- ข้อความ
- ประวัติศาสตร์
IntroductionHuman adenovirus (Ad) i
Introduction
Human adenovirus (Ad) is the most common platform for delivery of therapeutic genes in gene therapy applications, and has been used in approximately 23% of all human clinical trials to date (Ginn et al., 2013). Ad has many advantages that have allowed it to become so widely utilised. Deletion of the Ad early region 1 (E1) renders the vector replication defective and together with additional deletion of the non-essential E3 region provides a relatively large cloning capacity of ~8 kb (Bett et al., 1993). Ad vectors devoid of all viral protein sequences, termed helper-dependent Ad (Palmer and Ng, 2005 and Parks et al., 1996), further increase this cloning limit to ~36 kb (Parks and Graham, 1997). Ad vectors remain predominantly episomal in transduced cells (Harui et al., 1999, Hillgenberg et al., 2001, Jager and Ehrhardt, 2009, Stephen et al., 2010 and Wong et al., 2013), greatly reducing the risk of insertional inactivation or activation of cellular genes. Ad has a relatively good safety profile (Amalfitano and Parks, 2002), although at very high doses Ad can cause acute inflammation and toxicity, which can be lethal (Brunetti-Pierri et al., 2004, Morral et al., 2002 and Raper et al., 2003). Upon systemic delivery in most species, human Ad serotype 5 (the most commonly used subtype) preferentially accumulates in the liver (Guo et al., 1996, Nicol et al., 2004 and Worgall et al., 1997). This preferential uptake in the liver is due in part to the physical architecture of this tissue (Ad becomes trapped in the liver sinusoids and fenestrations (Bernt et al., 2003; Ross and Parks, 2003)), and the rapid scavenging of Ad vectors by Kupffer cells in the liver triggers a robust pro-inflammatory cytokine response (Lieber et al., 1997 and Muruve et al., 1999). A unique mechanism of Ad5 uptake in liver hepatocytes also contributes to Ad-induced inflammation. The Ad5 hexon protein interacts with coagulation factor X which provides a bridging interaction for binding to heparan sulphate proteoglycans expressed on the surface of hepatocytes, allowing internalisation (Alba et al., 2012, Bradshaw et al., 2010, Kalyuzhniy et al., 2008 and Waddington et al., 2008). Detection of internalised Ad-associated factor X by toll-like receptor 4 in the endosome triggers an innate immune response and inflammatory signalling (Doronin et al., 2012). However, Ad vectors containing mutations in the hexon protein that prevent its interaction with factor X still localise to the liver, although uptake by hepatocytes is dramatically reduced (Alba et al., 2010 and Kalyuzhniy et al., 2008). These results suggest that physical constraints, other than receptor binding, contribute significantly to vector biodistribution.
The virion of Ad5 is a non-enveloped icosahedral capsid with a diameter of ~95 nm (for the main “body” of the virion, measured vertex to vertex), and is composed of three major (II, III, and IV) and five minor (IIIa, IVa2, VI, VIII, and IX) polypeptides (Berk, 2007 and San Martin, 2012). Protein IV, more commonly known as fibre, forms trimers that project from the capsid surface at each of the 12 vertices, and is the viral protein predominantly responsible for interacting and binding to the cell surface through the coxsackie–adenovirus receptor (CAR) (Bergelson et al., 1997 and Bergelson et al., 1998). For Ad5, the fibre protein is 37 nm in length (Ruigrok et al., 1990 and van Raaij et al., 1999), thus increasing the overall size of the virus to about ~169 nm. Other human serotypes differ in the length of fibre and the cell surface proteins with which they interact, which can significantly influence the cell types that they preferentially infect (Havenga et al., 2002). For example, the Ad35 fibre protein is only 13 nm in length (for an overall virion size of ~110 nm), and binds CD46 rather than CAR (Gaggar et al., 2003 and Saban et al., 2005). The ability of Ad to infect is intimately tied to its ability to bind to the target cell. Cells with no or low levels of either the primary or secondary Ad5 receptors are transduced at a greatly reduced frequency (Goldman et al., 1996 and Nalbantoglu et al., 1999). CAR is frequently developmentally downregulated, thus reducing Ad infection efficiency of mature tissues such as muscle and neurons (Ahn et al., 2008 and Nalbantoglu et al., 1999). Indeed, numerous groups have improved Ad transduction of a variety of cell types and tissues through introducing protein motifs into the fibre protein that redirect attachment to cell surface receptors prevalent on most cells, such as a poly-lysine motif which allows Ad to bind heparan sulphate proteoglycans (Bramson et al., 2004 and Wickham et al., 1997).
The preferential accumulation of Ad in the liver of treated animals has meant that many of the gene therapy “successes” when using Ad in animal models involve transduction of the liver either to restore a functional deficiency to hepatocytes, or to use this organ as a protein production factory to produce large amounts of secreted protein (Brunetti-Pierri and Ng, 2011). Use of Ad for therapy in other tissues has not been as successful. For example, since Ad does not efficiently extravasate from vasculature (Su et al., 2005), localised injections are required for efficient delivery to skeletal muscle (Quantin et al., 1992), unlike adeno-associated virus-based vectors which can escape circulation and transduce into all muscle groups after systemic delivery (Gregorevic et al., 2004). Even after direct skeletal muscle injection, Ad remains relatively localised and does not disperse within the muscle (Meulenbroek et al., 2004 and Quantin et al., 1992). Thus, improvements in Ad vector design are necessary to improve Ad utility for treating diseases of tissues other than liver.
In this study, we asked whether decreasing the overall size of the Ad vector, through substitution of the native Ad5 fibre with a chimeric fibre containing the shorter shaft region from Ad9 (37 versus 12 nm fibre, respectively) could enhance the ability of Ad to extravasate from the vasculature into surrounding tissues, or improve spread after direct injection in muscle. This reduction in fibre length results in a 30% decrease in the overall diameter of the virus. We also address whether addition of a pK motif on the knob domain of the shortened fibre, to redirect infection to more ubiquitous cell surface receptors, also enhanced vector distribution, relative to vector containing the wildtype Ad5 fibre protein.
Results and discussion
Rationale and viral constructs
Ad-based vectors have a poor ability to extravasate into surrounding tissue after systemic delivery and also a poor ability to disperse beyond the site of injection after localised delivery in most tissues. In part, the inability to spread is due to the relatively large size of the Ad virion, which for Ad5 is approximately 169 nm. For comparison, AAV6, which can effectively spread to all tissues following systemic delivery (Gregorevic et al., 2004), is ~25 nm in diameter. We therefore investigated whether reducing the overall size of the Ad vector, by decreasing the length of the fibre protein, could enhance its dispersion in mice. We generated an Ad vector containing the short Ad9 shaft region of fibre fused to the native Ad5 fibre knob domain (Shayakhmetov and Lieber, 2000), designated Ad5SlacZ, which decreased the overall size of the virus by ~30% relative to a normal Ad5-based vector (Ad5LlacZ) (Fig. 1A). Since the natural receptor for Ad, CAR, is downregulated on many mature tissues, we also designed a derivative of Ad5SlacZ which contained a poly-lysine motif in the HI loop of the knob domain, designated Ad5SpKlacZ. Attachment for this virus occurs through binding to heparan sulphate proteoglycans which are present on the surface of most cells. Ad5SpKlacZ is not ablated for binding to CAR. All of these viruses are deleted of the Ad E1 and E3 regions, and encode the Escherichia coli lacZ gene under regulation by the human cytomegalovirus immediate early enhancer/promoter and bovine growth hormone polyadenylation sequence ( Fig. 1B). These viruses were tested in tissue culture and mice for enhanced uptake and dispersion to a number of specific tissues.
Human adenovirus (Ad) is the most common platform for delivery of therapeutic genes in gene therapy applications, and has been used in approximately 23% of all human clinical trials to date (Ginn et al., 2013). Ad has many advantages that have allowed it to become so widely utilised. Deletion of the Ad early region 1 (E1) renders the vector replication defective and together with additional deletion of the non-essential E3 region provides a relatively large cloning capacity of ~8 kb (Bett et al., 1993). Ad vectors devoid of all viral protein sequences, termed helper-dependent Ad (Palmer and Ng, 2005 and Parks et al., 1996), further increase this cloning limit to ~36 kb (Parks and Graham, 1997). Ad vectors remain predominantly episomal in transduced cells (Harui et al., 1999, Hillgenberg et al., 2001, Jager and Ehrhardt, 2009, Stephen et al., 2010 and Wong et al., 2013), greatly reducing the risk of insertional inactivation or activation of cellular genes. Ad has a relatively good safety profile (Amalfitano and Parks, 2002), although at very high doses Ad can cause acute inflammation and toxicity, which can be lethal (Brunetti-Pierri et al., 2004, Morral et al., 2002 and Raper et al., 2003). Upon systemic delivery in most species, human Ad serotype 5 (the most commonly used subtype) preferentially accumulates in the liver (Guo et al., 1996, Nicol et al., 2004 and Worgall et al., 1997). This preferential uptake in the liver is due in part to the physical architecture of this tissue (Ad becomes trapped in the liver sinusoids and fenestrations (Bernt et al., 2003; Ross and Parks, 2003)), and the rapid scavenging of Ad vectors by Kupffer cells in the liver triggers a robust pro-inflammatory cytokine response (Lieber et al., 1997 and Muruve et al., 1999). A unique mechanism of Ad5 uptake in liver hepatocytes also contributes to Ad-induced inflammation. The Ad5 hexon protein interacts with coagulation factor X which provides a bridging interaction for binding to heparan sulphate proteoglycans expressed on the surface of hepatocytes, allowing internalisation (Alba et al., 2012, Bradshaw et al., 2010, Kalyuzhniy et al., 2008 and Waddington et al., 2008). Detection of internalised Ad-associated factor X by toll-like receptor 4 in the endosome triggers an innate immune response and inflammatory signalling (Doronin et al., 2012). However, Ad vectors containing mutations in the hexon protein that prevent its interaction with factor X still localise to the liver, although uptake by hepatocytes is dramatically reduced (Alba et al., 2010 and Kalyuzhniy et al., 2008). These results suggest that physical constraints, other than receptor binding, contribute significantly to vector biodistribution.
The virion of Ad5 is a non-enveloped icosahedral capsid with a diameter of ~95 nm (for the main “body” of the virion, measured vertex to vertex), and is composed of three major (II, III, and IV) and five minor (IIIa, IVa2, VI, VIII, and IX) polypeptides (Berk, 2007 and San Martin, 2012). Protein IV, more commonly known as fibre, forms trimers that project from the capsid surface at each of the 12 vertices, and is the viral protein predominantly responsible for interacting and binding to the cell surface through the coxsackie–adenovirus receptor (CAR) (Bergelson et al., 1997 and Bergelson et al., 1998). For Ad5, the fibre protein is 37 nm in length (Ruigrok et al., 1990 and van Raaij et al., 1999), thus increasing the overall size of the virus to about ~169 nm. Other human serotypes differ in the length of fibre and the cell surface proteins with which they interact, which can significantly influence the cell types that they preferentially infect (Havenga et al., 2002). For example, the Ad35 fibre protein is only 13 nm in length (for an overall virion size of ~110 nm), and binds CD46 rather than CAR (Gaggar et al., 2003 and Saban et al., 2005). The ability of Ad to infect is intimately tied to its ability to bind to the target cell. Cells with no or low levels of either the primary or secondary Ad5 receptors are transduced at a greatly reduced frequency (Goldman et al., 1996 and Nalbantoglu et al., 1999). CAR is frequently developmentally downregulated, thus reducing Ad infection efficiency of mature tissues such as muscle and neurons (Ahn et al., 2008 and Nalbantoglu et al., 1999). Indeed, numerous groups have improved Ad transduction of a variety of cell types and tissues through introducing protein motifs into the fibre protein that redirect attachment to cell surface receptors prevalent on most cells, such as a poly-lysine motif which allows Ad to bind heparan sulphate proteoglycans (Bramson et al., 2004 and Wickham et al., 1997).
The preferential accumulation of Ad in the liver of treated animals has meant that many of the gene therapy “successes” when using Ad in animal models involve transduction of the liver either to restore a functional deficiency to hepatocytes, or to use this organ as a protein production factory to produce large amounts of secreted protein (Brunetti-Pierri and Ng, 2011). Use of Ad for therapy in other tissues has not been as successful. For example, since Ad does not efficiently extravasate from vasculature (Su et al., 2005), localised injections are required for efficient delivery to skeletal muscle (Quantin et al., 1992), unlike adeno-associated virus-based vectors which can escape circulation and transduce into all muscle groups after systemic delivery (Gregorevic et al., 2004). Even after direct skeletal muscle injection, Ad remains relatively localised and does not disperse within the muscle (Meulenbroek et al., 2004 and Quantin et al., 1992). Thus, improvements in Ad vector design are necessary to improve Ad utility for treating diseases of tissues other than liver.
In this study, we asked whether decreasing the overall size of the Ad vector, through substitution of the native Ad5 fibre with a chimeric fibre containing the shorter shaft region from Ad9 (37 versus 12 nm fibre, respectively) could enhance the ability of Ad to extravasate from the vasculature into surrounding tissues, or improve spread after direct injection in muscle. This reduction in fibre length results in a 30% decrease in the overall diameter of the virus. We also address whether addition of a pK motif on the knob domain of the shortened fibre, to redirect infection to more ubiquitous cell surface receptors, also enhanced vector distribution, relative to vector containing the wildtype Ad5 fibre protein.
Results and discussion
Rationale and viral constructs
Ad-based vectors have a poor ability to extravasate into surrounding tissue after systemic delivery and also a poor ability to disperse beyond the site of injection after localised delivery in most tissues. In part, the inability to spread is due to the relatively large size of the Ad virion, which for Ad5 is approximately 169 nm. For comparison, AAV6, which can effectively spread to all tissues following systemic delivery (Gregorevic et al., 2004), is ~25 nm in diameter. We therefore investigated whether reducing the overall size of the Ad vector, by decreasing the length of the fibre protein, could enhance its dispersion in mice. We generated an Ad vector containing the short Ad9 shaft region of fibre fused to the native Ad5 fibre knob domain (Shayakhmetov and Lieber, 2000), designated Ad5SlacZ, which decreased the overall size of the virus by ~30% relative to a normal Ad5-based vector (Ad5LlacZ) (Fig. 1A). Since the natural receptor for Ad, CAR, is downregulated on many mature tissues, we also designed a derivative of Ad5SlacZ which contained a poly-lysine motif in the HI loop of the knob domain, designated Ad5SpKlacZ. Attachment for this virus occurs through binding to heparan sulphate proteoglycans which are present on the surface of most cells. Ad5SpKlacZ is not ablated for binding to CAR. All of these viruses are deleted of the Ad E1 and E3 regions, and encode the Escherichia coli lacZ gene under regulation by the human cytomegalovirus immediate early enhancer/promoter and bovine growth hormone polyadenylation sequence ( Fig. 1B). These viruses were tested in tissue culture and mice for enhanced uptake and dispersion to a number of specific tissues.
0/5000
แนะนำมนุษย์ adenovirus (Ad) เป็นเวทีใหญ่สำหรับนำส่งยีนบำบัดในยีนบำบัดประยุกต์ และมีการใช้ในมนุษย์คลินิกวัน (Ginn et al., 2013) ประมาณ 23% โฆษณามีข้อดีมากมายที่ได้อนุญาตให้ใช้เป็นอย่างกว้างขวาง ลบโฆษณาก่อนภาค 1 (E1) ทำการจำลองแบบเวกเตอร์เสีย และกับ E3 ไม่จำเป็นเพิ่มเติมลบ ภูมิภาคมีความจุค่อนข้างมาก cloning ของ ~ 8 kb (จำนวนมาก et al., 1993) โฆษณาขึ้นอยู่กับการช่วยเหลือ (พาล์มเมอร์ และ Ng, 2005 และสวนร้อยเอ็ด al., 1996) เรียกว่าเวกเตอร์โฆษณาไร้ลำดับโปรตีนไวรัสทั้งหมด เพิ่มเติม เพิ่มข้อจำกัดนี้ cloning ~ 36 kb (สวนและแกรแฮม 1997) เวกเตอร์โฆษณายังคงเป็น episomal ในเซลล์ transduced (Harui et al., 1999, Hillgenberg และ al., 2001, Jager และ Ehrhardt, 2009, al. วงร้อยเอ็ด 2013 และ Stephen et al., 2010), มากลดความเสี่ยงของการยกเลิกการเรียก insertional หรือเปิดใช้งานของโทรศัพท์มือถือ โฆษณามีโพรไฟล์ความปลอดภัยค่อนข้างดี (Amalfitano และสวนสาธารณะ 2002), แม้ในปริมาณสูงมาก โฆษณาอาจทำให้เกิดการอักเสบเฉียบพลันและความเป็นพิษ ซึ่งยุทธภัณฑ์ (Brunetti Pierri et al., 2004, Morral และ al., 2002 และ Raper et al., 2003) เมื่อจัดระบบในสปีชีส์ส่วนใหญ่ มนุษย์โฆษณา serotype 5 (มักใช้ชนิดย่อย) โน้ตสะสมในตับ (กัว et al., 1996, Nicol et al., 2004 และ Worgall และ al., 1997) ดูดซับนี้ต้องในตับที่มีในส่วนสถาปัตยกรรมทางกายภาพของเนื้อเยื่อนี้ (โฆษณาจะติดอยู่ในตับ sinusoids และ fenestrations (Bernt et al., 2003 รอสส์และสวนสาธารณะ 2003)), และ scavenging อย่างรวดเร็วของเวกเตอร์โฆษณาโดย Kupffer เซลล์ในตับก่อให้เกิดการตอบสนองอย่างไร cytokine pro-อักเสบแข็งแกร่ง (Lieber และ al., 1997 และ Muruve et al., 1999) กลไกของการดูดซับ Ad5 ใน hepatocytes ตับเฉพาะยังสนับสนุนการโฆษณาทำให้เกิดการอักเสบ โปรตีน hexon Ad5 โต้ตอบกับเฟนคูณ X ซึ่งเป็นการโต้ตอบระหว่างกาลสำหรับผูกกับ proteoglycans ซัลเฟต heparan แสดงบนพื้นผิวของ hepatocytes ให้ internalisation (al. Alba ร้อยเอ็ด 2012, Bradshaw et al., 2010, Kalyuzhniy et al., 2008 และ Waddington et al., 2008) ตรวจ internalised สัมพันธ์โฆษณาคูณ X โทรเหมือนตัวรับ 4 ในเอนโดโซมทริกเกอร์การตอบสนองภูมิคุ้มกันโดยธรรมชาติและอักเสบแดง (Doronin et al., 2012) อย่างไรก็ตาม เวกเตอร์การโฆษณาที่ประกอบด้วยการกลายพันธุ์ในโปรตีน hexon ที่ป้องกันการปฏิสัมพันธ์กับปัจจัย X ยังคง localise ตับ แม้ว่าการดูดซับ โดย hepatocytes เป็นอย่างมาก ลดลง (Alba et al., 2010 และ Kalyuzhniy et al., 2008) ผลลัพธ์เหล่านี้แนะนำว่า ข้อจำกัดทางกายภาพ ไม่ใช่ตัวรับผูก มีส่วนร่วมอย่างมีนัยสำคัญเวกเตอร์ biodistributionThe virion of Ad5 is a non-enveloped icosahedral capsid with a diameter of ~95 nm (for the main “body” of the virion, measured vertex to vertex), and is composed of three major (II, III, and IV) and five minor (IIIa, IVa2, VI, VIII, and IX) polypeptides (Berk, 2007 and San Martin, 2012). Protein IV, more commonly known as fibre, forms trimers that project from the capsid surface at each of the 12 vertices, and is the viral protein predominantly responsible for interacting and binding to the cell surface through the coxsackie–adenovirus receptor (CAR) (Bergelson et al., 1997 and Bergelson et al., 1998). For Ad5, the fibre protein is 37 nm in length (Ruigrok et al., 1990 and van Raaij et al., 1999), thus increasing the overall size of the virus to about ~169 nm. Other human serotypes differ in the length of fibre and the cell surface proteins with which they interact, which can significantly influence the cell types that they preferentially infect (Havenga et al., 2002). For example, the Ad35 fibre protein is only 13 nm in length (for an overall virion size of ~110 nm), and binds CD46 rather than CAR (Gaggar et al., 2003 and Saban et al., 2005). The ability of Ad to infect is intimately tied to its ability to bind to the target cell. Cells with no or low levels of either the primary or secondary Ad5 receptors are transduced at a greatly reduced frequency (Goldman et al., 1996 and Nalbantoglu et al., 1999). CAR is frequently developmentally downregulated, thus reducing Ad infection efficiency of mature tissues such as muscle and neurons (Ahn et al., 2008 and Nalbantoglu et al., 1999). Indeed, numerous groups have improved Ad transduction of a variety of cell types and tissues through introducing protein motifs into the fibre protein that redirect attachment to cell surface receptors prevalent on most cells, such as a poly-lysine motif which allows Ad to bind heparan sulphate proteoglycans (Bramson et al., 2004 and Wickham et al., 1997).สะสมต้องของโฆษณาในตับของสัตว์บำบัดมีขึ้น ว่า "สำเร็จ" เมื่อใช้โฆษณาในรูปแบบสัตว์ transduction ของตับ เพื่อคืนค่าการขาดงานให้ hepatocytes หรือ การใช้อวัยวะส่วนนี้เป็นโรงงานผลิตโปรตีนในการผลิตจำนวนมากที่เกี่ยวข้องกับการรักษาด้วยยีนหลาย secreted โปรตีน (Brunetti-Pierri และ Ng, 2011) ใช้สำหรับบำบัดในเนื้อเยื่ออื่น ๆ ของโฆษณายังไม่ประสบความสำเร็จเป็น ตัวอย่าง เนื่องจากโฆษณาไม่มีประสิทธิภาพ extravasate จาก vasculature (Su et al., 2005), ฉีดไหนจำเป็นต้องใช้สำหรับการจัดส่งมีประสิทธิภาพกล้ามเนื้อ (Quantin et al., 1992), อีกต่างจากสัมพันธ์ adeno ไวรัสตามเวกเตอร์ซึ่งสามารถหมุนเวียนการหลบหนี และ transduce เป็นกลุ่มกล้ามเนื้อทั้งหมดหลังจากระบบส่ง (Gregorevic et al., 2004) แม้หลังจากที่ฉีดตรงกล้ามเนื้ออีก โฆษณายังคงค่อนข้างไหน และไม่กระจายภายในกล้ามเนื้อ (Meulenbroek et al., 2004 และ Quantin et al., 1992) ดังนั้น ปรับปรุงในการออกแบบโฆษณาเวกเตอร์จะจำเป็นต้องปรับปรุงโฆษณายูทิลิตี้สำหรับการรักษาโรคของเนื้อเยื่ออื่นนอกเหนือจากตับในการศึกษานี้ เราถามว่า การลดขนาดโดยรวมของโฆษณาเวกเตอร์ ผ่านการทดแทนเส้นใย Ad5 ดั้งเดิมด้วยไฟเบอร์ chimeric ที่ประกอบด้วยภูมิภาคเพลาสั้นจาก Ad9 (37 เมื่อเทียบกับเส้นใย 12 nm ตามลำดับ) สามารถเพิ่มความสามารถในการโฆษณาการ extravasate จาก vasculature เข้าไปในเนื้อเยื่อข้างเคียง หรือปรับปรุงการกระจายหลังฉีดโดยตรงในกล้ามเนื้อได้ ผลยาวไฟเบอร์ 30% ที่ลดลงนี้ลดขนาดโดยรวมของไวรัส เรายังว่านี้คือสาระสำคัญในโดเมนของไฟเบอร์ตัดให้สั้นลง เปลี่ยนเส้นทางการติดเชื้อจะเพิ่มมากขึ้นแพร่หลายเซลล์ receptors ผิว กิ๊ปอินเพิ่มเติมเวกเตอร์กระจาย สัมพันธ์กับเวกเตอร์ที่ประกอบด้วยโปรตีนเส้นใย wildtype Ad5ผลและการสนทนาเหตุผลและโครงสร้างของไวรัสAd-based vectors have a poor ability to extravasate into surrounding tissue after systemic delivery and also a poor ability to disperse beyond the site of injection after localised delivery in most tissues. In part, the inability to spread is due to the relatively large size of the Ad virion, which for Ad5 is approximately 169 nm. For comparison, AAV6, which can effectively spread to all tissues following systemic delivery (Gregorevic et al., 2004), is ~25 nm in diameter. We therefore investigated whether reducing the overall size of the Ad vector, by decreasing the length of the fibre protein, could enhance its dispersion in mice. We generated an Ad vector containing the short Ad9 shaft region of fibre fused to the native Ad5 fibre knob domain (Shayakhmetov and Lieber, 2000), designated Ad5SlacZ, which decreased the overall size of the virus by ~30% relative to a normal Ad5-based vector (Ad5LlacZ) (Fig. 1A). Since the natural receptor for Ad, CAR, is downregulated on many mature tissues, we also designed a derivative of Ad5SlacZ which contained a poly-lysine motif in the HI loop of the knob domain, designated Ad5SpKlacZ. Attachment for this virus occurs through binding to heparan sulphate proteoglycans which are present on the surface of most cells. Ad5SpKlacZ is not ablated for binding to CAR. All of these viruses are deleted of the Ad E1 and E3 regions, and encode the Escherichia coli lacZ gene under regulation by the human cytomegalovirus immediate early enhancer/promoter and bovine growth hormone polyadenylation sequence ( Fig. 1B). These viruses were tested in tissue culture and mice for enhanced uptake and dispersion to a number of specific tissues.
การแปล กรุณารอสักครู่..
บทนำ
มนุษย์ adenovirus (โฆษณา) เป็นแพลตฟอร์มที่พบมากที่สุดสำหรับการจัดส่งของยีนการรักษาในการใช้ยีนบำบัดและได้รับการใช้ในการประมาณ 23% ของการทดลองทางคลินิกของมนุษย์ทั้งหมดจนถึงปัจจุบัน (จินน์ et al., 2013) โฆษณามีข้อดีที่ได้รับอนุญาตให้กลายเป็นที่ใช้กันอย่างแพร่หลาย การลบของภูมิภาค Ad ต้นที่ 1 (E1) ทำให้การจำลองแบบเวกเตอร์ที่มีข้อบกพร่องและร่วมกับการลบที่เพิ่มขึ้นของภูมิภาค E3 ที่ไม่จำเป็นให้ความจุที่โคลนที่ค่อนข้างใหญ่ของ ~ 8 กิโลไบต์ (Bett et al., 1993) เวกเตอร์โฆษณาไร้ลำดับโปรตีนของไวรัสทั้งหมดที่เรียกว่าผู้ช่วยขึ้นอยู่กับโฆษณา (พาลเมอร์และ Ng, 2005 และสวนสาธารณะ et al., 1996) ต่อไปเพิ่มขีด จำกัด โคลนนี้ ~ 36 กิโล (สวนสาธารณะและเกรแฮม, 1997) เวกเตอร์โฆษณายังคงเด่น episomal ในเซลล์ transduced (Harui et al., 1999, Hillgenberg et al., 2001, Jager และ Ehrhardt, 2009, สตีเฟ่น et al., 2010 และวงศ์ et al., 2013) ช่วยลดความเสี่ยงของการแทรก หรือยับยั้งการทำงานของยีนเซลลูลาร์ โฆษณามีความปลอดภัยค่อนข้างดี (Amalfitano และสวนสาธารณะ, 2002) แม้ว่าปริมาณที่สูงมากโฆษณาสามารถทำให้เกิดการอักเสบเฉียบพลันและพิษซึ่งสามารถตาย (Brunetti-Pierri et al., 2004, กระเป๋าสะพาย Rs et al., 2002 และพันธ์ et al., 2003) เมื่อส่งมอบระบบในสายพันธุ์มากที่สุด serotype โฆษณามนุษย์ 5 (ชนิดย่อยที่ใช้บ่อยที่สุด) ชอบสะสมในตับ (Guo et al., 1996, โรล, et al., 2004 และ Worgall et al., 1997) นี้ดูดซึมพิเศษในตับคือเนื่องจากในส่วนที่สถาปัตยกรรมทางกายภาพของเนื้อเยื่อนี้ (โฆษณากลายเป็นติดอยู่ในไซน์ตับและ fenestrations (Bernt, et al, 2003;. รอสส์และสวนสาธารณะ 2003)) และขับอย่างรวดเร็วของเวกเตอร์โฆษณา โดยเซลล์ Kupffer ในตับก่อให้เกิดการตอบสนองไซโตไคน์โปรอักเสบที่แข็งแกร่ง (ลีเบอร์ et al., 1997 และ Muruve et al., 1999) กลไกที่มีเอกลักษณ์ของการดูดซึมในเซลล์ตับ Ad5 ตับยังก่อให้เกิดการอักเสบโฆษณาที่เกิดขึ้น โปรตีน Ad5 HEXON โต้ตอบกับปัจจัยการแข็งตัว X ซึ่งมีการทำงานร่วมกันสำหรับการแก้ผูกพันกับ proteoglycans ซัลเฟต heparan แสดงบนพื้นผิวของเซลล์ตับที่ช่วยให้ internalisation (Alba et al., 2012, Bradshaw et al., 2010, Kalyuzhniy et al., 2008 และ Waddington et al., 2008) การตรวจหา internalized ปัจจัยโฆษณาที่เกี่ยวข้อง X โดยรับโทรเหมือนที่ 4 ใน endosome ก่อให้เกิดการตอบสนองภูมิคุ้มกันโดยธรรมชาติและการส่งสัญญาณการอักเสบ (Doronin et al., 2012) อย่างไรก็ตามเวกเตอร์โฆษณาที่มีการกลายพันธุ์ในโปรตีน HEXON ที่ป้องกันไม่ให้ปฏิสัมพันธ์กับปัจจัย X ยังคง จำกัด วงไปที่ตับแม้ว่าดูดซึมโดยเซลล์ตับจะลดลงอย่างมาก (Alba et al., 2010 และ Kalyuzhniy et al., 2008) ผลการศึกษานี้แสดงให้เห็นว่าข้อ จำกัด ทางกายภาพอื่น ๆ กว่ารับผลผูกพันส่วนร่วมอย่างมีนัยสำคัญเวกเตอร์ biodistribution. virion ของ Ad5 เป็น capsid icosahedral ที่ไม่ได้ห่อหุ้มที่มีเส้นผ่าศูนย์กลางประมาณ 95 นาโนเมตร (สำหรับหลัก "ร่างกาย" ของ virion, จุดสุดยอดวัด จุดสุดยอด) และประกอบด้วยสามที่สำคัญ (ii, iii, iv) และห้าเล็กน้อย (IIIa, IVa2, VI, VIII และ IX) polypeptides (Berk 2007 และซานมาร์ติน, 2012) โปรตีนที่สี่ที่รู้จักกันทั่วไปว่าเป็นเส้นใยแบบฟอร์ม Trimers ที่ฉายภาพจากพื้นผิว capsid ในแต่ละ 12 จุดและเป็นโปรตีนที่ไวรัสส่วนใหญ่รับผิดชอบสำหรับการโต้ตอบและมีผลผูกพันให้กับเซลล์ผิวที่ผ่านการรับ coxsackie-adenovirus (CAR) (Bergelson et al., 1997 และ Bergelson et al., 1998) สำหรับ Ad5 โปรตีนเส้นใยเป็น 37 นาโนเมตรความยาว (Ruigrok et al., 1990 และรถตู้ Raaij et al., 1999) ดังนั้นการเพิ่มขนาดโดยรวมของไวรัสไปประมาณ ~ 169 นาโนเมตร สายพันธุ์ของมนุษย์อื่น ๆ แตกต่างกันในความยาวของเส้นใยและโปรตีนเซลล์ผิวที่พวกเขามีปฏิสัมพันธ์อย่างมีนัยสำคัญจะมีผลต่อเซลล์ชนิดที่พวกเขาติดเชื้อ (Havenga et al., 2002) ตัวอย่างเช่นเส้นใยโปรตีน Ad35 เป็นเพียง 13 นาโนเมตรความยาว (สำหรับขนาด virion โดยรวมของ ~ 110 นาโนเมตร) และผูก CD46 มากกว่าคัน (Gaggar et al., 2003 และบัน et al., 2005) ความสามารถในการโฆษณาที่จะติดเชื้อจะเชื่อมโยงอย่างใกล้ชิดกับความสามารถในการจับกับเซลล์เป้าหมาย เซลล์ที่มีหรือไม่มีอยู่ในระดับต่ำของทั้งผู้รับ Ad5 หลักหรือรองจะถูกเปลี่ยนแปลงที่ความถี่ลดลงอย่างมาก (โกลด์แมน et al., 1996 และ Nalbantoglu et al., 1999) CAR มัก downregulated พัฒนาดังนั้นการลดประสิทธิภาพการโฆษณาการติดเชื้อของเนื้อเยื่อผู้ใหญ่เช่นกล้ามเนื้อและเซลล์ประสาท (Ahn et al., 2008 และ Nalbantoglu et al., 1999) อันที่จริงหลายกลุ่มมีการปรับปรุง transduction โฆษณาของความหลากหลายของประเภทของเซลล์และเนื้อเยื่อที่ผ่านการแนะนำลวดลายโปรตีนเป็นเส้นใยโปรตีนที่เปลี่ยนเส้นทางสิ่งที่แนบมากับตัวรับเซลล์ผิวที่แพร่หลายในเซลล์มากที่สุดเช่นบรรทัดฐานโพลีไลซีนซึ่งจะช่วยให้โฆษณาเพื่อผูก heparan ซัลเฟต proteoglycans (Bramson et al., 2004 และวิคแฮม et al., 1997). การสะสมพิเศษของโฆษณาในตับของสัตว์ที่ได้รับการรักษามีความหมายว่าหลายยีนบำบัด "ความสำเร็จ" เมื่อใช้โฆษณาในรูปแบบสัตว์ที่เกี่ยวข้องกับพลังงานของตับ อย่างใดอย่างหนึ่งที่จะเรียกคืนการขาดทำงานเพื่อเซลล์ตับหรือการใช้อวัยวะนี้เป็นโรงงานผลิตโปรตีนในการผลิตจำนวนมากของโปรตีนที่หลั่ง (Brunetti-Pierri และ Ng, 2011) การใช้โฆษณาสำหรับการรักษาในเนื้อเยื่ออื่น ๆ ที่ยังไม่ได้รับเป็นที่ประสบความสำเร็จ ตัวอย่างเช่นตั้งแต่โฆษณาไม่ได้อย่างมีประสิทธิภาพ extravasate จากเส้นเลือด (ซู et al., 2005), การฉีดที่มีการแปลที่จำเป็นสำหรับการจัดส่งที่มีประสิทธิภาพเพื่อกล้ามเนื้อโครงร่าง (Quantin et al., 1992) ซึ่งแตกต่างจาก adeno ที่เกี่ยวข้องเวกเตอร์ที่ใช้ไวรัสที่สามารถหลบหนี การไหลเวียนและแปลงพลังงานในทุกกลุ่มกล้ามเนื้อหลังการส่งมอบระบบ (Gregorevic et al., 2004) แม้หลังจากการฉีดกล้ามเนื้อโครงร่างโดยตรงโฆษณายังค่อนข้างหน่วงและไม่สลายภายในกล้ามเนื้อ (Meulenbroek et al., 2004 และ Quantin et al., 1992) ดังนั้นการปรับปรุงในการออกแบบโฆษณาเวกเตอร์ที่มีความจำเป็นในการปรับปรุงสาธารณูปโภคโฆษณาสำหรับการรักษาโรคของเนื้อเยื่ออื่น ๆ กว่าตับ. ในการศึกษาครั้งนี้เราถามว่าการลดขนาดโดยรวมของเวกเตอร์โฆษณาผ่านทดแทนเส้นใย Ad5 พื้นเมืองที่มีเส้นใยลูกผสมที่มี ภูมิภาคเพลาสั้นจาก AD9 (37 เมื่อเทียบกับเส้นใย 12 นาโนเมตรตามลำดับ) จะเพิ่มความสามารถของการโฆษณาเพื่อ extravasate จากเส้นเลือดเข้าไปในเนื้อเยื่อโดยรอบหรือปรับปรุงการแพร่กระจายหลังฉีดโดยตรงในกล้ามเนื้อ การลดลงนี้ในผลเส้นใยยาวลดลง 30% ในขนาดเส้นผ่าศูนย์กลางโดยรวมของไวรัส นอกจากนี้เรายังอยู่ไม่ว่าจะเป็นการเพิ่มขึ้นของบรรทัดฐานเภสัชจลนศาสตร์ในโดเมนลูกบิดของเส้นใยสั้นลงเพื่อเปลี่ยนเส้นทางการติดเชื้อที่จะรับเซลล์ผิวที่แพร่หลายมากขึ้นการกระจายเวกเตอร์ยังเพิ่มขึ้นเมื่อเทียบกับเวกเตอร์ที่มี wildtype Ad5 เส้นใยโปรตีน. ผลและการอภิปรายเหตุผลและสร้างไวรัสเวกเตอร์โฆษณาที่ใช้มีความสามารถที่น่าสงสาร extravasate เข้าไปในเนื้อเยื่อรอบหลังการส่งมอบระบบและยังมีความยากจนเกินกว่าที่จะแยกย้ายกันไปบริเวณที่ฉีดหลังคลอดที่มีการแปลในเนื้อเยื่อมากที่สุด ในส่วนที่ไม่สามารถที่จะแพร่กระจายเป็นเนื่องจากขนาดที่ค่อนข้างใหญ่ของ virion โฆษณาซึ่งสำหรับ Ad5 จะอยู่ที่ประมาณ 169 นาโนเมตร สำหรับการเปรียบเทียบ AAV6 ซึ่งสามารถแพร่กระจายได้อย่างมีประสิทธิภาพไปยังเนื้อเยื่อทั้งหมดต่อไปนี้การส่งมอบระบบ (Gregorevic et al., 2004) เป็น ~ 25 นาโนเมตรในเส้นผ่าศูนย์กลาง ดังนั้นเราจึงตรวจสอบว่าการลดขนาดโดยรวมของเวกเตอร์โฆษณาโดยการลดความยาวของเส้นใยโปรตีนที่สามารถเพิ่มประสิทธิภาพการกระจายตัวในหนู เราสร้างเวกเตอร์โฆษณาที่มีภูมิภาคเพลา AD9 สั้นของเส้นใยผสมกับเส้นใย Ad5 โดเมนลูกบิดพื้นเมือง (Shayakhmetov และลีเบอร์, 2000) กำหนด Ad5SlacZ ซึ่งลดลงขนาดโดยรวมของไวรัส ~ 30% เมื่อเทียบกับ Ad5- ปกติ ตามเวกเตอร์ (Ad5LlacZ) (รูป. 1A) ตั้งแต่รับธรรมชาติสำหรับโฆษณา CAR เป็น downregulated ในเนื้อเยื่อผู้ใหญ่จำนวนมากนอกจากนี้เรายังได้รับการออกแบบอนุพันธ์ของ Ad5SlacZ ซึ่งมีบรรทัดฐานโพลีไลซีนในวง HI โดเมนลูกบิดกำหนด Ad5SpKlacZ เอกสารแนบไวรัสนี้เกิดขึ้นผ่านการเชื่อมโยงไป proteoglycans heparan ซัลเฟตซึ่งมีอยู่บนพื้นผิวของเซลล์มากที่สุด Ad5SpKlacZ จะไม่ระเหยสำหรับการผูกกับรถ ทั้งหมดของไวรัสเหล่านี้จะถูกลบออกจากโฆษณา E1 และภูมิภาค E3 และเข้ารหัสยีน Escherichia coli lacZ ภายใต้การควบคุมโดยมนุษย์ cytomegalovirus เพิ่มทันทีต้น / ผู้ก่อการและฮอร์โมนการเจริญเติบโตวัวลำดับ Polyadenylation (รูป. 1B) ไวรัสเหล่านี้ได้รับการทดสอบในการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อและเมาส์สำหรับการดูดซึมที่ดีขึ้นและกระจายไปยังหมายเลขของเนื้อเยื่อที่เฉพาะเจาะจง
มนุษย์ adenovirus (โฆษณา) เป็นแพลตฟอร์มที่พบมากที่สุดสำหรับการจัดส่งของยีนการรักษาในการใช้ยีนบำบัดและได้รับการใช้ในการประมาณ 23% ของการทดลองทางคลินิกของมนุษย์ทั้งหมดจนถึงปัจจุบัน (จินน์ et al., 2013) โฆษณามีข้อดีที่ได้รับอนุญาตให้กลายเป็นที่ใช้กันอย่างแพร่หลาย การลบของภูมิภาค Ad ต้นที่ 1 (E1) ทำให้การจำลองแบบเวกเตอร์ที่มีข้อบกพร่องและร่วมกับการลบที่เพิ่มขึ้นของภูมิภาค E3 ที่ไม่จำเป็นให้ความจุที่โคลนที่ค่อนข้างใหญ่ของ ~ 8 กิโลไบต์ (Bett et al., 1993) เวกเตอร์โฆษณาไร้ลำดับโปรตีนของไวรัสทั้งหมดที่เรียกว่าผู้ช่วยขึ้นอยู่กับโฆษณา (พาลเมอร์และ Ng, 2005 และสวนสาธารณะ et al., 1996) ต่อไปเพิ่มขีด จำกัด โคลนนี้ ~ 36 กิโล (สวนสาธารณะและเกรแฮม, 1997) เวกเตอร์โฆษณายังคงเด่น episomal ในเซลล์ transduced (Harui et al., 1999, Hillgenberg et al., 2001, Jager และ Ehrhardt, 2009, สตีเฟ่น et al., 2010 และวงศ์ et al., 2013) ช่วยลดความเสี่ยงของการแทรก หรือยับยั้งการทำงานของยีนเซลลูลาร์ โฆษณามีความปลอดภัยค่อนข้างดี (Amalfitano และสวนสาธารณะ, 2002) แม้ว่าปริมาณที่สูงมากโฆษณาสามารถทำให้เกิดการอักเสบเฉียบพลันและพิษซึ่งสามารถตาย (Brunetti-Pierri et al., 2004, กระเป๋าสะพาย Rs et al., 2002 และพันธ์ et al., 2003) เมื่อส่งมอบระบบในสายพันธุ์มากที่สุด serotype โฆษณามนุษย์ 5 (ชนิดย่อยที่ใช้บ่อยที่สุด) ชอบสะสมในตับ (Guo et al., 1996, โรล, et al., 2004 และ Worgall et al., 1997) นี้ดูดซึมพิเศษในตับคือเนื่องจากในส่วนที่สถาปัตยกรรมทางกายภาพของเนื้อเยื่อนี้ (โฆษณากลายเป็นติดอยู่ในไซน์ตับและ fenestrations (Bernt, et al, 2003;. รอสส์และสวนสาธารณะ 2003)) และขับอย่างรวดเร็วของเวกเตอร์โฆษณา โดยเซลล์ Kupffer ในตับก่อให้เกิดการตอบสนองไซโตไคน์โปรอักเสบที่แข็งแกร่ง (ลีเบอร์ et al., 1997 และ Muruve et al., 1999) กลไกที่มีเอกลักษณ์ของการดูดซึมในเซลล์ตับ Ad5 ตับยังก่อให้เกิดการอักเสบโฆษณาที่เกิดขึ้น โปรตีน Ad5 HEXON โต้ตอบกับปัจจัยการแข็งตัว X ซึ่งมีการทำงานร่วมกันสำหรับการแก้ผูกพันกับ proteoglycans ซัลเฟต heparan แสดงบนพื้นผิวของเซลล์ตับที่ช่วยให้ internalisation (Alba et al., 2012, Bradshaw et al., 2010, Kalyuzhniy et al., 2008 และ Waddington et al., 2008) การตรวจหา internalized ปัจจัยโฆษณาที่เกี่ยวข้อง X โดยรับโทรเหมือนที่ 4 ใน endosome ก่อให้เกิดการตอบสนองภูมิคุ้มกันโดยธรรมชาติและการส่งสัญญาณการอักเสบ (Doronin et al., 2012) อย่างไรก็ตามเวกเตอร์โฆษณาที่มีการกลายพันธุ์ในโปรตีน HEXON ที่ป้องกันไม่ให้ปฏิสัมพันธ์กับปัจจัย X ยังคง จำกัด วงไปที่ตับแม้ว่าดูดซึมโดยเซลล์ตับจะลดลงอย่างมาก (Alba et al., 2010 และ Kalyuzhniy et al., 2008) ผลการศึกษานี้แสดงให้เห็นว่าข้อ จำกัด ทางกายภาพอื่น ๆ กว่ารับผลผูกพันส่วนร่วมอย่างมีนัยสำคัญเวกเตอร์ biodistribution. virion ของ Ad5 เป็น capsid icosahedral ที่ไม่ได้ห่อหุ้มที่มีเส้นผ่าศูนย์กลางประมาณ 95 นาโนเมตร (สำหรับหลัก "ร่างกาย" ของ virion, จุดสุดยอดวัด จุดสุดยอด) และประกอบด้วยสามที่สำคัญ (ii, iii, iv) และห้าเล็กน้อย (IIIa, IVa2, VI, VIII และ IX) polypeptides (Berk 2007 และซานมาร์ติน, 2012) โปรตีนที่สี่ที่รู้จักกันทั่วไปว่าเป็นเส้นใยแบบฟอร์ม Trimers ที่ฉายภาพจากพื้นผิว capsid ในแต่ละ 12 จุดและเป็นโปรตีนที่ไวรัสส่วนใหญ่รับผิดชอบสำหรับการโต้ตอบและมีผลผูกพันให้กับเซลล์ผิวที่ผ่านการรับ coxsackie-adenovirus (CAR) (Bergelson et al., 1997 และ Bergelson et al., 1998) สำหรับ Ad5 โปรตีนเส้นใยเป็น 37 นาโนเมตรความยาว (Ruigrok et al., 1990 และรถตู้ Raaij et al., 1999) ดังนั้นการเพิ่มขนาดโดยรวมของไวรัสไปประมาณ ~ 169 นาโนเมตร สายพันธุ์ของมนุษย์อื่น ๆ แตกต่างกันในความยาวของเส้นใยและโปรตีนเซลล์ผิวที่พวกเขามีปฏิสัมพันธ์อย่างมีนัยสำคัญจะมีผลต่อเซลล์ชนิดที่พวกเขาติดเชื้อ (Havenga et al., 2002) ตัวอย่างเช่นเส้นใยโปรตีน Ad35 เป็นเพียง 13 นาโนเมตรความยาว (สำหรับขนาด virion โดยรวมของ ~ 110 นาโนเมตร) และผูก CD46 มากกว่าคัน (Gaggar et al., 2003 และบัน et al., 2005) ความสามารถในการโฆษณาที่จะติดเชื้อจะเชื่อมโยงอย่างใกล้ชิดกับความสามารถในการจับกับเซลล์เป้าหมาย เซลล์ที่มีหรือไม่มีอยู่ในระดับต่ำของทั้งผู้รับ Ad5 หลักหรือรองจะถูกเปลี่ยนแปลงที่ความถี่ลดลงอย่างมาก (โกลด์แมน et al., 1996 และ Nalbantoglu et al., 1999) CAR มัก downregulated พัฒนาดังนั้นการลดประสิทธิภาพการโฆษณาการติดเชื้อของเนื้อเยื่อผู้ใหญ่เช่นกล้ามเนื้อและเซลล์ประสาท (Ahn et al., 2008 และ Nalbantoglu et al., 1999) อันที่จริงหลายกลุ่มมีการปรับปรุง transduction โฆษณาของความหลากหลายของประเภทของเซลล์และเนื้อเยื่อที่ผ่านการแนะนำลวดลายโปรตีนเป็นเส้นใยโปรตีนที่เปลี่ยนเส้นทางสิ่งที่แนบมากับตัวรับเซลล์ผิวที่แพร่หลายในเซลล์มากที่สุดเช่นบรรทัดฐานโพลีไลซีนซึ่งจะช่วยให้โฆษณาเพื่อผูก heparan ซัลเฟต proteoglycans (Bramson et al., 2004 และวิคแฮม et al., 1997). การสะสมพิเศษของโฆษณาในตับของสัตว์ที่ได้รับการรักษามีความหมายว่าหลายยีนบำบัด "ความสำเร็จ" เมื่อใช้โฆษณาในรูปแบบสัตว์ที่เกี่ยวข้องกับพลังงานของตับ อย่างใดอย่างหนึ่งที่จะเรียกคืนการขาดทำงานเพื่อเซลล์ตับหรือการใช้อวัยวะนี้เป็นโรงงานผลิตโปรตีนในการผลิตจำนวนมากของโปรตีนที่หลั่ง (Brunetti-Pierri และ Ng, 2011) การใช้โฆษณาสำหรับการรักษาในเนื้อเยื่ออื่น ๆ ที่ยังไม่ได้รับเป็นที่ประสบความสำเร็จ ตัวอย่างเช่นตั้งแต่โฆษณาไม่ได้อย่างมีประสิทธิภาพ extravasate จากเส้นเลือด (ซู et al., 2005), การฉีดที่มีการแปลที่จำเป็นสำหรับการจัดส่งที่มีประสิทธิภาพเพื่อกล้ามเนื้อโครงร่าง (Quantin et al., 1992) ซึ่งแตกต่างจาก adeno ที่เกี่ยวข้องเวกเตอร์ที่ใช้ไวรัสที่สามารถหลบหนี การไหลเวียนและแปลงพลังงานในทุกกลุ่มกล้ามเนื้อหลังการส่งมอบระบบ (Gregorevic et al., 2004) แม้หลังจากการฉีดกล้ามเนื้อโครงร่างโดยตรงโฆษณายังค่อนข้างหน่วงและไม่สลายภายในกล้ามเนื้อ (Meulenbroek et al., 2004 และ Quantin et al., 1992) ดังนั้นการปรับปรุงในการออกแบบโฆษณาเวกเตอร์ที่มีความจำเป็นในการปรับปรุงสาธารณูปโภคโฆษณาสำหรับการรักษาโรคของเนื้อเยื่ออื่น ๆ กว่าตับ. ในการศึกษาครั้งนี้เราถามว่าการลดขนาดโดยรวมของเวกเตอร์โฆษณาผ่านทดแทนเส้นใย Ad5 พื้นเมืองที่มีเส้นใยลูกผสมที่มี ภูมิภาคเพลาสั้นจาก AD9 (37 เมื่อเทียบกับเส้นใย 12 นาโนเมตรตามลำดับ) จะเพิ่มความสามารถของการโฆษณาเพื่อ extravasate จากเส้นเลือดเข้าไปในเนื้อเยื่อโดยรอบหรือปรับปรุงการแพร่กระจายหลังฉีดโดยตรงในกล้ามเนื้อ การลดลงนี้ในผลเส้นใยยาวลดลง 30% ในขนาดเส้นผ่าศูนย์กลางโดยรวมของไวรัส นอกจากนี้เรายังอยู่ไม่ว่าจะเป็นการเพิ่มขึ้นของบรรทัดฐานเภสัชจลนศาสตร์ในโดเมนลูกบิดของเส้นใยสั้นลงเพื่อเปลี่ยนเส้นทางการติดเชื้อที่จะรับเซลล์ผิวที่แพร่หลายมากขึ้นการกระจายเวกเตอร์ยังเพิ่มขึ้นเมื่อเทียบกับเวกเตอร์ที่มี wildtype Ad5 เส้นใยโปรตีน. ผลและการอภิปรายเหตุผลและสร้างไวรัสเวกเตอร์โฆษณาที่ใช้มีความสามารถที่น่าสงสาร extravasate เข้าไปในเนื้อเยื่อรอบหลังการส่งมอบระบบและยังมีความยากจนเกินกว่าที่จะแยกย้ายกันไปบริเวณที่ฉีดหลังคลอดที่มีการแปลในเนื้อเยื่อมากที่สุด ในส่วนที่ไม่สามารถที่จะแพร่กระจายเป็นเนื่องจากขนาดที่ค่อนข้างใหญ่ของ virion โฆษณาซึ่งสำหรับ Ad5 จะอยู่ที่ประมาณ 169 นาโนเมตร สำหรับการเปรียบเทียบ AAV6 ซึ่งสามารถแพร่กระจายได้อย่างมีประสิทธิภาพไปยังเนื้อเยื่อทั้งหมดต่อไปนี้การส่งมอบระบบ (Gregorevic et al., 2004) เป็น ~ 25 นาโนเมตรในเส้นผ่าศูนย์กลาง ดังนั้นเราจึงตรวจสอบว่าการลดขนาดโดยรวมของเวกเตอร์โฆษณาโดยการลดความยาวของเส้นใยโปรตีนที่สามารถเพิ่มประสิทธิภาพการกระจายตัวในหนู เราสร้างเวกเตอร์โฆษณาที่มีภูมิภาคเพลา AD9 สั้นของเส้นใยผสมกับเส้นใย Ad5 โดเมนลูกบิดพื้นเมือง (Shayakhmetov และลีเบอร์, 2000) กำหนด Ad5SlacZ ซึ่งลดลงขนาดโดยรวมของไวรัส ~ 30% เมื่อเทียบกับ Ad5- ปกติ ตามเวกเตอร์ (Ad5LlacZ) (รูป. 1A) ตั้งแต่รับธรรมชาติสำหรับโฆษณา CAR เป็น downregulated ในเนื้อเยื่อผู้ใหญ่จำนวนมากนอกจากนี้เรายังได้รับการออกแบบอนุพันธ์ของ Ad5SlacZ ซึ่งมีบรรทัดฐานโพลีไลซีนในวง HI โดเมนลูกบิดกำหนด Ad5SpKlacZ เอกสารแนบไวรัสนี้เกิดขึ้นผ่านการเชื่อมโยงไป proteoglycans heparan ซัลเฟตซึ่งมีอยู่บนพื้นผิวของเซลล์มากที่สุด Ad5SpKlacZ จะไม่ระเหยสำหรับการผูกกับรถ ทั้งหมดของไวรัสเหล่านี้จะถูกลบออกจากโฆษณา E1 และภูมิภาค E3 และเข้ารหัสยีน Escherichia coli lacZ ภายใต้การควบคุมโดยมนุษย์ cytomegalovirus เพิ่มทันทีต้น / ผู้ก่อการและฮอร์โมนการเจริญเติบโตวัวลำดับ Polyadenylation (รูป. 1B) ไวรัสเหล่านี้ได้รับการทดสอบในการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อและเมาส์สำหรับการดูดซึมที่ดีขึ้นและกระจายไปยังหมายเลขของเนื้อเยื่อที่เฉพาะเจาะจง
การแปล กรุณารอสักครู่..
บทนำ
อะดีโนไวรัสมนุษย์ ( AD ) เป็นแพลตฟอร์มที่พบมากที่สุดสำหรับการใช้ยีนบำบัดในยีนบำบัด และมีการใช้ประมาณ 23% ของการทดลองทางคลินิกในมนุษย์ทั้งหมดวัน ( กินน์ et al . , 2013 ) โฆษณามีข้อดีที่ทำให้มันกลายเป็นที่ใช้กันอย่างแพร่หลาย .ลบโฆษณาก่อนภาค 1 ( E1 ) แสดงผลแบบเวกเตอร์ที่บกพร่องและร่วมกับการลบเพิ่มเติมของไม่จำเป็น E3 เขตมีความจุค่อนข้างมากของยีน ~ 8 KB ( เบตต์ et al . , 1993 ) โฆษณาเวกเตอร์ไร้ทั้งหมดไวรัสโปรตีนลำดับ เรียกว่าผู้ช่วยขึ้นอยู่กับโฆษณา ( Palmer และ ng , 2005 และสวนสาธารณะ et al . , 1996 )เพิ่มนี้ โคลนนิ่ง จำกัด ~ 36 KB ( สวนสาธารณะและเกรแฮม , 1997 ) เวกเตอร์โฆษณายังคง episomal เด่นใน transduced เซลล์ ( harui et al . , 1999 , hillgenberg et al . , 2001 , และ ehrhardt Jager 2009 สตีเฟ่น et al . , 2010 และวง et al . , 2013 ) ช่วยลดความเสี่ยงของ insertional การยับยั้งหรือการกระตุ้นยีนของเซลล์โฆษณามีโปรไฟล์ความปลอดภัยค่อนข้างดี ( amalfitano และสวนสาธารณะ , 2002 ) , แม้ว่าที่สูงมาก ปริมาณโฆษณาสามารถทำให้เกิดการอักเสบเฉียบพลันและพิษซึ่งสามารถตาย ( brunetti pierri et al . , 2004 , morral et al . , 2002 และระบบเปิด et al . , 2003 ) เมื่อส่งมอบระบบในสายพันธุ์มากที่สุด หรือโฆษณาของมนุษย์ 5 ( ส่วนใหญ่นิยมใช้ทั้ง ) preferentially สะสมในตับ ( Guo et al . , 1996 ,นิโคล et al . , 2004 และ worgall et al . , 1997 ) สิทธิพิเศษนี้ใช้ในตับเนื่องจากในส่วนสถาปัตยกรรมทางกายภาพของเนื้อเยื่อนี้ ( โฆษณากลายเป็นติดอยู่ในตับและ sinusoids fenestrations ( เบิร์น et al . , 2003 ; Ross และสวนสาธารณะ , 2546 ) และรวดเร็วการโฆษณาเวกเตอร์โดย kupffer เซลล์ในตับ ก่อให้เกิดการตอบสนองที่แข็งแกร่ง pro-inflammatory ไซโตไคน์ ( ลีเบอร์ et al . ,1997 และ muruve et al . , 1999 ) กลไกที่เป็นเอกลักษณ์ของ ad5 การดูดซึมในเซลล์ตับตับที่มีโฆษณาที่เกิดการอักเสบ การ ad5 Hexon โปรตีนมีปฏิสัมพันธ์กับปัจจัย X ซึ่งมีการเชื่อมโยงแบบปฏิสัมพันธ์สำหรับผูก heparan proteoglycans ซัลเฟตแสดงบนพื้นผิวของเซลล์ตับ ให้ internalisation ( Alba et al . , 2012 , แบรดชอว์ et al . , 2010 , kalyuzhniy et al .2551 และ Waddington et al . , 2008 ) การตรวจหา internalised โฆษณาที่เกี่ยวข้องปัจจัย X โดยโทรเหมือนตัวรับ 4 ในโครโมโซมเรียกการตอบสนองภูมิคุ้มกันโดยกำเนิดและอักเสบสัญญาณ ( doronin et al . , 2012 ) อย่างไรก็ตาม โฆษณาเวกเตอร์ที่มีการกลายพันธุ์ใน Hexon โปรตีนที่ป้องกันการปฏิสัมพันธ์กับปัจจัยเอ็กซ์ยังจํากัดกับตับแม้ว่าการเพิ่มจะลดลงอย่างมาก ( Alba et al . , 2010 และ kalyuzhniy et al . , 2008 ) ผลลัพธ์เหล่านี้ชี้ให้เห็นว่า ข้อจำกัดทางกายภาพ นอกจากรับการมีส่วนร่วมอย่างมากกับ biodistribution เวกเตอร์
ad5 ไวริออนของเป็นไม่คลุม icosahedral เพลี้ยที่มีเส้นผ่าศูนย์กลาง ~ 95 nm ( ตัวหลัก " ของสภาพแวดล้อมการโฮสต์ , วัดยอดถึงยอด )และประกอบด้วยสามหลัก ( II , III และ IV ) และห้าเล็กน้อย ( สามารถ iva2 6 , 8 และ 9 ) โปรตีน ( Berk 2007 และ San Martin , 2012 ) IV โปรตีนที่รู้จักกันมากกว่าปกติเป็นเส้นใย รูปแบบ trimers โครงการจากผิวเปลือกที่แต่ละจุดยอด 12 ,และเป็นไวรัสโปรตีนส่วนใหญ่รับผิดชอบสำหรับการโต้ตอบและผูกกับพื้นผิวเซลล์ผ่านคอกซากี - อะดีโนไวรัส รีเซพเตอร์ ( รถ ) ( bergelson et al . , 1997 และ bergelson et al . , 1998 ) สำหรับ ad5 , เส้นใยโปรตีน 37 nm ในความยาว ( ruigrok et al . , 1990 และรถตู้ raaij et al . , 1999 ) ซึ่งจะเป็นการเพิ่มขนาดโดยรวมของไวรัสประมาณ ~ 169 nm .( มนุษย์อื่น ๆแตกต่างกันในความยาวของเส้นใยและโปรตีนเซลล์ผิวที่พวกเขาโต้ตอบ ซึ่งสามารถมีอิทธิพลต่อเซลล์ชนิดที่พวกเขา preferentially ติดเชื้อ ( havenga et al . , 2002 ) ตัวอย่างเช่น ad35 เส้นใยโปรตีนเพียง 13 นาโนเมตรความยาว ( เป็นขนาดสภาพแวดล้อมการโฮสต์โดยรวมของ ~ 110 nm ) และผูก cd46 มากกว่ารถ ( gaggar et al . , 2003 และสบัน et al . , 2005 )ความสามารถของโฆษณาที่จะติดเชื้อจะเชื่อมโยงอย่างใกล้ชิดกับความสามารถในการผูกกับเซลล์เป้าหมาย เซลล์ที่ไม่มีหรือระดับต่ำของทั้งประถมหรือมัธยม ad5 ตัวรับจะ transduced ที่ลดลงอย่างมาก ความถี่ ( Goldman et al . , 1996 และ nalbantoglu et al . , 1999 ) รถบ่อย downregulated developmentally ,จึงลดการติดเชื้อลงประกาศประสิทธิภาพของผู้ใหญ่ เช่น กล้ามเนื้อ และเซลล์เนื้อเยื่อ ( อาน et al . , 2008 และ nalbantoglu et al . , 1999 ) แน่นอน หลายกลุ่มมีการปรับปรุงโฆษณาผ่านความหลากหลายของชนิดของเซลล์และเนื้อเยื่อที่ผ่านการแนะนำและโปรตีนเป็นโปรตีนใยที่ส่งแนบกับผิวเซลล์ตัวรับในเซลล์ที่แพร่หลายมากที่สุดเช่น โพลี ซีนแม่ลายซึ่งช่วยให้โฆษณาผูก heparan proteoglycans ซัลเฟต ( bramson et al . , 2004 และวิคแฮม et al . , 1997 ) .
การสะสมพิเศษของโฆษณาในตับของสัตว์ถือว่ามีความหมายที่มากมายของยีนบำบัด " ความสำเร็จ " เมื่อใช้โฆษณาในรูปแบบสัตว์เกี่ยวข้องกับพลังงานของ ตับให้เรียกคืนบกพร่องหน้าที่ที่จะเพิ่ม
อะดีโนไวรัสมนุษย์ ( AD ) เป็นแพลตฟอร์มที่พบมากที่สุดสำหรับการใช้ยีนบำบัดในยีนบำบัด และมีการใช้ประมาณ 23% ของการทดลองทางคลินิกในมนุษย์ทั้งหมดวัน ( กินน์ et al . , 2013 ) โฆษณามีข้อดีที่ทำให้มันกลายเป็นที่ใช้กันอย่างแพร่หลาย .ลบโฆษณาก่อนภาค 1 ( E1 ) แสดงผลแบบเวกเตอร์ที่บกพร่องและร่วมกับการลบเพิ่มเติมของไม่จำเป็น E3 เขตมีความจุค่อนข้างมากของยีน ~ 8 KB ( เบตต์ et al . , 1993 ) โฆษณาเวกเตอร์ไร้ทั้งหมดไวรัสโปรตีนลำดับ เรียกว่าผู้ช่วยขึ้นอยู่กับโฆษณา ( Palmer และ ng , 2005 และสวนสาธารณะ et al . , 1996 )เพิ่มนี้ โคลนนิ่ง จำกัด ~ 36 KB ( สวนสาธารณะและเกรแฮม , 1997 ) เวกเตอร์โฆษณายังคง episomal เด่นใน transduced เซลล์ ( harui et al . , 1999 , hillgenberg et al . , 2001 , และ ehrhardt Jager 2009 สตีเฟ่น et al . , 2010 และวง et al . , 2013 ) ช่วยลดความเสี่ยงของ insertional การยับยั้งหรือการกระตุ้นยีนของเซลล์โฆษณามีโปรไฟล์ความปลอดภัยค่อนข้างดี ( amalfitano และสวนสาธารณะ , 2002 ) , แม้ว่าที่สูงมาก ปริมาณโฆษณาสามารถทำให้เกิดการอักเสบเฉียบพลันและพิษซึ่งสามารถตาย ( brunetti pierri et al . , 2004 , morral et al . , 2002 และระบบเปิด et al . , 2003 ) เมื่อส่งมอบระบบในสายพันธุ์มากที่สุด หรือโฆษณาของมนุษย์ 5 ( ส่วนใหญ่นิยมใช้ทั้ง ) preferentially สะสมในตับ ( Guo et al . , 1996 ,นิโคล et al . , 2004 และ worgall et al . , 1997 ) สิทธิพิเศษนี้ใช้ในตับเนื่องจากในส่วนสถาปัตยกรรมทางกายภาพของเนื้อเยื่อนี้ ( โฆษณากลายเป็นติดอยู่ในตับและ sinusoids fenestrations ( เบิร์น et al . , 2003 ; Ross และสวนสาธารณะ , 2546 ) และรวดเร็วการโฆษณาเวกเตอร์โดย kupffer เซลล์ในตับ ก่อให้เกิดการตอบสนองที่แข็งแกร่ง pro-inflammatory ไซโตไคน์ ( ลีเบอร์ et al . ,1997 และ muruve et al . , 1999 ) กลไกที่เป็นเอกลักษณ์ของ ad5 การดูดซึมในเซลล์ตับตับที่มีโฆษณาที่เกิดการอักเสบ การ ad5 Hexon โปรตีนมีปฏิสัมพันธ์กับปัจจัย X ซึ่งมีการเชื่อมโยงแบบปฏิสัมพันธ์สำหรับผูก heparan proteoglycans ซัลเฟตแสดงบนพื้นผิวของเซลล์ตับ ให้ internalisation ( Alba et al . , 2012 , แบรดชอว์ et al . , 2010 , kalyuzhniy et al .2551 และ Waddington et al . , 2008 ) การตรวจหา internalised โฆษณาที่เกี่ยวข้องปัจจัย X โดยโทรเหมือนตัวรับ 4 ในโครโมโซมเรียกการตอบสนองภูมิคุ้มกันโดยกำเนิดและอักเสบสัญญาณ ( doronin et al . , 2012 ) อย่างไรก็ตาม โฆษณาเวกเตอร์ที่มีการกลายพันธุ์ใน Hexon โปรตีนที่ป้องกันการปฏิสัมพันธ์กับปัจจัยเอ็กซ์ยังจํากัดกับตับแม้ว่าการเพิ่มจะลดลงอย่างมาก ( Alba et al . , 2010 และ kalyuzhniy et al . , 2008 ) ผลลัพธ์เหล่านี้ชี้ให้เห็นว่า ข้อจำกัดทางกายภาพ นอกจากรับการมีส่วนร่วมอย่างมากกับ biodistribution เวกเตอร์
ad5 ไวริออนของเป็นไม่คลุม icosahedral เพลี้ยที่มีเส้นผ่าศูนย์กลาง ~ 95 nm ( ตัวหลัก " ของสภาพแวดล้อมการโฮสต์ , วัดยอดถึงยอด )และประกอบด้วยสามหลัก ( II , III และ IV ) และห้าเล็กน้อย ( สามารถ iva2 6 , 8 และ 9 ) โปรตีน ( Berk 2007 และ San Martin , 2012 ) IV โปรตีนที่รู้จักกันมากกว่าปกติเป็นเส้นใย รูปแบบ trimers โครงการจากผิวเปลือกที่แต่ละจุดยอด 12 ,และเป็นไวรัสโปรตีนส่วนใหญ่รับผิดชอบสำหรับการโต้ตอบและผูกกับพื้นผิวเซลล์ผ่านคอกซากี - อะดีโนไวรัส รีเซพเตอร์ ( รถ ) ( bergelson et al . , 1997 และ bergelson et al . , 1998 ) สำหรับ ad5 , เส้นใยโปรตีน 37 nm ในความยาว ( ruigrok et al . , 1990 และรถตู้ raaij et al . , 1999 ) ซึ่งจะเป็นการเพิ่มขนาดโดยรวมของไวรัสประมาณ ~ 169 nm .( มนุษย์อื่น ๆแตกต่างกันในความยาวของเส้นใยและโปรตีนเซลล์ผิวที่พวกเขาโต้ตอบ ซึ่งสามารถมีอิทธิพลต่อเซลล์ชนิดที่พวกเขา preferentially ติดเชื้อ ( havenga et al . , 2002 ) ตัวอย่างเช่น ad35 เส้นใยโปรตีนเพียง 13 นาโนเมตรความยาว ( เป็นขนาดสภาพแวดล้อมการโฮสต์โดยรวมของ ~ 110 nm ) และผูก cd46 มากกว่ารถ ( gaggar et al . , 2003 และสบัน et al . , 2005 )ความสามารถของโฆษณาที่จะติดเชื้อจะเชื่อมโยงอย่างใกล้ชิดกับความสามารถในการผูกกับเซลล์เป้าหมาย เซลล์ที่ไม่มีหรือระดับต่ำของทั้งประถมหรือมัธยม ad5 ตัวรับจะ transduced ที่ลดลงอย่างมาก ความถี่ ( Goldman et al . , 1996 และ nalbantoglu et al . , 1999 ) รถบ่อย downregulated developmentally ,จึงลดการติดเชื้อลงประกาศประสิทธิภาพของผู้ใหญ่ เช่น กล้ามเนื้อ และเซลล์เนื้อเยื่อ ( อาน et al . , 2008 และ nalbantoglu et al . , 1999 ) แน่นอน หลายกลุ่มมีการปรับปรุงโฆษณาผ่านความหลากหลายของชนิดของเซลล์และเนื้อเยื่อที่ผ่านการแนะนำและโปรตีนเป็นโปรตีนใยที่ส่งแนบกับผิวเซลล์ตัวรับในเซลล์ที่แพร่หลายมากที่สุดเช่น โพลี ซีนแม่ลายซึ่งช่วยให้โฆษณาผูก heparan proteoglycans ซัลเฟต ( bramson et al . , 2004 และวิคแฮม et al . , 1997 ) .
การสะสมพิเศษของโฆษณาในตับของสัตว์ถือว่ามีความหมายที่มากมายของยีนบำบัด " ความสำเร็จ " เมื่อใช้โฆษณาในรูปแบบสัตว์เกี่ยวข้องกับพลังงานของ ตับให้เรียกคืนบกพร่องหน้าที่ที่จะเพิ่ม
การแปล กรุณารอสักครู่..
ภาษาอื่น ๆ
การสนับสนุนเครื่องมือแปลภาษา: กรีก, กันนาดา, กาลิเชียน, คลิงออน, คอร์สิกา, คาซัค, คาตาลัน, คินยารวันดา, คีร์กิซ, คุชราต, จอร์เจีย, จีน, จีนดั้งเดิม, ชวา, ชิเชวา, ซามัว, ซีบัวโน, ซุนดา, ซูลู, ญี่ปุ่น, ดัตช์, ตรวจหาภาษา, ตุรกี, ทมิฬ, ทาจิก, ทาทาร์, นอร์เวย์, บอสเนีย, บัลแกเรีย, บาสก์, ปัญจาป, ฝรั่งเศส, พาชตู, ฟริเชียน, ฟินแลนด์, ฟิลิปปินส์, ภาษาอินโดนีเซี, มองโกเลีย, มัลทีส, มาซีโดเนีย, มาราฐี, มาลากาซี, มาลายาลัม, มาเลย์, ม้ง, ยิดดิช, ยูเครน, รัสเซีย, ละติน, ลักเซมเบิร์ก, ลัตเวีย, ลาว, ลิทัวเนีย, สวาฮิลี, สวีเดน, สิงหล, สินธี, สเปน, สโลวัก, สโลวีเนีย, อังกฤษ, อัมฮาริก, อาร์เซอร์ไบจัน, อาร์เมเนีย, อาหรับ, อิกโบ, อิตาลี, อุยกูร์, อุสเบกิสถาน, อูรดู, ฮังการี, ฮัวซา, ฮาวาย, ฮินดี, ฮีบรู, เกลิกสกอต, เกาหลี, เขมร, เคิร์ด, เช็ก, เซอร์เบียน, เซโซโท, เดนมาร์ก, เตลูกู, เติร์กเมน, เนปาล, เบงกอล, เบลารุส, เปอร์เซีย, เมารี, เมียนมา (พม่า), เยอรมัน, เวลส์, เวียดนาม, เอสเปอแรนโต, เอสโทเนีย, เฮติครีโอล, แอฟริกา, แอลเบเนีย, โคซา, โครเอเชีย, โชนา, โซมาลี, โปรตุเกส, โปแลนด์, โยรูบา, โรมาเนีย, โอเดีย (โอริยา), ไทย, ไอซ์แลนด์, ไอร์แลนด์, การแปลภาษา.
- แต่ฉันต้องการถามบางอย่าง คุณต้องการรู้ชื
- しかし私はすべて与えるブレスレットよりかわいい。
- นอกจากนั้นก็จะนิยมนำไปทำบุญถวายพระ
- รัก
- The shotcrete process is truly one of th
- ดิฉันทำงานเป็นผู้ช่วยผู้จัดการเคเอฟซีด้ว
- today i work I went to teach another sch
- 3.3. Effect of volume ratio of internal
- ร้องเพลงคาราโอเกะ
- And i went to pray for you
- ทำไมคุณมองฉันแบบนั้น
- しかし、私はあなたを買ったブレスレット。
- it costs exactly what you planned
- Truth is i didn't expect to get this ett
- ฉันมีเพื่อนอยู่
- ซิงเกิ้ล
- เรียนในมหาวิทยาลัยที่อยู่ในเมือง
- เจอรักดี เล
- อดอล์ฟ ฮิตเลอร์ ชื่อที่ทุกคนรู้จักเขาในฐ
- subsidiary
- formation
- Cost objects
- هاى
- The language used in the questionsIf the
