Isolation and selection of thermoto

Isolation and selection of thermotolerant yeast strains
Yeasts were isolated from soil and water samples from
sugar cane plantations and sugar factories in four provinces,
namely Phra Nakhon Si Ayutthaya, Ratchaburi,
Suphanburi and Uthaithani, Thailand. Isolation was carried
out at 35 C by an enrichment technique using sugar
juice media containing sugar cane juice (5% or 8% total
sugars), 0.05% (NH4)2SO4 and 4% (v/v) ethanol and with
(pH 4.5) and without pH adjustment (pH 3.8). After inoculation,
cultures were incubated for 3 days in a rotary shaker
(Gallenkamp Orbital Incubator, Leicester, UK) at a
predetermined temperature with shaking speed of
170 rpm. Enriched cultures were then streaked on agar
plates containing the same medium and inoculated at
35 C. Purified yeast cultures were kept on YPD agar slants
(1% yeast extract, 2% peptone, 2% glucose and 2% agar)
and stored at 8 C.
Thermotolerant yeast strains were selected based on
their growth performances at 40 and 45 C in sugar cane
juice broth containing 8% total sugars and 0.05%
(NH4)2SO4 and supplemented with 4% (v/v) ethanol. Successful
cultures were collected and screened further for
their ethanol production efficiency at elevated temperature.

2.2. Screening of thermotolerant yeasts for ethanol
production at high temperature
Screening for high ethanol production was conducted at
40 and 45 C in 250 ml Erlenmeyer flasks containing 100 ml
of a basal sugar cane juice medium composed of sugar cane
juice supplemented with sucrose to 18% total sugars and
0.05% (NH4)2SO4 and with pH adjustment to 4.5 with
1 N HCl. Inocula were prepared by transferring one loop
full of 24 h culture grown on a slant of YPD agar to an
Erlenmeyer flask containing 50 ml of a sugar cane juice
medium as above but with only 2% total sugars. After incubation
on a rotary shaker at 25–28 C for 24 h, the inocula
were transferred at the rate of 5% to the screening medium,
followed by incubation on a rotary shaker at 40 and 45 C.

2.3. Identification of the selected thermotolerant yeast strain
The selected yeast strain was morphologically, physiologically
and biochemically characterized by standard
methods described by Yarrow (1998). Assimilation of
nitrogen compounds was examined on solid media with
starved inocula following the method of Nakase and
Suzuki (1986). Growth at various temperatures was determined
by cultivation on YM agar and in YM broth using
an incubator and a water bath, respectively.
Identification and phylogenetic analysis of the yeast
strain based on comparative analysis of the sequence of
the D1/D2 domain of the large-subunit (LSU) rDNA
was carried out. The sequencing of the D1/D2 domain of
the LSU rDNA was carried out from PCR products of
genomic DNA fragments that were extracted from yeast
cells by the method of Lachance et al. (1999) with slight
modifications. The D1/D2 domain of the LSU rDNA
was amplified by PCR with forward primer NL-1 and
reverse primer NL-4 (O’Donnell, 1993). The PCR product
was checked by agarose gel electrophoresis, purified using
QIA Quick Purification Kit (Qiagen, Ontario, USA) and
cycle-sequenced using the ABI BigDye Terminator Cycle
Sequencing Kit Version. 3.1 (Applied Biosystems, California,
USA) with the external primers NL-1 and NL-4
(Kurtzman and Robnett, 1998). The sequences were determined
with an ABI PRISM 3100 automated DNA sequencer
(Applied Biosystems, California, USA) according to the
instructions of the manufacturer. The sequences were compared
pairwise using the BLAST homology search (

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

แยกและตัวเลือก thermotolerant ยีสต์
Yeasts ได้แยกต่างหากจากตัวอย่างดินและน้ำจาก
ไร่อ้อยและโรงงานน้ำตาลใน 4 จังหวัด,
ได้แก่พระนครศรีอยุธยา ราชบุรี,
สุพรรณบุรีและอุทัยธานี ประเทศไทย ทำแยก
ออกที่ 35 C โดยมีเทคนิคโดดเด่นใช้น้ำตาล
น้ำสื่อประกอบด้วยน้ำอ้อย (5% หรือ 8% รวม
น้ำตาล), 005% (NH4) 2SO4 และเอทานอล 4% (v/v) และ มี
(pH 4.5) และไม่ มีการปรับปรุงค่า pH (pH 3.8) หลังจาก inoculation,
วัฒนธรรมถูก incubated สำหรับ 3 วันในเชคเกอร์โรตารี่
(Gallenkamp โคจร Incubator เลสเตอร์ สหราชอาณาจักร) ที่เป็น
กำหนดการอุณหภูมิกับความเร็วของการสั่น
170 รอบต่อนาที วัฒนธรรมอุดมแล้วมีลายอยู่ agar
ประกอบด้วยตรงกลาง และ inoculated ที่แผ่น
35 เซลเซียส วัฒนธรรมยีสต์บริสุทธิ์ที่ถูกเก็บไว้ใน YPD agar slants
(1% ยีสต์สกัด peptone 2% น้ำตาลกลูโคส 2% และ 2% agar)
และเก็บที่ 8 C.
Thermotolerant ยีสต์ได้เลือกตาม
โภชน์เจริญเติบโตที่ 40 และ 45 C ในอ้อย
น้ำซุปน้ำตาลรวม 8% และ 0.05%
(NH4) 2SO4 และเสริม ด้วยเอทานอล 4% (v/v) ประสบความสำเร็จ
วัฒนธรรมรวบรวม และฉายต่อไปสำหรับ
ประสิทธิภาพการผลิตเอทานอลที่อุณหภูมิสูง

2.2 Yeasts คัดกรอง thermotolerant สำหรับเอทานอล
ผลิตที่อุณหภูมิสูง
คัดกรองสำหรับผลิตเอทานอลสูงได้ดำเนินการที่
40 และ 45 C ในน้ำ Erlenmeyer 250 ml ประกอบด้วย 100 มล
ของสื่อน้ำอ้อยโรคประกอบด้วยน้ำตาล
น้ำเสริม ด้วยซูโครสกับน้ำตาลรวม 18% และ
005% (NH4) 2SO4 และ มีการปรับปรุงค่า pH 4.5 ด้วย
Inocula 1 N HCl ถูกเตรียมไว้ โดยโอนวนหนึ่ง
เต็ม 24 ชมวัฒนธรรมปลูกบนเอียงของ agar YPD เพื่อการ
Erlenmeyer หนาวประกอบด้วย 50 ml ของน้ำอ้อย
กลาง กับข้างบน แต่ มีเพียง 2% รวมน้ำตาล หลังจากบ่ม
ในเชคเกอร์โรตารี่ที่ 25-28 C ใน 24 h, inocula
ถูกโอนย้ายในอัตรา 5% ปานกลางคัดกรอง,
ตาม ด้วยฟักตัวในเชคเกอร์โรตารี่ที่ 40 และ 45 C.

2.3 รหัสของสายพันธุ์ยีสต์ thermotolerant เลือก
สายพันธุ์ยีสต์ที่เลือกถูก morphologically, physiologically
และลักษณะตามมาตรฐาน biochemically
วิธีอธิบาย โดย Yarrow (1998) ผสมกลมกลืนของ
สารประกอบไนโตรเจนถูกตรวจสอบบนสื่อแข็ง
starved inocula ตามวิธีของ Nakase และ
ซูซูกิ (1986) เจริญเติบโตที่อุณหภูมิต่าง ๆ ได้กำหนด
โดยปลูก บน YM agar และ YM ซุป
การบ่มเพาะวิสาหกิจและน้ำอ่างอาบน้ำ ตามลำดับ.
รหัสและวิเคราะห์ phylogenetic ของยีสต์
ต้องใช้ตามลำดับของการวิเคราะห์เปรียบเทียบ
โดง 1/D2 ของ rDNA ขนาดใหญ่งานย่อย (ชุดปั๊มหมึก)
ถูกดำเนินการ ลำดับของโดง 1/D2 ของ
rDNA ชุดปั๊มหมึกที่ทำจากผลิตภัณฑ์ PCR
genomic ชิ้นส่วนดีเอ็นเอที่สกัดได้จากยีสต์
เซลล์ โดยวิธีการของรับบทเอ็ด al. (1999) ด้วยเล็กน้อย
แก้ไข โดง 1/D2 ของ rDNA ชุดปั๊มหมึก
ขยาย โดย PCR กับพื้นไปข้างหน้า NL 1 และ
กลับพื้น NL-4 (O'Donnell, 1993) ผลิตภัณฑ์ PCR
ถูกตรวจสอบ โดย agarose electrophoresis เจล บริสุทธิ์ใช้
ชุดฟอกด่วน QIA (Qiagen ออนตาริโอ สหรัฐอเมริกา) และ
รอบเรียงลำดับใช้ ABI BigDye เทอร์มิเนเตอร์วนรอบ
รุ่นชุดลำดับเบส 3.1 (Biosystems ใช้ แคลิฟอร์เนีย,
สหรัฐอเมริกา) กับไพรเมอร์ภายนอก NL 1 และ NL-4
(Kurtzman และ Robnett, 1998) มีกำหนดลำดับที่
กับ 3100 เป็นปริซึม ABI อัตโนมัติ DNA sequencer
(ใช้ Biosystems แคลิฟอร์เนีย สหรัฐอเมริกา) ตาม
คำแนะนำของผู้ผลิต มีการเปรียบเทียบลำดับที่
pairwise ใช้ homology ระเบิดค้น(

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

การแยกและคัดเลือกสายพันธุ์ยีสต์
ยีสต์ทนร้อนอยู่ที่แยกได้จากตัวอย่างดินและน้ำจากโรงงานน้ำตาลและอ้อยปลูก

ใน 4 จังหวัด คือ พระนครศรีอยุธยา ราชบุรี สุพรรณบุรี และอุทัยธานี
, ประเทศไทย การแยกการ
ที่ 35  C โดยการใช้สื่อที่มีเทคนิคตาล
คั้นน้ำอ้อย ( 5% หรือ 8% รวม
น้ำตาล ) , 005 ( NH4 ) 2so4 และ 4 เปอร์เซ็นต์ ( v / v ) และเอทานอลด้วย
( pH ) และไม่มีการปรับ pH ( pH 3.8 ) หลังจากที่ได้รับวัฒนธรรมที่ถูกบ่มเป็นเวลา 3 วัน

( gallenkamp ในเครื่องปั่นหมุนโคจรฟักไข่ เลสเตอร์ , อังกฤษ ) ที่ไว้เขย่าที่ความเร็วของอุณหภูมิด้วย

170 รอบต่อนาที ผสานวัฒนธรรม แล้วลายบนอาหารวุ้น
จานที่มีตัวกลางเดียวกันและหัวเชื้อที่ 
3 Cบริสุทธิ์ยีสต์วัฒนธรรมไว้ใน ypd วุ้น slants
( กลูโคส 2 % สารสกัดจากยีสต์ 1 % 2 % ตามลำดับ และ 2 % Agar )
8 C .
 และเก็บไว้ที่อุณหภูมิสูงยีสต์สายพันธุ์ที่ใช้ในการเจริญเติบโตของพวกเขาในการแสดง
40 และ 45 องศาเซลเซียส ใน  อ้อย
juice broth ที่มี 8 % น้ำตาลทั้งหมดและ 0.05 %
( NH4 ) 2so4 และเสริมด้วย 4 เปอร์เซ็นต์ ( v / v ) เอทานอล วัฒนธรรมความสำเร็จการเก็บรวบรวมและการคัดเลือกต่อไป

ประสิทธิภาพของการผลิตเอทานอลที่อุณหภูมิสูง .

. . การคัดเลือกยีสต์ทนเอทานอลสำหรับการผลิตที่อุณหภูมิสูงสำหรับการคัดกรอง


การผลิตเอทานอลสูงดำเนินการที่ 40 และ 45  C หมักในฟลาสก์ขนาด 250 มิลลิลิตร ขวดบรรจุ 100 ml
ของแรกเริ่มน้ำอ้อยกลางประกอบด้วยอ้อย
น้ำผลไม้เติมซูโครสร้อยละ 18 และ total sugars และ
005 ( NH4 ) 2so4 และปรับ pH 4.5 กับ
1 N HCl . inocula เตรียมย้ายหนึ่งห่วง
เต็มของวัฒนธรรม 24 ชั่วโมง ที่ปลูกบนลาดเอียงของ ypd วุ้นกับ
เออร์เลนเมเยอร์ขวดที่มีปริมาตร 50 มิลลิลิตรของน้ำอ้อย
กลางดังกล่าว แต่เพียง 2% รวมกับน้ำตาล หลังจากบ่ม
บนเครื่องปั่นหมุนที่ 25 – 26  เป็นเวลา 24 ชั่วโมง inocula
ถูกย้ายในอัตรา 5 % เพื่อคัดกรอง
ขนาดกลางตามด้วยการบ่มในเครื่องปั่นหมุนที่ 40 และ 45  C .

2.3 การเลือกสารยีสต์สายพันธุ์ยีสต์สายพันธุ์ถูก

biochemically จาก physiologically และลักษณะโดยมาตรฐาน
วิธีการอธิบายโดยโรว์ ( 1998 ) การผสมผสานของสารประกอบไนโตรเจนที่ถูกตรวจสอบสื่อ

หิว inocula แข็งที่มีต่อวิธีการของ nakase และ
ซูซูกิ ( 1986 ) การเจริญเติบโตที่อุณหภูมิต่าง ๆ ถูกกำหนด โดยการปลูก
) สามารถในการใช้วุ้นและน้ำซุป
ตู้ฟักไข่ และอาบ น้ำ การจำแนกและการวิเคราะห์ phylogenetic
สายพันธุ์ของยีสต์
ขึ้นอยู่กับการวิเคราะห์เปรียบเทียบลำดับ
D1 / D2 โดเมนของหน่วยย่อยขนาดใหญ่ ( LSU ) rDNA
ได้ดําเนินการ การจัดลำดับของ D1 / D2
โดเมนของLSU rDNA พบว่าผลิตภัณฑ์ของดีเอ็นเอจากยีน
เศษอาหารที่สกัดจากเซลล์ยีสต์
โดยวิธีการของ lachance et al . ( 1999 ) ที่มีการปรับเปลี่ยนเล็กน้อย

D1 / D2 โดเมนของ LSU rDNA
ถูกขยายโดยวิธี PCR ด้วย primer รองพื้น nl-1 ไปข้างหน้าและย้อนกลับ nl-4
( O ' Donnell , 1993 ) pcr ผลิตภัณฑ์
ถูกตรวจสอบโดยเจลอิเล็กบริสุทธิ์ใช้
มั่นเร็วบริสุทธิ์ Kit ( QIAGEN , Ontario , สหรัฐอเมริกา ) และวงจรนี้ใช้อบิ bigdye

ลำดับรุ่นของ Terminator Kit 3.1 ( Applied Biosystems , California ,
USA ) ด้วยไพรเมอร์และภายนอก nl-1 nl-4
( เคิร์ทแมน และ robnett , 1998 ) อนุกรมถูกกำหนดด้วยปริซึม 3100

ปลายลำดับ DNA แบบอัตโนมัติ ( Applied Biosystems , California , USA ) ตาม
คำแนะนำของผู้ผลิต ลำดับการเปรียบเทียบ
คู่ระเบิด ( ตัวค้นหา