิต .
RT-PCR เพื่อการตรวจหาไซโตไคน์ . ทั้งหมดถูก quantified กับ RNAs
genequant Spectrophotometer ( ชาม Biosciences ) นี้ถูกนำออกโดยการใช้ 
1 G ของ RNA ทั้งหมดต่อปฏิกิริยาผสมตามที่อธิบายไว้โดย
ผู้ผลิต ( ชีววิทยาศาสตร์ที่พร้อมที่จะไป 4 เม็ด ) ไพรเมอร์
เฉพาะ  - actin และ cytokines ต่างๆได้ถูกอธิบายไว้ในที่อื่น ( 32 ) .
เงื่อนไขปฏิกิริยาดังนี้ เฟิร์ส สแตนด์ ในการสังเคราะห์ cDNA 42 ° C
15 นาที , reverse transcriptase ทำให้ที่ 95 องศา C เป็นเวลา 5 นาทีและ PCR ที่ 95 องศา C
30 55 ° C เป็นเวลา 30 วินาที s , และ 72 ° C เป็นเวลา 1 นาที ต่อผลิตภัณฑ์ electrophoresed
ในเจล ( 2 ) ภายใต้ยูวีการแสดงและการวิเคราะห์ด้วยไบโอ densitometric
ราดเจลหมอระบบ