2009; Caputo et al., 2015; Quintier

2009; Caputo et al., 2015; Quintieri et al., 2012). Pseudomonas growth was
also controlled when LfcinB was deposited via a plasma process (PE-CVD)
on a polyethylene surface (Quintieri et al., 2013b).
To the best of our knowledge, the only experiment concerning BLF
application on fruits was carried out by Wang et al. (2012), who reported
that both BLF and its esterified derivative strongly inhibited spore
germination and germ tube elongation in Penicillium expansum which
is responsible for apple decay during storage.
This work aimed at evaluating the antimicrobial efficacy of BLF hydrolysates
(including the purified antimicrobial peptide LfcinB), against
selected Pseudomonas strains responsible for spoilage in various RTE
vegetables.
2. Material and methods
2.1. Isolation and identification of bacterial strains from ready-to-eat
vegetables
Presumptive spoilage pseudomonads were isolated from two samples
of refrigerated ready-to-eat curly endive (Chicorium endivia L. var. crispum
Lam.) and head lettuce (Lactuca sativa L. var. capitata L.), Trocadero type,
purchased from a local market. 30 g of each vegetable were aseptically
trasferred in a sterile stomacher bag containing 120 ml of sterile peptone
water 0.1%; (Becton Dickinson Difco, Milan, Italy) and homogenized in a
stomacher (BagMixer, Interscience, St. Nom., France) for 2 min. Serial decimal
dilutions of each homogenate were prepared in sterile saline solution
(0.9% NaCl), plated on Pseudomonas agar base enriched with Pseudomonas
CFC selective supplement (PSA, BioLife Italiana srl, Milan, Italy) and incubated
at 30 °C for 24 h. After incubation, 48 well-isolated colonies were
picked up from PSA plates. Pure cultures of each isolate were used for
DNA extraction using the Wizard Genomic DNA Purification kit (Promega
Italia Srl, Milan, Italy) following the manufacturer's instructions. DNA
quantity was determined using the spectrophotometer Nanodrop 1000
(Thermo Scientific, Waltman MA).
Biotyping of isolates was performed following the two-step RAPD-PCR
method as previously reported (Baruzzi et al., 2000; Ricelli et al., 2007;
Baruzzi et al., 2012a). Pseudomonas fluorescens DSM 50090 was used as
outgroup strain for comparison purposes. One single bacterial isolate for
each cluster was identified by amplifying and sequencing the 16S rRNA
gene (Wiesburg et al., 1991); in addition, and only for Pseudomonas
fluorescens strains, a more affordable taxonomic position was achieved
by sequencing the rpoB gene (1247 bp) (AitTayeb et al., 2005). Taxonomic
strain identification was performed by comparing the sequences of the
biotypes with those present in the Basic BLAST Search, as described by
Altschul et al. (1997), against nucleotide collection (nr/nt). The identified
biotypes, representative of each RAPD cluster, were stored in Nutrient
Broth (NB; Becton Dickinson Difco) with 20% glycerol at −80 °C in the
bacterial collection at the Institute of Sciences of Food Production.
2.2. Evaluation of spoilage by Pseudomonas spp. strains on vegetables
All strains were evaluated for their ability to cause spoilage on Iceberg
lettuce (L. sativa L. var. capitata L.), purchased from a local market.
Undamaged leaves from lettuce heads were individually washed under
tap water, disinfected for 5 min in 200 ppm sodium hypochlorite solution,
rinsed in sterile distilled water at 4 °C and dried on blotting
paper sheets for 30 min. Then, the disinfected lettuce leaves were cut
into small pieces (midrib length of 5–6 cm) that were transferred to
sterile Petri dishes. Each leaf piece was cross-wounded along the rib
using a sterile scalpel, resulting in a total number of 50 wounds for replicate.
Each strain was cultured in mPCB for 24 h at 30 °C to reach
0.325 ± 0.05 OD600nm, corresponding to ca. 8 log CFU/ml; bacterial
cells, recovered after centrifugation at 7000 g for 10 min, were diluted
in sterile saline solution to 5 log CFU/ml and inoculated on wounded
leaf (10 μL/wound). Control wounds supplemented or not with sterile
saline solution (Controls 2 and 1, respectively) were also performed.
Besides, each strain was spotted on unwounded leaves that were also
inoculated or not with sterile saline solution (Controls 3 and 4, respectively).
Control and treated samples were kept under a laminar flow
hood for 5–10 min before being stored at 4 °C. Each sample (50
wounds/sample) was performed in triplicate (N = 3).
The number of spoiled wounds (displaying tissue browning sometimes
followed by softening) on the leaf samples was recorded for
four days of cold storage in air and expressed as percentage of spoiled
wounds out of those examined.
Strains showing the highest spoilage percentage were further
assayed on Trocadero lettuce (L. sativa L.), celery (Apium graveolens
subsp. Dulce Mill., Pers), Belgian endive (Cichorium intybus L.) and escarole
chicory (C. endivia L. var. latifolium Lam.) for six days of cold storage;
in the case of celery, viable cells of different strains were
inoculated on the cross-section of the petiole.
2.3. Lactoferrin hydrolysis
The following enzymes were used for the hydrolysis of bovine
lactoferrin (BLF, NZMP lactoferrin 7100, Fonterra, Boulogne-Billancourt,
France): porcine pepsin (EC 3.4.23.1; 250 units/mg solid, Sigma-Aldrich),
papain (EC 3.4.22.2; 3 units/mg Sigma-Aldrich), rennin from
calf stomach (EC 3.4.23.4; ~20 units/mg; Sigma-Aldrich).
BLF (5% w/v) was hydrolysed with rennin and pepsin according to
Quintieri et al. (2012) and Elbarbary et al. (2010), respectively. Hydrolysis
with papain, was performed as reported by Ou et al. (2010). After incubation,
each reaction was stopped by heating at 90 °C and, after
centrifugation (10.000 ×g, 20 min, 4 °C), neutralized supernatants
were quantified for protein concentration (Bradford, 1976). All BLF hydrolysates
(LFHs) were freeze-dried and stored at −20 °C.
Each LFH (10 μg of protein) was resolved on Tricine SDS-PAGE using
the Mini Protean System (Bio-Rad Laboratories,Milan, Italy), as previously
reported (Schägger, 2006) in order to check the complete digestion
of BLF, confirmed by the absence of the related 80 kDa band on
the electrophoretic pattern. Electrophoresis was carried out for 30 min
at 30 V and then for 180 min at 90 V. After the run, gels were stained
with 0.125% Comassie Brilliant Blue G-250 (Sigma–Aldrich) according
to the method of Neuhoff et al. (1988).
2.4. Antimicrobial in vitro assays
In order to determine the useful concentration of BLF and LFHs, antimicrobial
assays were carried out by inoculating spoiler pseudomonads
(3 log CFU/ml) in mPCB amended with 0, 12.5, 25, 50 and 100 mg/ml of
BLF. Bacterial growth was monitored by measuring optical density every
10 min with the Varioskan Flash (ThermoFischer Scientific) spectrofluorimeter
at a wavelength of 600 nm up to 48 h. Each antimicrobial assay
was performed in triplicate. At first, the antimicrobial activity was checked
by calculating the Inhibition Index turbidity ratio (IITR) as follows:
IITR ¼ 1 ð Þ Ntx=Nto
ð Þ Ncx=Nco
where the values of OD600 readings (N) of the control (c) or treated (t)
samples are considered as a change between the beginning (time zero)
and the time when control samples began the stationary phase (time x)
(Giannuzzi and Zaritzky, 1996). The II values ranging from 0 to 1 indicated
the absence of inhibition and the permanence of the microorganism in
the lag phase, respectively. The concentration of BLF able to produce at
least an inhibition index of 0.5, on average, was considered enough to
be used in the subsequent assays. Besides, the latter were carried out by
a standard plate count method that avoids interference caused by cell
death; such interference cannot be excluded by spectrophotometric measurements.
Thus, fresh cell cultures of the target Pseudomonas strains
were inoculated (3 log CFU/ml) in mPCB amended with 50 mg/ml of
BLF or each LFH and incubated at 30 °C up to 30 h; mPCB without

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

2009 Caputo et al., 2015 Quintieri et al., 2012) ลีเจริญเติบโตได้ควบคุมเมื่อ LfcinB ที่ฝากผ่านกระบวนการพลาสมา (PE-เกี่ยวกับบนพื้นผิวพลาสติก (Quintieri et al., 2013b)ให้ดีสุดของความรู้ ทดสอบเฉพาะที่เกี่ยวข้องกับ BLFโปรแกรมประยุกต์บนผลไม้ถูกดำเนินโดย Wang et al. (2012), ที่รายงานว่า BLF และอนุพันธ์ของ esterified ขอห้ามสปอร์การงอกและจมูกหลอด elongation ใน Penicillium expansum ซึ่งรับผิดชอบผุแอปเปิ้ลระหว่างการเก็บรักษางานนี้มุ่งประเมินประสิทธิภาพของ BLF hydrolysates จุลินทรีย์(รวมถึงเพปไทด์จุลินทรีย์บริสุทธิ์ LfcinB), กับเลือกลีสายพันธุ์ชอบเน่าเสียใน RTE ต่าง ๆผัก2. วัสดุและวิธีการ2.1 การแยกและระบุสายพันธุ์แบคทีเรียจากพร้อมกินผักPseudomonads เน่าเสีย presumptive ถูกแยกต่างหากจากตัวอย่างที่สองของตู้เย็นและพร้อมกินหยัก endive (Chicorium endivia L. เพียง crispumลำนี้) และหัวผักกาด (Lactuca ซา L. เพียง capitata L.), ชนิดเอลลิงตันซื้อจากตลาดท้องถิ่น 30 กรัมผักละก็ asepticallytrasferred ในถุงใส่แผงประดับหน้าอกประกอบด้วย 120 มล.ของกอซ peptoneน้ำ 0.1% (Difco สัน Becton มิลาน อิตาลี) และ homogenized เป็นกลุ่มในการแผงประดับหน้าอก (BagMixer, Interscience, St. Nom. ฝรั่งเศส) สำหรับ 2 นาทีลำดับทศนิยมdilutions ของแต่ละ homogenate ได้เตรียมในน้ำเกลือฆ่าเชื้อ(0.9% NaCl), ชุบบนลี agar ฐานอุดมไป ด้วยลีCFC ที่ใช้เสริม (PSA, srl BioLife อิตาเลีย มิลาน อิตาลี) และ incubatedที่ 30 ° C ใน 24 ชม หลังจากบ่ม อาณานิคม 48 แยกห้องได้รับค่าจากแผ่นของ PSA ใช้ในวัฒนธรรมบริสุทธิ์ของแต่ละแยกสกัดดีเอ็นเอโดยใช้ชุดช่วย Genomic DNA ฟอก (PromegaSrl เลีย มิลาน อิตาลี) ตามคำแนะนำของผู้ผลิต ดีเอ็นเอกำหนดปริมาณการใช้เครื่องทดสอบกรดด่าง Nanodrop 1000(เทอร์โมวิทยาศาสตร์ Waltman MA)ทำ biotyping ของแยกตามสองขั้นตอนอาร์เอพีดี-PCRวิธีรายงาน (Baruzzi et al., 2000 เป็นก่อนหน้านี้ Ricelli et al., 2007Baruzzi และ al., 2012a) ใช้ pseudomonas fluorescens DSM 50090 เป็นoutgroup ต้องใช้สำหรับการเปรียบเทียบ แยกแบคทีเรียหนึ่งเดียวสำหรับแต่ละคลัสเตอร์ที่ระบุ ด้วยมือ และลำดับเบส 16S rRNAยีน (Wiesburg et al., 1991); นอกจากนี้ และ สำหรับลีสายพันธุ์ fluorescens ตำแหน่งอนุกรมวิธานถูกกว่าสำเร็จโดยลำดับเบสในยีน rpoB (1247 bp) (AitTayeb et al., 2005) อนุกรมวิธานต้องใช้รหัสถูกดำเนินการ โดยการเปรียบเทียบลำดับของการbiotypes กับปัจจุบันในการค้นหาระเบิดพื้นฐาน อธิบายไว้ด้วยAltschul et al. (1997), กับชุดนิวคลีโอไทด์ (nr/nt) ที่ระบุbiotypes ตัวแทนของแต่ละคลัสเตอร์อาร์เอพีดี ถูกเก็บไว้ในระบบซุป (NB Becton สัน Difco) กับกลีเซอร 20% ที่ −80 ° C ในการคอลเลกชันแบคทีเรียที่สถาบันวิทยาศาสตร์ผลิตอาหาร2.2 การประเมินผลตามสายพันธุ์โอลีในผักที่เน่าเสียสายพันธุ์ทั้งหมดได้ประเมินความสามารถในการทำให้เกิดการเน่าเสียในภูเขาน้ำแข็งผักกาดหอม (L. ซา L. เพียง capitata L.), ซื้อจากท้องตลาดไม่เสียหายออกจากหัวผักกาดถูกล้างภายใต้แต่ละก๊อกน้ำ ฆ่าเชื้อสำหรับ 5 นาทีในโซลูชัน 200 ppm ผงฟอกขาวrinsed ในน้ำกลั่นฆ่าเชื้อที่ 4 ° C และแห้งบน blotting วิธีแผ่นกระดาษสำหรับ 30 นาที จากนั้น มีตัดใบผักกาดหอมฆ่าเชื้อเป็นชิ้นเล็ก ๆ (midrib จำนวน 5 – 6 เซนติเมตร) ที่ถูกโอนย้ายไปใส่จาน Petri แต่ละชิ้นใบได้รับบาดเจ็บระหว่างบริเวณซี่โครงใช้ scalpel กอซ ในจำนวน 50 แผลสำหรับการจำลองแบบต้องใช้แต่ละถูกอ่างใน mPCB ใน 24 ชมที่ 30 ° C ถึงCFU/ml ระบบ 0.325 ± 0.05 OD600nm ที่สอดคล้องกับ ca. 8 แบคทีเรียมีผสมเซลล์ การกู้คืนหลังจาก centrifugation ที่ 7000 g สำหรับ 10 นาทีในการใส่น้ำเกลือไป 5 ล็อก CFU/ml และ inoculated ได้รับบาดเจ็บในลีฟ (10 μL/แผล) แผลควบคุมเสริม หรือไม่ใส่เกลือ (ควบคุม 1 และ 2 ตามลำดับ) ยังดำเนินการนอกจาก ต้องใช้แต่ละถูกด่างในใบดูจะที่ยังinoculated หรือไม่ใส่เกลือ (ควบคุม 3 และ 4 ตามลำดับ)ควบคุมและบำบัดอย่างถูกเก็บไว้ภายใต้กระแส laminarฮูดสำหรับ 5-10 นาทีก่อนที่จะมีการเก็บที่ 4 องศาเซลเซียส แต่ละตัวอย่าง (50ทำแผล/ตัวอย่าง) ใน triplicate (N = 3)จำนวนแผลบูด (แสดงเนื้อเยื่อ browning บางครั้งตาม ด้วยนุ่มนวล) บนใบ บันทึกตัวอย่างสำหรับวันที่สี่ของเย็นในอากาศ และแสดงเป็นเปอร์เซ็นต์ของเสียบาดแผลจากผู้ตรวจสอบสายพันธุ์ที่แสดงเปอร์เซ็นต์การเน่าเสียสูงสุดได้ต่อไปassayed ขึ้นฉ่าย (ผักชีบนผักกาดหอมเอลลิงตัน (L. ซา L.),ถั่ว Dulce โรงสี Pers), เบลเยียม endive (Cichorium intybus L.) และ escarolechicory (C. endivia L. เพียง latifolium Lam.) เย็น วัน 6ในกรณีของขึ้นฉ่าย เซลล์ทำงานได้ของสายพันธุ์ที่แตกต่างกันได้inoculated ในระหว่างส่วนของ petiole2.3. Lactoferrin ไฮโตรไลซ์ใช้เอนไซม์ต่อไปนี้สำหรับไฮโตรไลซ์ของวัวlactoferrin (BLF, lactoferrin NZMP 7100, Fonterra, Boulogne-Billancourtประเทศฝรั่งเศส): ช่วงเพพซิน (EC 3.4.23.1; 250 หน่วย/มิลลิกรัมของแข็ง ซิก Aldrich),พาเพอิน (EC 3.4.22.2 หน่วย 3 มิลลิกรัมซิก Aldrich), rennin จากลูกท้อง (EC 3.4.23.4 ~ 20 หน่วย/มก. Sigma-Aldrich)BLF (5% w/v) ถูก hydrolysed rennin และเพพซินตามQuintieri et al. (2012) และ Elbarbary et al. (2010), ตามลำดับ ไฮโตรไลซ์มีเอนไซม์ปาเปน ถูกทำเป็นรายงานโดย Ou et al. (2010) หลังจากคณะทันตแพทยศาสตร์แต่ละปฏิกิริยาได้หยุดลง โดยเครื่องทำความร้อน ที่ 90 ° C และ หลังsupernatants neutralized centrifugation (10.000 × g, 20 นาที 4 ° C),มี quantified สำหรับโปรตีนเข้มข้น (แบรดฟอร์ด 1976) ทั้งหมด BLF hydrolysatesอบแห้ง และเก็บไว้ที่ −20 องศาเซลเซียส (LFHs)แต่ละ LFH (โปรตีน 10 μg) ได้รับการแก้ไขใน Tricine SDS หน้าใช้มินิ Protean ระบบ (ห้องปฏิบัติการชีวภาพราษฎร์ มิลาน อิตาลี), เป็นก่อนหน้านี้รายงาน (Schägger, 2006) เพื่อให้ตรวจสอบย่อยอาหารสมบูรณ์ของ BLF ยืนยัน โดยขาดวง 80 kDa ที่เกี่ยวข้องรูปแบบด้วยกัน Electrophoresis เป็นดำเนินการใน 30 นาทีที่ 30 V และ สำหรับ 180 นาทีที่ 90 V หลังจากการรัน เจมีสีกับ 0.125% G-250 Comassie สดใสสีฟ้า (ซิก-Aldrich) ตามวิธีของ Neuhoff et al. (1988)2.4. assays จุลินทรีย์การเพาะเลี้ยงเพื่อกำหนดความเข้มข้นประโยชน์ BLF และ LFHs ต้านจุลชีพassays ถูกดำเนินการ โดย inoculating สปอยเลอร์ pseudomonads(ระบบ 3 CFU/ml) ใน mPCB แก้ไข ด้วย 0, 12.5, 25, 50 และ 100 mg/ml ของBLF เจริญเติบโตของแบคทีเรียถูกตรวจสอบ โดยการวัดความหนาแน่นออปติคอลทุก10 นาทีกับ spectrofluorimeter Varioskan Flash (ThermoFischer วิทยาศาสตร์)ที่ความยาวคลื่นของ 600 nm ถึง 48 h วิเคราะห์จุลินทรีย์แต่ละที่ดำเนินการใน triplicate ครั้งแรก ตรวจสอบกิจกรรมจุลินทรีย์โดยคำนวณอัตราส่วนความขุ่นดัชนียับยั้ง (IITR) เป็นดังนี้:Þð IITR ¼ 1 Ntx = NtoðÞ Ncx = Ncoซึ่งค่าของ OD600 อ่าน (N) ของตัวควบคุม (c) หรือบำบัด (t)ตัวอย่างถือเป็นการเปลี่ยนแปลงระหว่างต้น (เวลาศูนย์)และเวลาเมื่อตัวควบคุมตัวอย่างเริ่มระยะเครื่องเขียน (เวลา x)(Giannuzzi และ Zaritzky, 1996) ระบุค่า II ตั้งแต่ 0 ถึง 1ขาดความยับยั้ง permanence ของจุลินทรีย์ในความล่าช้าในระยะ ตามลำดับ ความเข้มข้นของ BLF สามารถผลิตที่ดัชนียับยั้งอย่างน้อย 0.5 เฉลี่ย ถือเป็นพอใช้ assays ตามมา นอกจาก หลังถูกดำเนินการโดยวิธีนับจานมาตรฐานที่หลีกเลี่ยงสัญญาณรบกวนที่เกิดจากเซลล์ความตาย สัญญาณรบกวนดังกล่าวไม่สามารถถูกแยกออก โดยวัด spectrophotometricดังนั้น วัฒนธรรมเซลล์สดของสายพันธุ์ Pseudomonas เป้าหมายมี inoculated (3 ล็อก CFU/ml) ใน mPCB แก้ไข ด้วย 50 mg/ml ของBLF หรือแต่ละ LFH และ incubated ที่ 30 ° C ถึง h; 30 mPCB ไม่มี

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

2009; Caputo et al, 2015. Quintieri et al., 2012) การเจริญเติบโตของเชื้อ Pseudomonas
ได้นอกจากนี้ยังมีการควบคุมเมื่อLfcinB ถูกวางผ่านกระบวนการพลาสม่า (PE-CVD)
บนพื้นผิวพลาสติก (Quintieri et al., 2013b).
ที่ดีที่สุดของความรู้ของเราการทดลองเพียงเกี่ยวกับการ BLF
โปรแกรมประยุกต์บนผลไม้ได้ดำเนินการโดย วัง et al, (2012)
ที่รายงานว่าทั้งสองBLF และอนุพันธ์ esterified
ที่ยับยั้งการขอสปอร์งอกและการยืดตัวหลอดเชื้อโรคในPenicillium expansum
ซึ่งเป็นผู้รับผิดชอบในการสลายตัวของแอปเปิ้ลระหว่างการเก็บรักษา.
งานนี้มุ่งเป้าไปที่การประเมินประสิทธิภาพยาต้านจุลชีพของไฮโดรไลเซ BLF
(รวมทั้งเปปไทด์ต้านจุลชีพบริสุทธิ์ LfcinB) กับสายพันธุ์ Pseudomonas เลือกที่รับผิดชอบในการเน่าเสียในหลาย ๆ ด้าน RTE ผัก. 2 วัสดุและวิธีการ2.1 การแยกและจำแนกสายพันธุ์ที่เกิดจากแบคทีเรียพร้อมที่จะกินผักpseudomonads เน่าเสียสันนิษฐานที่แยกได้จากสองตัวอย่างของตู้เย็นพร้อมที่จะกินพืชชนิดหนึ่งหยิก(Chicorium endivia ลิตร var. crispum ลำ.) และผักกาดหอมหัว (Lactuca sativa L. var . capitata L. ) ประเภท Trocadero, ซื้อมาจากตลาดในประเทศ 30 กรัมของผักแต่ละปลอดเชื้อtrasferred ในถุง Stomacher ผ่านการฆ่าเชื้อที่มี 120 มล. ของเปปโตนผ่านการฆ่าเชื้อน้ำ0.1%; (Becton Dickinson Difco, มิลาน, อิตาลี) และปั่นในStomacher (BagMixer, Interscience เซนต์ Nom. ฝรั่งเศส) เป็นเวลา 2 นาที ทศนิยมอนุกรมเจือจางของแต่ละ homogenate ได้จัดทำขึ้นน้ำเกลือปลอดเชื้อ (0.9% NaCl) บนฐานชุบวุ้น Pseudomonas อุดมไปด้วย Pseudomonas CFC เลือกอาหารเสริม (PSA, BioLife SRL อิตาเลีย, มิลาน, อิตาลี) และบ่มที่อุณหภูมิ30 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 24 ชั่วโมง หลังจากการบ่ม 48 อาณานิคมดีแยกถูกหยิบขึ้นมาจากแผ่นPSA วัฒนธรรมบริสุทธิ์ของแต่ละแยกถูกนำมาใช้สำหรับการสกัดดีเอ็นเอโดยใช้ตัวช่วยสร้างดีเอ็นเอจีโนมชุดบริสุทธิ์ (Promega เลีย Srl, มิลาน, อิตาลี) ทำตามคำแนะนำของผู้ผลิต ดีเอ็นเอปริมาณที่ถูกกำหนดโดยใช้ spectrophotometer Nanodrop 1000 (เทอร์โมวิทยาศาสตร์ Waltman MA). พิมพ์ไบโอของเชื้อที่ได้ดำเนินการดังต่อไปนี้ RAPD-PCR สองขั้นตอนวิธีการตามที่รายงานก่อนหน้านี้(Baruzzi et al, 2000;. Ricelli et al, 2007;. Baruzzi et al., 2012a) Pseudomonas fluorescens DSM 50090 ถูกใช้เป็นสายพันธุ์outgroup เพื่อการเปรียบเทียบ แยกแบคทีเรียหนึ่งเดียวสำหรับแต่ละกลุ่มที่ถูกระบุโดยขยายและลำดับ 16S rRNA ยีน (Wiesburg et al, 1991.); นอกจากนี้และสำหรับ Pseudomonas fluorescens สายพันธุ์ที่ตำแหน่งการจัดหมวดหมู่ราคาไม่แพงมากก็ประสบความสำเร็จโดยลำดับยีนrpoB (1247 bp) (AitTayeb et al., 2005) การจัดหมวดหมู่การระบุสายพันธุ์ที่ได้ดำเนินการโดยการเปรียบเทียบลำดับของไบโอไทป์กับผู้ที่อยู่ในพื้นฐานระเบิดค้นหาตามที่อธิบายAltschul et al, (1997) กับคอลเลกชันเบส (NR / เอ็นที) ระบุไบโอไทป์เป็นตัวแทนของแต่ละกลุ่มอาร์เอพีได้รับสารอาหารที่เก็บไว้ในน้ำซุป(NB; Becton Dickinson Difco) กับกลีเซอรีน 20% ที่ -80 องศาเซลเซียสในคอลเลกชันของเชื้อแบคทีเรียที่สถาบันวิทยาศาสตร์ของการผลิตอาหาร. 2.2 การประเมินผลการเน่าเสียโดย Pseudomonas spp สายพันธุ์ผักสายพันธุ์ทั้งหมดได้รับการประเมินความสามารถในการก่อให้เกิดการเน่าเสียในภูเขาน้ำแข็งผักกาดหอม(แอล sativa L. var. capitata L. ) ที่ซื้อมาจากตลาดในประเทศ. ใบไม่เสียหายจากหัวผักกาดหอมถูกล้างเป็นรายบุคคลภายใต้น้ำประปาฆ่าเชื้อ 5 นาทีในสารละลายโซเดียมไฮโปคลอไรต์ 200 ppm, ล้างในน้ำกลั่นผ่านการฆ่าเชื้อที่อุณหภูมิ 4 องศาเซลเซียสและแห้งใน blotting แผ่นกระดาษเป็นเวลา 30 นาที จากนั้นใบผักกาดหอมฆ่าเชื้อที่ถูกตัดเป็นชิ้นเล็ก ๆ (ความยาวเส้นกลางใบ 5-6 ซม.) ที่ถูกย้ายไปผ่านการฆ่าเชื้ออาหารเลี้ยงเชื้อ ชิ้นส่วนใบแต่ละคนได้ข้ามได้รับบาดเจ็บซี่โครงพร้อมใช้มีดผ่าตัดหมันส่งผลให้จำนวน 50 แผลสำหรับซ้ำ. สายพันธุ์แต่ละคนที่เลี้ยงใน mPCB เวลา 24 ชั่วโมงที่อุณหภูมิ 30 องศาเซลเซียสไปถึง0.325 ± 0.05 OD600nm สอดคล้องกับแคลิฟอร์เนีย เข้าสู่ระบบ 8 CFU / ml; แบคทีเรียเซลล์กู้คืนหลังจากการหมุนเหวี่ยงที่ 7,000 กรัมเป็นเวลา 10 นาทีถูกเจือจางในสารละลายน้ำเกลือปลอดเชื้อ5 log CFU / ml และเชื้อที่ได้รับบาดเจ็บในใบ(10 ไมโครลิตร / แผล) บาดแผลควบคุมเสริมหรือไม่กับการฆ่าเชื้อน้ำเกลือ (การควบคุมที่ 2 และ 1 ตามลำดับ) ได้ดำเนินการยัง. นอกจากนี้แต่ละสายพันธุ์ก็เห็นบนใบกรี๊ดกร๊าดที่ยังเชื้อหรือไม่ด้วยน้ำเกลือปลอดเชื้อ (การควบคุมที่ 3 และ 4 ตามลำดับ). การควบคุม และตัวอย่างได้รับการรักษาที่ถูกเก็บไว้ภายใต้ไหลเครื่องดูดควันประมาณ5-10 นาทีก่อนที่จะถูกเก็บไว้ที่ 4 องศาเซลเซียส แต่ละตัวอย่าง (50 แผล / ตัวอย่าง) ที่ได้ดำเนินการในเพิ่มขึ้นสามเท่า (ยังไม่มี = 3). จำนวนของแผลเน่าเสีย (แสดงการเกิดสีน้ำตาลเนื้อเยื่อบางครั้งตามมาด้วยการอ่อนตัว) ตัวอย่างใบที่ถูกบันทึกไว้สำหรับสี่วันของการเก็บรักษาความเย็นในอากาศและแสดงเป็นเปอร์เซ็นต์ของเสียบาดแผลจากผู้ตรวจสอบ. สายพันธุ์แสดงเป็นเปอร์เซ็นต์สูงที่สุดคือการเน่าเสียต่อassayed บนผักกาดหอม Trocadero (แอล sativa L. ) คื่นฉ่าย (Apium ผักชีลาวsubsp. Dulce Mill. ท่าน), เบลเยียมพืชชนิดหนึ่ง (Cichorium intybus L. ) และ escarole สีน้ำเงิน (ค endivia L. var latifolium ลำ..) หกวันของการจัดเก็บเย็นในกรณีของคื่นฉ่าย, เซลล์ที่มีชีวิตสายพันธุ์ที่แตกต่างกันของการได้รับเชื้อในข้ามส่วนของก้านใบ. 2.3 Lactoferrin ย่อยสลายเอนไซม์ต่อไปนี้ถูกนำมาใช้สำหรับการย่อยสลายของวัวlactoferrin (BLF, NZMP lactoferrin 7100, ฟอนเทียร่า, Boulogne-Billancourt, ฝรั่งเศส): น้ำย่อยสุกร (EC 3.4.23.1; 250 หน่วย / mg ของแข็ง Sigma-Aldrich), ปาเปน ( EC 3.4.22.2 3 หน่วย / mg Sigma-Aldrich) rennin จากท้องน่อง(EC 3.4.23.4; ~ 20 หน่วย / มก. Sigma-Aldrich) BLF (5% w / v) ถูกย่อยด้วยน้ำย่อยและ rennin ตาม เพื่อQuintieri et al, (2012) และ Elbarbary et al, (2010) ตามลำดับ การย่อยสลายด้วยปาเปนได้รับการดำเนินการตามที่รายงานโดย Ou et al, (2010) หลังจากบ่มปฏิกิริยาแต่ละคนถูกหยุดด้วยความร้อนที่ 90 องศาเซลเซียสและหลังจากการหมุนเหวี่ยง(10.000 กรัม× 20 นาที, 4 ° C) supernatants เป็นกลางถูกวัดความเข้มข้นของโปรตีน(แบรด, 1976) ทั้งหมดไฮโดรไลเซ BLF (LFHs) เป็นแห้งและเก็บไว้ที่ -20 ° C. แต่ละ LFH (10 ไมโครกรัมของโปรตีน) ได้รับการแก้ไขใน Tricine SDS-PAGE ใช้มินิProtean ระบบ (ห้องปฏิบัติการ Bio-Rad, มิลาน, อิตาลี) เช่น ก่อนหน้านี้รายงาน(Schägger 2006) เพื่อที่จะตรวจสอบการย่อยอาหารที่สมบูรณ์ของBLF ได้รับการยืนยันโดยไม่มีของที่เกี่ยวข้อง 80 กิโลดาลตันวงดนตรีในรูปแบบอิเลค electrophoresis ได้ดำเนินการเป็นเวลา 30 นาทีวันที่30 V แล้ว 180 นาทีที่ 90 โวลต์หลังจากที่ทำงาน, เจลมีการย้อมด้วย0.125% Comassie สดใสสีฟ้า G-250 (Sigma-Aldrich) ตามวิธีการของNeuhoff et al, (1988). 2.4 ยาต้านจุลชีพในหลอดทดลองการตรวจเพื่อตรวจสอบความเข้มข้นของการใช้งานของ BLF และ LFHs, ยาต้านจุลชีพตรวจได้ดำเนินการโดยการฉีดวัคซีนpseudomonads สปอยเลอร์(3 log CFU / ml) ใน mPCB แก้ไขเพิ่มเติม 0, 12.5, 25, 50 และ 100 มิลลิกรัม / มิลลิลิตรBLF . เจริญเติบโตของแบคทีเรียได้รับการตรวจสอบโดยการวัดความหนาแน่นของแสงทุก10 นาทีกับ Varioskan Flash (ThermoFischer วิทยาศาสตร์) spectrofluorimeter ที่ความยาวคลื่น 600 นาโนเมตรของได้ถึง 48 ชั่วโมง แต่ละการทดสอบยาต้านจุลชีพที่ได้ดำเนินการในเพิ่มขึ้นสามเท่า ตอนแรกฤทธิ์ต้านจุลชีพได้รับการตรวจสอบโดยการคำนวณอัตราส่วนขุ่นดัชนียับยั้ง (IITR) ดังนี้ IITR ¼ 1 ðÞ NTX = Nto ðÞ NCX = NCO ที่คุณค่าของการอ่าน OD600 (N) ของการควบคุม (ค) หรือ ได้รับการรักษา (t) ตัวอย่างจะถือว่าเป็นการเปลี่ยนแปลงระหว่างจุดเริ่มต้น (เวลาศูนย์) และเวลาที่กลุ่มตัวอย่างควบคุมเริ่มเฟส (เวลา x) (Giannuzzi และ Zaritzky, 1996) ค่าครั้งที่สองตั้งแต่ 0-1 แสดงให้เห็นตัวตนของการยับยั้งและความคงทนของจุลินทรีย์ในที่ขั้นตอนที่ล่าช้าตามลำดับ ความเข้มข้นของ BLF สามารถในการผลิตที่น้อยกว่าดัชนีของการยับยั้ง0.5 โดยเฉลี่ยได้รับการพิจารณามากพอที่จะนำมาใช้ในการวิเคราะห์ที่ตามมา นอกจากนี้หลังถูกหามออกจากแผ่นมาตรฐานวิธีการนับที่จะหลีกเลี่ยงการรบกวนที่เกิดจากเซลล์ที่ตาย รบกวนดังกล่าวไม่สามารถได้รับการยกเว้นจากการวัดสเปก. ดังนั้นเซลล์เพาะเลี้ยงใหม่ของเป้าหมายสายพันธุ์ Pseudomonas ถูกเชื้อ (3 log CFU / ml) ใน mPCB แก้ไขเพิ่มเติม 50 มิลลิกรัม / มิลลิลิตรBLF หรือแต่ละ LFH และบ่มที่อุณหภูมิ 30 องศาเซลเซียสถึง 30 เอช; โดยไม่ต้อง mPCB

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

2009 ; คาปูโต et al . , 2015 ; quintieri et al . , 2012 ) การเจริญเติบโตของ
ยังควบคุมเมื่อ lfcinb ฝากผ่านกระบวนการพลาสมา ( pe-cvd )
บนพื้นผิวพลาสติก ( quintieri et al . , 2013b ) .
เพื่อที่ดีที่สุดของความรู้ของเรา มีการทดลองเกี่ยวกับการใช้ blf
บนผลไม้ ทำโดย Wang et al . ( 2012 ) ที่รายงาน
ที่ทั้ง blf และ esterified อนุพันธ์ขอยับยั้งการงอกของสปอร์เชื้อรา Penicillium
และจมูกข้าวท่อยืด expansum ซึ่ง
รับผิดชอบสลายแอปเปิ้ลในระหว่างการเก็บรักษา .
งานนี้มีวัตถุประสงค์เพื่อประเมินประสิทธิภาพของยาต้านจุลชีพของ blf
( รวมถึงการ lfcinb เปปไทด์บริสุทธิ์ ) กับ
เลือกของสายพันธุ์รับผิดชอบการเน่าเสียใน
ถนนสายต่าง ๆผัก .
2 วัสดุและวิธีการ
2.1 . การแยกและจำแนกสายพันธุ์แบคทีเรียจากพร้อมที่จะกินผัก

pseudomonads ให้ผลของเสียที่แยกได้จากสองตัวอย่าง
ของตู้เย็นพร้อมที่จะกินหยิกเต่าลายตีนเป็ด ( chicorium endivia L . var . crispum
ลำ ) และหัวผักกาด ( ประสิทธิภาพ sativa L . var . capitata L . ) , ชนิด Trocadero ,
ซื้อจากตลาดในประเทศ30 กรัมของผักแต่ละ aseptically
trasferred อยู่ในถุงบรรจุปลอดเชื้อแผงประดับหน้าอก 120 มิลลิลิตรเป็นหมันของเปปโตน
น้ำ 0.1% ( เบคตอนดิกคินสัน difco , มิลาน , อิตาลี ) และบดใน
แผงประดับหน้าอก ( bagmixer interscience St . , นม , ฝรั่งเศส ) 2 นาทีต่อเนื่อง ทศนิยม
วิธีการแต่ละแยกเตรียมใน น้ำเกลือปลอดเชื้อ
( 0.9% NaCl )ชุบบนฐานของอาหารที่อุดมด้วย Pseudomonas
CFC เลือกเสริม ( ป biolife จาก Srl , มิลาน , อิตาลี ) และบ่ม
ที่ 30 °องศาเซลเซียสเป็นเวลา 24 ชั่วโมง หลังจากบ่ม 48 ดีกาเวียนเป็น
หยิบขึ้นมาจาก PSA จาน เชื้อบริสุทธิ์ของแต่ละแยกใช้สำหรับ
การสกัดดีเอ็นเอโดยใช้ตัวช่วยสร้างดีเอ็นเอบริสุทธิ์ Kit ( promega
Italia Srl , มิลาน ,อิตาลี ) ตามคำแนะนำของผู้ผลิต ปริมาณดีเอ็นเอ
ตั้งใจใช้วัสดุ nanodrop 1000
( เทอร์โมวิทยาศาสตร์ , วอลต์เมิ่น MA )
biotyping ของไอโซเลททำการตามขั้นตอนสองชื่อเรื่อง
วิธีตามที่รายงานก่อนหน้านี้ ( baruzzi et al . , 2000 ; ricelli et al . , 2007 ;
baruzzi et al . , 2012a ) pseudomonas fluorescens dsm 50090 was used as
กลุ่มสายพันธุ์เพื่อวัตถุประสงค์ในการเปรียบเทียบ หนึ่งเดียวจากแบคทีเรีย
แต่ละกลุ่มระบุ ลำดับเบส 16S rRNA และ amplifying ที่
ยีน ( wiesburg et al . , 1991 ) ; นอกจากนี้และสำหรับ Pseudomonas fluorescens สายพันธุ์
, ตำแหน่งทางมากขึ้นเท่ากับ
โดยลําดับ rpob ยีน ( 1247 BP ) ( aittayeb et al . , 2005 ) . อนุกรมวิธาน
การจำแนกสายพันธุ์โดยใช้การเปรียบเทียบลำดับของ
biotypes กับเหล่านั้นอยู่ในพื้นฐานการค้นหาระเบิด , ตามที่อธิบายไว้โดย
แอลเชิล et al . ( 1997 ) กับยีนคอลเลกชัน ( NR / NT ) ระบุด้วย
biotypes ตัวแทนของแต่ละกลุ่มที่ถูกเก็บไว้ในน้ำสารอาหาร
( หมายเหตุ ; เบคตอนดิกคินสัน difco ) 20 % กลีเซอรอลที่− 80 ° C ใน
ของคอลเลกชันที่สถาบันวิทยาศาสตร์ของการผลิตอาหาร
2.2 . การประเมินผลของการเน่าเสียโดย Pseudomonas spp . สายพันธุ์ผัก
ทุกสายพันธุ์ ได้แก่ ความสามารถในการทำให้เกิดการเน่าเสียในผักกาดหอมภูเขาน้ำแข็ง
( L . sativa L . var . capitata L . ) ที่ซื้อจากตลาดท้องถิ่น
ไม่เสียหายจากหัวผักกาดใบเป็นแบบล้างภายใต้
ประปาฆ่าเชื้อเป็นเวลา 5 นาที ในสารละลายโซเดียมไฮโปคลอไรท์ 200 ppm และสารละลาย
ล้างในน้ำกลั่นที่ 4 ° C หมันแห้งบนแผ่นกระดาษและ blotting
เป็นเวลา 30 นาที จากนั้น ฆ่าเชื้อผักกาดหอมใบตัด
เป็นชิ้นเล็ก ๆ ( ความยาวเส้นกลางใบ 5 – 6 ซม. ) ที่ถูกย้ายไป

จาน Petri เป็นหมัน each leaf piece เขาหรือเปล่า? กฏ along the สิ้นชีพ
กับ Jessy sterile ,ส่งผลให้จำนวน 50 แผล เพื่อเลียนแบบ .
แต่ละสายพันธุ์ในการเพาะเลี้ยง mpcb 24 H 30 ° C ถึง
0.325 ± 0.05 od600nm ที่ประมาณ 8 log CFU / ml ; แบคทีเรีย
เซลล์ฟื้นตัวหลังการปั่นเหวี่ยงที่ 7000 กรัมต่อ 10 นาทีลด
ในน้ำเกลือให้ปลอดเชื้อ 5 log cfu / ml และหัวเชื้อที่บาดเจ็บ
ใบ ( 10 μ L / แผล ) บาดแผลไม่หมัน
เสริมหรือควบคุมน้ำเกลือ ( การควบคุม 2 และ 1 ตามลำดับ ) นอกจากนี้ยังแสดง
นอกจากนี้แต่ละสายพันธุ์เห็น unwounded ใบที่ยังไม่ปราศจากเชื้อด้วย
หรือน้ำเกลือ ( การควบคุมที่ 3 และ 4 ตามลำดับ ) และถูกควบคุมตัวอย่าง

เก็บไว้ภายใต้การไหลแบบราบเรียบเครื่องดูดควัน 5 – 10 นาที ก่อนที่จะถูก เก็บไว้ที่อุณหภูมิ 4 องศา แต่ละตัวอย่าง ( 50
แผล / ตัวอย่าง ) กำหนดทั้งสามใบ ( n =
3 )จำนวนของแผลเน่า ( แสดงเนื้อเยื่อสีน้ำตาลบางครั้ง
ตามด้วยอ่อน ) ในตัวอย่างใบบันทึกสำหรับ
4 วันเย็นในอากาศและแสดงเป็นเปอร์เซ็นต์ของบูด
แผลจากผู้ทดสอบ
สายพันธุ์แสดงร้อยละการเน่าเสียมากที่สุดคือต่อไป
assayed ใน Trocadero ผักกาดหอม ( L . sativa L . ) , ขึ้นฉ่าย ( จิ๊บจิ๊บ
subsp . Dulce โรงสี , ที่พัก )เบลเยียมเต่าลายตีนเป็ด ( cichorium intybus L . ) และ escarole
ชิโครี ( C . endivia L . var . latifolium ลำ ) หกวันของห้องเย็น ;
ในกรณีของผักชีฝรั่ง , เซลล์ที่มีศักยภาพของสายพันธุ์ที่แตกต่างกันในขนาดของเชื้อคือ
ก้านใบ .
2.3 เอนไซม์เอนไซม์ lactoferrin
ต่อไปนี้ใช้ในการย่อยสลายของหัวใจวัว
( blf nzmp lactoferrin , 7100 ฟอนเทียร่า บูโลญ billancourt
, , ,ฝรั่งเศส ) : เลือดหมูเพพซิน ( EC 3.4.23.1 ; 250 หน่วย / มิลลิกรัมของแข็ง ซิกม่า Aldrich )
ปาเปน ( EC 3.4.22.2 3 หน่วย / มิลลิกรัม ซิกม่า Aldrich ) วิ่งจากกระเพาะลูกวัว ( EC 3.4.23.4
; ~ 20 หน่วย / มิลลิกรัม ; ซิกม่า Aldrich )
blf ( 5% w / v ) คือน้ำตาลกับ ภาษีรถยนต์และเพพซินตาม
quintieri et al . ( 2012 ) และ elbarbary et al . ( 2010 ) , ตามลำดับ เอนไซม์ปาเปน
ที่มีการรายงานโดย OU , et al . ( 2010 )หลังจากระยะเวลา
แต่ละปฏิกิริยาถูกหยุดโดยความร้อนที่ 90 ° C และหลังจาก
3 ( 10.000 ×กรัม , 20 นาที , 4 ° C ) , เป็นกลาง supernatants
เป็นวัดสำหรับความเข้มข้นของโปรตีน ( แบรดฟอร์ด , 1976 ) all blf hydrolysates
( lfhs ) สำหรับ freeze-dried ( ไม่ใช่เรื่องแต่ง−° c.
each lfh ( 10 μ g ของ protein ) เขาเป็น on sds-page tricine
และเดิน protean system ( bio rad Ruby , แผ่นอิตาลี ) , ตามที่รายงานก่อนหน้านี้
( ขอราคาและ gger , 2006 ) ในการตรวจสอบที่สมบูรณ์ของการย่อย
blf ยืนยันโดยการขาดงานของเกี่ยวกับ 80 kDa วงดนตรี
รูปแบบรูปแบบ . electrophoresis พบว่า 30 นาที
ที่ 30 V แล้ว 180 นาทีที่ 90 V หลังจากใช้เจลใช้ย้อม
กับ 0.125 % comassie Brilliant Blue g-250 ( ซิกม่า Aldrich
) ) ตามวิธีการ neuhoff et al .( 1988 ) .
2.4 . ยาต้านจุลชีพในหลอดทดลอง )
เพื่อตรวจสอบความเข้มข้นและประโยชน์ของ blf lfhs ยาต้านจุลชีพ
วิธีดําเนินการโดยการฉีดวัคซีนสปอยเลอร์ pseudomonads
3 log CFU / ml ) ใน mpcb แก้ไข 0 , 15 , 25 , 50 และ 100 mg / ml
blf . การเติบโตของแบคทีเรียถูกตรวจสอบโดยการวัดความหนาแน่นของแสงทุก
10 นาทีกับ varioskan แฟลช ( thermofischer ทางวิทยาศาสตร์ ) spectrofluorimeter
ที่ความยาวคลื่น 600 nm ถึง 48 ชั่วโมงในแต่ละวัน
แสดงทั้งสามใบ ที่แรก , ฤทธิ์ต้านจุลชีพที่ถูกตรวจสอบโดยคำนวณหาดัชนีความยับยั้ง
อัตราส่วน ( iitr ) ดังนี้ :
iitr ¼ 1 ðÞ ntx = n
ðÞ ncx = NCO
ที่คุณค่าของการอ่าน od600 ( n ) ควบคุม ( C ) ( t )
หรือปฏิบัติตัวอย่าง ถือเป็นการเปลี่ยนแปลงระหว่างต้น ( เวลาศูนย์ )
และเวลาเมื่อตัวอย่างควบคุมเริ่มเฟสอยู่กับที่ ( x )
( giannuzzi และ zaritzky , 1996 ) II ค่าตั้งแต่ 0 ถึง 1 )
ขาดการยับยั้ง และความยั่งยืนของจุลินทรีย์ใน
lag phase ) ความเข้มข้นของ blf สามารถผลิตที่เป็นดัชนีของการยับยั้ง
อย่างน้อย 0.5 ,โดยเฉลี่ยถือว่าพอ

ใช้ในวิธีที่ตามมา นอกจากนี้ หลังทดลองโดย
มาตรฐานจานนับวิธีที่หลีกเลี่ยงการรบกวนที่เกิดจากเซลล์
ความตาย การรบกวนดังกล่าวไม่สามารถยกเว้นได้โดยการวัด i .
ดังนั้นวัฒนธรรมของเซลล์สดของ
สายพันธุ์ Pseudomonas เป้าหมายปลูกเชื้อ ( 3 log CFU / ml ) ใน mpcb แก้ไขเพิ่มเติม 50 มก. / มล.
blf หรือแต่ละ lfh บ่มที่ 30 ° C ถึง 30 mpcb โดยไม่
h ;