Preferably, the วิธีเพื่อผลิต an สารประกอบอินทรีย์ of this
embodiment includes the aforementioned culture step, and further includes a thickening step of increasing the ratio of the ไมโครแอลจี after being cultured and a drying step of drying the ไมโครแอลจี by further reducing the moisture in
the ไมโครแอลจี after the thickening step. In the วิธีเพื่อผลิต an
30 สารประกอบอินทรีย์, the thickening step and the drying step are not necessarily
needed.
The thickening step can be performed, for example, by using a common thickener.
[0062]
5 Specifically, examples of the thickener include a device that
concentrates the ไมโครแอลจี by increasing the ratio of the ไมโครแอลจี, for
example, using floatation thickening, gravity thickening, thickening using
membrane filtration, or belt thickening. Further, a dehydrator can be used as the thickener in order to further increase the ratio of the ไมโครแอลจี.
10 Specifically, examples of the dehydrator include a vacuum dehydrator, a
pressure dehydrator (filter press), a belt press, a screw press, a centrifugal
dehydrator (screw decanter), and a multi-disk dehydrator.
The thickening step may be performed using only the thickener, or may
be performed using both of the thickener and the dehydrator, depending on 15 applications of โพลีแซคคาไรด์, ไลปิด, proteins, or the like to be produced.
[0063]
The drying step can be performed, for example, by heating the ไมโครแอลจี after the thickening step or placing the ไมโครแอลจี after the thickening step under reduced pressure.
20 [0064]
Since the ไมโครแอลจี after the thickening step or the ไมโครแอลจี after the drying step can contain at least one of โพลีแซคคาไรด์, ไลปิด, vitamin C, vitamin E, รงควัตถุ, and proteins in their cells, they can be used as they are in applications such as food.
25 Further, at least one of โพลีแซคคาไรด์, ไลปิด, vitamin C, vitamin E,
รงควัตถุ, and proteins is extracted from the ไมโครแอลจี as an organic
compound by subjecting the ไมโครแอลจี after the thickening step or the
ไมโครแอลจี after the drying step to a common extraction process, as needed. The extracted สารประกอบอินทรีย์ can be used in applications such as food raw
30 materials and fuel.
Examples of the extraction process to be employed include an extraction process of extracting the aforementioned สารประกอบอินทรีย์ using an organic solvent such as ethanol and hexane, and an extraction process of extracting the aforementioned ไลปิด or the like using a CO2 solvent in an subcritical state.
5 [0066]
The ไมโครแอลจี of the จีนัส ยูกลีนา, the วิธีเพื่อผลิต
โพลีแซคคาไรด์, and the วิธีเพื่อผลิต an สารประกอบอินทรีย์ according
to the aforementioned embodiments are as exemplified above. However, the
การประดิษฐ์นี้ is not limited to the ไมโครแอลจี of the จีนัส ยูกลีนา, the 10 วิธีเพื่อผลิต โพลีแซคคาไรด์, and the วิธีเพื่อผลิต an organic
compound exemplified above.
Further, it is also possible to employ various embodiments that are
commonly used in ไมโครแอลจี of the จีนัส ยูกลีนา, a วิธีเพื่อผลิต
โพลีแซคคาไรด์, and a วิธีเพื่อผลิต an สารประกอบอินทรีย์, as long as 15 the effects of the การประดิษฐ์นี้ are not impaired.
[0067]
That is, the การประดิษฐ์นี้ is not limited to the above described
embodiments, and the design can be appropriately modified within the scope
intended by the การประดิษฐ์นี้. The operational advantage of the present 20 การประดิษฐ์ is also not limited to the foregoing embodiments.
The embodiments disclosed herein should be construed in all respects
as illustrative but not limiting. The scope of the การประดิษฐ์นี้ is not
indicated by the foregoing description but by the scope of the ข้อถือสิทธิ. Further,
the scope of the การประดิษฐ์นี้ is intended to include all the modifications 25 equivalent in the sense and the scope to the scope of the ข้อถือสิทธิ.
EXAMPLES
[0068]
Next, the การประดิษฐ์นี้ is described further in detail by way of 30 examples. However, the การประดิษฐ์นี้ is not limited to these examples.
Collection and isolation of ไมโครแอลจี of the จีนัส ยูกลีนา
Lake water collected in lakes and marshes in Nagasaki was inoculated into AF-6 อาหารเพาะเลี้ยง (which will be described below), which was cultured for two months at room temperature while being irradiated with fluorescent
5 light.
Target ไมโครแอลจี in the อาหารเพาะเลี้ยง after the culture were isolated with a micro pipette. The isolated ไมโครแอลจี were cultured in the AF-6
อาหารเพาะเลี้ยง at room temperature while being irradiated with fluorescent light.
10 [0070]
Identification of ไมโครแอลจี of the จีนัส ยูกลีนา
Determination of base sequence
For confirming that the isolated ไมโครแอลจี were the species belonging to the จีนัส ยูกลีนา, the following operations were performed.
15 That is, the base sequence of the 18S rRNA gene of the cultured
ไมโครแอลจี of the จีนัส ยูกลีนา was determined by a DNA sequencer
("CEQ8000", manufactured by Beckman Coulter, Inc.) using a primer set
dedicated to the 18S rRNA gene of the ไมโครแอลจี of the จีนัส ยูกลีนา (Zakrys
et al., 2002, Journal of Phycology 38: 1190-1199). The determined base
20 sequence is shown as Sequence No. 1 in the sequence listing.
Comparison of base sequence
The determined base sequence was compared with the base sequence of
the 18S rRNA gene of known ไมโครแอลจี of the จีนัส ยูกลีนา obtained from
GenBank using the BLAST homology search. Further, a comparison with the 25 known ไมโครแอลจี of the จีนัส ยูกลีนา on the sequence homology matching
degree was made. รูป 1 shows a comparison table of the base sequence of the
18S rRNA gene of the isolated ไมโครแอลจี of the จีนัส ยูกลีนา with the base
sequence of the 18S rRNA gene of the known ไมโครแอลจี of the จีนัส ยูกลีนา.
Further, a molecular phylogenetic tree was constructed by the
30 maximum-likelihood method using a molecular phylogenetic tree drawing
software Mega5 program (Tamura et al., 2011, Mol. Biol. Evol. 28: 2731-2739).
19
รูป 2 shows the phylogenetic tree.
As a result, the ไมโครแอลจี isolated as above were identified to be the
species belonging to the จีนัส ยูกลีนา (ยูกลีนา gracilis Klebs). It should be
noted that Ka, Kb, Na, and Nb of the strain EOD-1 in รูป 2 are symbols
5 denoting test samples of the isolated ไมโครแอลจี. The same result was
obtained when using any test sample.
[0071]
RAPD analysis
Further, for comparison of the isolated ไมโครแอลจี of the จีนัส ยูกลีนา 10 with the known ไมโครแอลจี of the จีนัส ยูกลีนา, the band pattern of the
isolated ไมโครแอลจี of the จีนัส ยูกลีนา and band patterns of 6 strains of the
National Institute for Environmental Studies were obtained by RAPD analysis
(Random Amplified Polymorphic DNA) (Reference Literature: Williams et al.,
(1990) Nucleic Aids Res. 18 (22), 6531-6535).
15 The PCR conditions in the RAPD analysis were as follows.
Sample number: 3
Primer 1: AAATCGGGCTG: RAPD-6, Sequence No. 2 Enzyme: Ex Taq (manufactured by Takara Bio Inc.) Reaction buffer: 50 pL
20 DNA template amount: about 0.5 ng
PCR temperature conditions: as shown in Table 1; specifically, after a treatment at 94°C for one minute, a set of treatments (94°C for one minute, 40°C for 45 seconds, and 72°C for one minute) was repeated 35 times, followed by a treatment at 72°C for 7 minutes.
25 Electrophoresis conditions: 2.5 mass% agarose gel, 100 V, 40 minutes
20
[0072] Table 1
Cycle operation of Temperature Time
PCR (°C)
Denaturation 94 1 minute
Denaturation 94 1 minute
Annealing 40 45 seconds Repeated 35 times
Elongation 72 1 minute
Elongation 72 7 minute
[0073]
5 Compared strains in RAPD analysis
ยูกลีนา gracilis NIES-47 ยูกลีนา gracilis NIES-48 ยูกลีนา gracilis NIES-49 ยูกลีนา gracilis NIES-253
10 ยูกลีนา gracilis NIES-286
ยูกลีนา gracilis NIES-2149 [0074]
Further, while changing the primer, RAPD analysis was performed in the same manner by the PCR.
15 Primer 2: ATCGGGTCCG: RAPD-4, Sequence No. 3
Primer 3: GCGATCCCCA: RAPD-3, Sequence No. 4
The base sequences of the aforementioned primers 2 to 4 are described in Mostafa et al., (2011) Molecules 16, 2598-2608.
[0075]
20 รูป 3A shows the results (band patterns) of RAPD analysis using the
aforementioned primer 1. Further, รูป 3B and รูป 3C show the results of RAPD analysis respectively using the aforementioned primers 2 and 3. It should be noted that Ka and Na of strain EOD-1 in รูป 3A to รูป 3C
respectively correspond to Ka and Na in รูป 2.
25 [0076]
From the results of the RAPD analysis, it has been found that the band
21
patterns of the ไมโครแอลจี of the จีนัส ยูกลีนา isolated as above are different from the band patterns of the known ไมโครแอลจี of the จีนัส ยูกลีนา.
Accordingly, it has been determined that strains of the ไมโครแอลจี of the จีนัส ยูกลีนา isolated as above are different from those of the known ไมโครแอลจี of
5 the จีนัส ยูกลีนา.
Then,
โดยเฉพาะอย่างยิ่งที่วิธีเพื่อผลิตสารประกอบอินทรีย์นี้ศูนย์รวมรวมถึงขั้นตอนการเพาะเลี้ยงดังกล่าวข้างต้นและยังรวมถึงขั้นตอนหนาของการเพิ่มอัตราส่วนของไมโครแอลจีหลังจากที่ถูกเพาะเลี้ยงและขั้นตอนการอบแห้งของการอบแห้งไมโครแอลจีโดยต่อไป
การลดความชื้นในไมโครแอลจีหลังจากขั้นตอนที่หนา ในวิธีเพื่อผลิต
30
สารประกอบอินทรีย์ขั้นตอนหนาและขั้นตอนการอบแห้งไม่จำเป็นต้องจำเป็น.
ขั้นตอนที่หนาสามารถทำได้เช่นโดยใช้ข้นที่พบบ่อย.
[0062]
5 โดยเฉพาะตัวอย่างของข้นประกอบด้วย อุปกรณ์ที่มุ่งไมโครแอลจีโดยการเพิ่มอัตราส่วนของไมโครแอลจีสำหรับตัวอย่างเช่นการใช้ความหนาลอยหนาแรงโน้มถ่วงหนาใช้กรองเมมเบรนหรือหนาเข็มขัด นอกจากการขจัดน้ำออกสามารถนำมาใช้เป็นข้นในการสั่งซื้อที่จะเพิ่มอัตราส่วนของไมโครแอลจี. 10 โดยเฉพาะตัวอย่างของการขจัดน้ำออกรวมถึงการขจัดน้ำสูญญากาศเป็นความดันขจัดน้ำออก(กดกรอง) กดเข็มขัด, สกรู กดที่แรงเหวี่ยงขจัดน้ำออก(สกรูขวดเหล้า) และการขจัดน้ำออกหลายดิสก์. ขั้นตอนที่หนาอาจจะดำเนินการโดยใช้เพียงข้นหรืออาจทำได้โดยใช้ทั้งสองข้นและขจัดน้ำออกขึ้นอยู่กับ 15 การใช้งานของโพลีแซค คาไรด์, ไลปิดโปรตีนหรือชอบที่จะผลิต. [0063] ขั้นตอนการอบแห้งที่สามารถดำเนินการเช่นโดยความร้อนไมโครแอลจีหลังจากขั้นตอนที่หนาหรือวางไมโครแอลจีหลังจากที่หนา ขั้นตอนภายใต้ความกดดันที่ลดลง. 20 [0064] ตั้งแต่ไมโครแอลจีหลังจากที่ขั้นตอนที่หนาหรือไมโครแอลจีหลังจากขั้นตอนการอบแห้งสามารถมีอย่างน้อยหนึ่งของโพลีแซคคาไรด์, ไลปิด, วิตามิน C, วิตามิน E, รงควัตถุและโปรตีนในเซลล์ของพวกเขาสามารถใช้เป็นพวกเขาอยู่ในการใช้งานเช่นอาหาร. 25 นอกจากนี้อย่างน้อยหนึ่งของโพลีแซคคาไรด์, ไลปิด, วิตามินซี, วิตามินอี, รงควัตถุและ โปรตีนเป็นสารสกัดจากไมโครแอลจีในฐานะที่เป็นอินทรีย์สารโดยหนอนบ่อนไส้ไมโครแอลจีหลังจากขั้นตอนที่หนาหรือไมโครแอลจีหลังจากขั้นตอนการอบแห้งที่จะเป็นกระบวนการสกัดที่พบบ่อยตามที่ต้องการ ที่สกัดสารประกอบอินทรีย์สามารถนำมาใช้ในการใช้งานเช่นอาหารดิบ30 วัสดุและเชื้อเพลิง. ตัวอย่างของกระบวนการสกัดที่จะใช้รวมถึงกระบวนการสกัดแยกสารประกอบดังกล่าวอินทรีย์โดยใช้ตัวทำละลายอินทรีย์เช่นเอทานอลและเฮกเซนและขั้นตอนการสกัด ของการสกัดไลดังกล่าวปิดหรือชอบใช้ตัวทำละลาย CO2 ในรัฐ subcritical. 5 [0066] ไมโครแอลจีของจีนัสยูกลีนาที่วิธีเพื่อผลิตโพลีแซคคาไรด์และวิธีเพื่อผลิตสารประกอบอินทรีย์ตามไป embodiments ดังกล่าวข้างต้นจะเป็นตัวอย่างข้างต้น อย่างไรก็ตามการประดิษฐ์นี้ไม่ได้ จำกัด อยู่กับไมโครแอลจีของจีนัสยูกลีนา, 10 วิธีเพื่อผลิตโพลีแซคคาไรด์และวิธีเพื่อผลิตอินทรีย์สารสุดขั้วข้างต้น. ต่อไปก็คือ ยังเป็นไปได้ที่จะจ้าง embodiments ต่างๆที่ใช้ในไมโครแอลจีของจีนัสยูกลีนาเป็นวิธีเพื่อผลิตโพลีแซคคาไรด์และวิธีเพื่อผลิตสารประกอบอินทรีย์ตราบเท่าที่15 ผลกระทบของ การประดิษฐ์นี้จะไม่ได้มีความบกพร่อง. [0067] นั่นคือการประดิษฐ์นี้ไม่ได้ จำกัด อยู่ที่อธิบายไว้ข้างต้นน้าและการออกแบบที่สามารถปรับเปลี่ยนให้เหมาะสมภายในขอบเขตที่ตั้งใจไว้โดยการประดิษฐ์นี้ ข้อได้เปรียบในการดำเนินงานในปัจจุบัน 20 การประดิษฐ์ยังไม่ จำกัด embodiments ที่กล่าวมาแล้ว. embodiments เปิดเผยในที่นี้ควรจะตีความว่าทุกประการเป็นตัวอย่างแต่ไม่ จำกัด ขอบเขตของการประดิษฐ์นี้ไม่ได้ระบุโดยรายละเอียดที่กล่าวมาแล้ว แต่ขอบเขตของข้อถือสิทธิ นอกจากนี้ขอบเขตของการประดิษฐ์นี้ที่มีจุดมุ่งหมายที่จะรวมถึงการปรับเปลี่ยนทั้งหมด 25 เทียบเท่าในความหมายและขอบเขตขอบเขตของข้อถือสิทธิ. ตัวอย่าง[0068] ถัดไปการประดิษฐ์นี้จะอธิบายต่อไปในรายละเอียดโดยวิธี 30 ตัวอย่าง อย่างไรก็ตามการประดิษฐ์นี้ไม่ จำกัด ตัวอย่างเหล่านี้. การเก็บและการแยกของไมโครแอลจีของจีนัสยูกลีนาน้ำทะเลสาบเก็บในทะเลสาบและบึงนางาซากิได้รับเชื้อเข้าไป AF-6 อาหารเพาะเลี้ยง (ซึ่งจะอธิบาย ด้านล่าง) ซึ่งเป็นที่เพาะเลี้ยงเป็นเวลาสองเดือนที่อุณหภูมิห้องในขณะที่ถูกฉายรังสีที่มีการเรืองแสง 5 แสง. เป้าหมายไมโครแอลจีในอาหารเพาะเลี้ยงหลังจากวัฒนธรรมที่แยกกับไมโครปิเปต ที่แยกไมโครแอลจีมาเลี้ยงใน AF-6 อาหารเพาะเลี้ยงที่อุณหภูมิห้องในขณะที่ถูกฉายด้วยแสงนีออน. 10 [0070] บัตรประจำตัวของไมโครแอลจีของจีนัสยูกลีนาการกำหนดลำดับฐานสำหรับการยืนยันว่าแยกไมโครแอลจีเป็นสายพันธุ์ที่อยู่ในจีนัสยูกลีนาที่ดำเนินการต่อไปได้ดำเนินการ. 15 นั่นคือลำดับฐานของยีน 18S rRNA ของการเพาะเลี้ยงไมโครแอลจีของจีนัสยูกลีนาถูกกำหนดโดยซีเควนดีเอ็นเอ("CEQ8000" ผลิตโดย Beckman Coulter, Inc) โดยใช้ชุดไพรเมอร์ที่ทุ่มเทให้กับ18S rRNA ยีนของไมโครแอลจีของจีนัสยูกลีนา (Zakrys et al., 2002 วารสาร Phycology 38 : 1190-1199) ฐานมุ่งมั่นที่20 ลำดับที่แสดงเป็นลำดับที่ 1 ในลำดับรายชื่อ. เปรียบเทียบลำดับฐานลำดับฐานมุ่งมั่นที่ถูกเมื่อเทียบกับลำดับฐานของยีน18S rRNA ที่รู้จักไมโครแอลจีของจีนัสยูกลีนาที่ได้รับจากGenBank ใช้การค้นหาที่คล้ายคลึงกันระเบิด นอกจากนี้การเปรียบเทียบกับ 25 ที่รู้จักกันไมโครแอลจีของจีนัสยูกลีนาลำดับที่คล้ายคลึงกันการจับคู่การศึกษาระดับปริญญาที่ถูกสร้างขึ้น รูปที่ 1 แสดงตารางเปรียบเทียบลำดับฐานของ18S rRNA ยีนที่แยกไมโครแอลจีของจีนัสยูกลีนากับฐานลำดับของยีน18S rRNA ที่รู้จักกันไมโครแอลจีของจีนัสยูกลีนา . นอกจากนี้ต้นไม้สายวิวัฒนาการโมเลกุลถูกสร้างขึ้นโดย30 วิธีโอกาสสูงสุดโดยใช้การวาดภาพต้นไม้สายวิวัฒนาการโมเลกุลซอฟแวร์โปรแกรมMega5 (ทามูระ et al, 2011, Mol Biol Evol 28:.... 2731-2739). 19 รูปที่ 2 แสดงให้เห็นว่า phylogenetic ต้นไม้. ในฐานะที่เป็นผลให้ไมโครแอลจีที่แยกดังกล่าวถูกระบุว่าจะเป็นสายพันธุ์ที่อยู่ในจีนัสยูกลีนา (ยูกลีนา gracilis Klebs) มันควรจะตั้งข้อสังเกตว่ากา Kb นาและ Nb ของสายพันธุ์ EOD-1 ใน 2 รูปเป็นสัญลักษณ์ 5 แสดงถึงตัวอย่างการทดสอบของที่แยกไมโครแอลจี ผลเดียวกันได้เมื่อใช้ตัวอย่างการทดสอบใด ๆ . [0071] การวิเคราะห์ดีเอ็นเอนอกจากนี้สำหรับการเปรียบเทียบของแยกไมโครแอลจีของจีนัสยูกลีนา 10 ที่รู้จักกันไมโครแอลจีของจีนัสยูกลีนาวง รูปแบบของแยกไมโครแอลจีของจีนัสยูกลีนาและรูปแบบวงดนตรี6 สายพันธุ์ของสถาบันแห่งชาติเพื่อการศึกษาด้านสิ่งแวดล้อมที่ได้รับโดยการวิเคราะห์RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) (อ้างอิงวรรณกรรม:. วิลเลียมส์, et al, (1990) . นิวคลีอิกเอดส์ Res 18 (22), 6531-6535). 15 เงื่อนไข PCR ในการวิเคราะห์ดีเอ็นเอมีดังนี้. จำนวนตัวอย่าง: 3 รองพื้น 1: AAATCGGGCTG: RAPD-6, ฉบับที่ 2 ลำดับเอนไซม์: Ex Taq (ผลิตโดย Takara Bio อิงค์) บัฟเฟอร์ปฏิกิริยา: 50 PL 20 จำนวนดีเอ็นเอแม่แบบ: ประมาณ 0.5 ng อุณหภูมิ PCR: ตามที่แสดงในตารางที่ 1; โดยเฉพาะอย่างยิ่งหลังการรักษาที่ 94 องศาเซลเซียสเป็นเวลาหนึ่งนาทีซึ่งเป็นชุดของการรักษา (94 ° C เป็นเวลาหนึ่งนาที, 40 ° C เป็นเวลา 45 วินาทีและ 72 องศาเซลเซียสเป็นเวลาหนึ่งนาที) ซ้ำ 35 ครั้งตามด้วยการรักษาที่ 72 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 7 นาที. 25 เงื่อนไข Electrophoresis: 2.5 มวล% เจล agarose, 100 V, 40 นาที20 [0072] ตารางที่ 1 การดำเนินงานรอบเวลาอุณหภูมิPCR (° C) denaturation 94 1 นาทีdenaturation 94 1 นาทีหลอม40 45 วินาที ทำซ้ำ 35 ครั้งการยืดตัว72 1 นาทีการยืดตัว72 7 นาที[0073] 5 สายพันธุ์เมื่อเทียบในการวิเคราะห์ดีเอ็นเอยูกลีนาgracilis NIES-47 ยูกลีนา gracilis NIES-48 ยูกลีนา gracilis NIES-49 ยูกลีนา gracilis NIES-253 10 ยู กลีนา gracilis NIES-286 ยูกลีนา gracilis NIES-2149 [0074] นอกจากนี้ขณะที่การเปลี่ยนสีรองพื้นการวิเคราะห์ดีเอ็นเอที่ได้ดำเนินการในลักษณะเดียวกันโดยวิธี PCR. 15 ไพรเมอร์ 2: ATCGGGTCCG: RAPD-4, ลำดับที่ 3 รองพื้น 3: GCGATCCCCA: RAPD-3, ลำดับที่ 4.. ลำดับฐานของไพรเมอร์ดังกล่าว 2-4 อธิบายไว้ใน Mostafa, et al, (2011) โมเลกุล 16, 2598-2608 [0075] 20 รูป 3A แสดงผล ( รูปแบบวงดนตรี) ของการวิเคราะห์ดีเอ็นเอโดยใช้ไพรเมอร์ดังกล่าว1. นอกจากรูป 3B และ 3C รูปแสดงผลการวิเคราะห์ดีเอ็นเอตามลำดับโดยใช้ไพรเมอร์ดังกล่าวข้างต้นที่ 2 และ 3 มันควรจะตั้งข้อสังเกตว่ากาและนาความเครียด EOD-1 ในรูป 3A เพื่อรูป 3C ตามลำดับสอดคล้องกับกาและนาในรูป 2. 25 [0076] จากผลการวิเคราะห์ดีเอ็นเอที่จะได้รับพบว่าวง21 รูปแบบของไมโครแอลจีของจีนัสยูกลีนาที่แยกดังกล่าวเป็น ที่แตกต่างจากรูปแบบวงดนตรีที่รู้จักกันไมโครแอลจีของจีนัสยูกลีนา. ดังนั้นจะได้รับการพิจารณาแล้วว่าสายพันธุ์ของไมโครแอลจีของจีนัสยูกลีนาที่แยกดังกล่าวจะแตกต่างจากผู้ที่รู้จักกันไมโคร แอลจีของ5 จีนัสยูกลีนา. แล้ว
การแปล กรุณารอสักครู่..
