Amplification was started with an i

Amplification was started with an initial denaturation at 94 °C for
10 min followed by 35 cycles of denaturation at 94 °C for 1 min, annealing
at 55 °C for 1 min and primer extension at 72 °C for 1 minwith a final
extension of 72 °C for 10 min. 5 μL of PCR amplified ITS products was
analysed using 1.5% agarose gel.
2.5.4. RAPD-PCR analysis
The primers OPD18: 5′-GAGAGCCAAC-3′; OPN13: 5′-AGCGTCACTC-
3′; E11: 5′-CTGGCTTGGTGTATGT-3′; OPD-05: 5′-TGAGCGGACA-3′; and
M13: 5′-GAGGGTGGCGGTTCT-3′ (Pulido et al., 2005) were used for
RAPD-PCR to differentiate at strain level.
2.6. Gel electrophoresis
The amplified DNA fragments were separated through gel electrophoresis
by applying 10 μL of each PCR product with 1.5 μL of loading
dye {(6×), DV4371, Promega, USA} into the wells of 1.5% agarose
(V3125, Promega) gel containing 1.5 μL/mL Ethidium Bromide (Etbr)
(H5041, Promega). DNA size markers (RMBD135, Genei; G5711,
Promega) were added as standard for the calculation of size of the
DNA fragments. The gel was run in 0.5× TBE buffer (89 mM/L Tris
(H5131, Promega), 69 mM Boric acid (H5003, Promega), 25 mM
Na2EDTA (H5031, Promega, pH 8.0)) for 2 h at 80 V (Subcell GT, Biorad,
USA) and photographed using gel documentation system (GelDoc FQ,
Biorad, USA).
2.7. 16S rDNA sequence analysis
The sequencing reactions were performed using ABI PRISM 3100
Genetic Analyzers (Applied Biosystems) in both directionswith universal
primers used for amplification and in case of unsuccessful reactions,
internal primers were designed and used by the service providers
(GeNei and MWG, Bangalore, India). The electrophenogram data for
16S rDNA sequence was validated using Chromas 2.33 software
(www.technelysium.com.au). Sequences obtained were matched with
previously published bacterial 16S rDNA sequences available in the
GenBank database using BLAST and the Ribosomal Database Project
(RDP).
2.8. Phylogenetic analysis
The ITS-PCR and RAPD-PCR profiles (banding patterns) were scored
manually and processed using NTSYSpc software version 2.20f for generation
of cluster analysis in a dendrogrambased on the Jaccard Similarity
Coefficient (SJ) and the un-weighed pair group method using
arithmetic averages (UPGMA). To determine the closest known relatives
of the partial 16S rDNA sequences obtained, nucleotide database
searches were performed in NCBI GenBank and Ribosomal Database
Project (RDP) release 10 using BLAST and SEQmatch programmes,
respectively.
2.9. pH
The pH of the samples (10 g)was determined directly using a digital
pH meter (Type 361, Systronics, India) calibrated with standard buffer
solutions (Merck), after homogenisation in 20 mL of carbon-dioxide
free distilled water.
3. Results and discussion
A total of 39 samples of tungrymbai and 43 samples of bekang were
analysed for microbiological populations (Table 1). In both tungrymbai
and bekang, the average population of Bacillus spp. was 8.2 ± 0.1 log
cfu/g, population of LAB was in 4.1 ± 0.1 log cfu/g, load of yeasts was
2.8±0.2 log cfu/g, and total viable countwas 8.9±0.1 log cfu/g, respectively.
Filamentous fungi were not detected in any market sample of
tungrymbai and bekang. The mean pH value of tungrymbai and bekang
was 7.4 ± 0.2 and 7.1 ± 0.1, respectively (Table 1).
Due to the dominance (N107 log cfu/g) of Bacillus in tungrymbai and
bekang, only Bacillus strains were isolated and characterised in this
study. A total of 428 isolates (211 isolates from 39 tungrymbai samples
and 217 isolates from 43 bekang) were selected by their distinct colony
morphologies, their ability to grow in anaerobic agar, hydrolysis of
starch and arginine, catalase, growth at different temperatures, pH
and sugar fermentation (data not shown). The ARDRA patterns of all restriction
enzymes were combined to achieve different ARDRA groups
and randomly selected 48 strains of Bacillus spp. were grouped into 7
groups (Table 2). However, there are certain limitations to this ARDRA
assay, such as the use of universal primers than Bacillus-specific primers
for PCR amplification. Thus the subsequent species identification was
relied on prior genus identification by phenotypic and biochemical
methods. The tentative identification by using API 50 CHB was in good
concordance with those by the genetic identification, that is, the strains
of B. subtilis were discriminated into group I (exception of group VII for
strain BAV:B15), those for B. licheniformis were grouped as group II,
those for B. cereus were discriminated into two groups, groups III and
IV, and those for Lysinibacillus fusiformis were discriminated into two
groups, groups V and VI based on ARDRA (Table 2).
ITS-PCR profile clearly differentiated 7 groups of ARDRA into 16 subgroups
of ITS (data not shown). ITS region was reported for exhibiting a
higher interspecies variation than rRNA geneswithout intraspecies variation
in Bacillus (Ouoba et al., 2004). The ARDRA and ITS-PCR profiles

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

เริ่มต้น ด้วยการแปรสภาพเริ่มต้นที่ 94 ° C สำหรับขยาย10 นาทีตาม ด้วยรอบ 35 ของการแปรสภาพที่ 94 ° C 1 นาที หลอมที่ 55 ° C สำหรับส่วนขยายที่ 1 นาทีและไพรเมอร์ที่ 72 ° C สำหรับ 1 minwith สุดนามสกุล 72 ° c สำหรับ 10 นาที 5 μL ของ PCR ขยายผลิตภัณฑ์มีวิเคราะห์โดยใช้ 1.5% agarose เจล2.5.4 วิเคราะห์ RAPD PCRไพรเมอร์ OPD18: 5 ′-GAGAGCCAAC-3′ OPN13: 5 ′-AGCGTCACTC -3′ E11: 5 ′-CTGGCTTGGTGTATGT-3′ OPD-05: 5 ′-TGAGCGGACA-3′ และM13: ใช้สำหรับ 5 ′-GAGGGTGGCGGTTCT-3′ (Pulido et al. 2005)เทคนิคอาร์เอพีดีเพื่อแบ่งแยกระดับความเครียด2.6. เจอิขยายชิ้นส่วนดีเอ็นเอแยกจากกันผ่านอิเจโดยการใช้ μL 10 ของแต่ละผลิตภัณฑ์ PCR กับ μL 1.5 โหลด{(6×), DV4371, Promega, USA ย้อม} ลงหลุมของ agarose 1.5%(V3125, Promega) เจที่มี 1.5 μL/mL โบรไมด์ Ethidium (Etbr)(H5041, Promega) เครื่องหมายดีเอ็นเอขนาด (RMBD135, Genei G5711Promega) ถูกเพิ่มเป็นมาตรฐานในการคำนวณขนาดของการชิ้นส่วนดีเอ็นเอ เจรันในบัฟเฟอร์ TBE × 0.5 (89 มม./L ทริสเรทติ้ง(H5131, Promega), เป็นกรด (H5003, Promega) 69 มม. 25 มม.(H5031, Promega, pH 8.0) Na2EDTA) สำหรับ 2h ที่ 80 V (Subcell GT, Bioradสหรัฐอเมริกา) และถ่ายภาพโดยใช้ระบบเอกสารเจล (GelDoc FQBiorad สหรัฐอเมริกา)2.7. 16S rDNA ลำดับวิเคราะห์ปฏิกิริยาลำดับดำเนินการใช้ 3100 ปริซึม ABIเครื่องวิเคราะห์ทางพันธุกรรม (ใช้ศาสตร์เชิงชีวภาพ) ในทั้งสอง directionswith สากลไพรเมอร์ที่ใช้ สำหรับขยาย และใน กรณีที่ ปฏิกิริยาสำเร็จไพรเมอร์ภายในถูกออกแบบ และใช้ โดยผู้ให้บริการ(GeNei และ MWG บังกาลอร์ อินเดีย) ข้อมูล electrophenogramลำดับ 16S rDNA ถูกตรวจสอบโดยใช้ซอฟต์แวร์ Chromas 2.33(www.technelysium.com.au) ลำดับที่ได้ถูกจับคู่กับประกาศก่อนหน้านี้ แบคทีเรีย 16S rDNA ลำดับในการโดยใช้ระเบิดและโครงการฐานข้อมูล Ribosomal ฐาน GenBank(RDP)2.8. ผลวิเคราะห์ส่วนกำหนดค่าของ PCR และ RAPD PCR (แถบลาย) ถูกยิงด้วยตนเอง และใช้ NTSYSpc ซอฟต์แวร์เวอร์ชัน 2.20f สำหรับการสร้างการประมวลผลการวิเคราะห์คลัสเตอร์ใน dendrogrambased Jaccard คล้ายคลึงค่าสัมประสิทธิ์ (SJ) และทั้งคู่ยังไม่ได้ชั่งน้ำหนักกลุ่มวิธีการใช้เลขคณิตค่าเฉลี่ย (UPGMA) การตรวจสอบทราบญาติที่ใกล้เคียงของ 16S บางส่วน rDNA ลำดับได้ ฐานข้อมูลนิวคลีโอไทด์ดำเนินการค้นหาใน NCBI GenBank และ Ribosomal ฐานข้อมูลโครงการ (RDP) รุ่น 10 ใช้โปรแกรมระเบิดและ SEQmatchตามลาดับ2.9. pHค่า pH ของตัวอย่าง (10 กรัม) ถูกกำหนดโดยตรงโดยใช้ดิจิตอลวัด pH (ชนิด 361, Systronics อินเดีย) กับบัฟเฟอร์มาตรฐานการปรับเทียบโซลูชั่น (Merck), หลังจาก homogenisation ใน 20 mL ของก๊าซคาร์บอนไดออกไซด์น้ำกลั่นฟรี3. ผล และการอภิปรายมีทั้งหมด 39 ตัวอย่างของ tungrymbai และ bekang 43 ตัวอย่างวิเคราะห์ทางจุลชีววิทยาประชากร (ตาราง 1) ใน tungrymbai ทั้งสองและ bekang ประชากรเฉลี่ยของออกซิเจนบาซิลลัส 8.2 ± 0.1 ล็อกcfu/g ประชากรของ LAB ใน 4.1 ± 0.1 ล็อก cfu/g การโหลดของยีสต์คือ2.8±0.2 cfu/g และ countwas ทำงานได้รวม 8.9±0.1 ล็อก cfu/g ตามลำดับเชื้อราด้ายไม่พบในตัวอย่างการตลาดtungrymbai และ bekang ค่า pH เฉลี่ยของ tungrymbai และ bekangแก้ไข 7.4 ± 0.2 และ 7.1 ± 0.1 ตามลำดับ (ตารางที่ 1)เนื่องจากการปกครอง (N107 ล็อก cfu/g) ของ Bacillus ใน tungrymbai และbekang เฉพาะบาซิลลัสสายพันธุ์แยก และโดดเด่นในที่นี้การศึกษา ทั้งหมด 428 แยก (211 ที่แยกได้จากตัวอย่าง tungrymbai 39และ 217 แยกจาก 43 bekang) ได้รับเลือกจากอาณานิคมของตนแตกต่างกันmorphologies ความสามารถในการเติบโตในอาหารเลี้ยงเชื้อที่ไม่ใช้ออกซิเจน การย่อยสลายของแป้ง และอาร์จินี คา เจริญเติบโตที่แตกต่างกันอุณหภูมิ pHการหมักน้ำตาล (ไม่แสดงข้อมูล) รูปแบบ ARDRA ของข้อจำกัดทั้งหมดเอนไซม์ถูกรวมให้กลุ่ม ARDRA ต่าง ๆและสุ่มเลือก 48 พันธุ์ Bacillus ออกซิเจนที่ถูกแบ่งเป็น 7กลุ่ม (ตารางที่ 2) อย่างไรก็ตาม มีข้อจำกัดบางอย่างใน ARDRA นี้ทดสอบ เช่นการใช้ไพรเมอร์สากลกว่าเชื้อเฉพาะไพรเมอร์สำหรับกระบือ ดังนั้น การระบุสายพันธุ์ต่อมาเป็นพึ่งสกุลก่อนรหัส โดยฟีโนไทป์ และชีวเคมีวิธีการ เป็นการระบุที่แน่นอน โดยใช้ API 50 ประเทศในดีสอดคล้องกับโดยรหัสพันธุกรรม นั่นคือ สายพันธุ์ของ B. subtilis ถูก discriminated ในกลุ่มผม (ยกเว้นของกลุ่ม VII สำหรับสายพันธุ์ BAV:B15), สำหรับ B. licheniformis ถูกจัดกลุ่มเป็นกลุ่ม IIผู้สำหรับ B. cereus เป็น discriminated เป็น 2 กลุ่ม กลุ่ม III และIV และสำหรับ Lysinibacillus fusiformis ถูก discriminated เป็นสองกลุ่ม กลุ่ม V และ VI อิง ARDRA (ตาราง 2)โปรไฟล์ของ PCR 7 กลุ่ม ARDRA เป็นกลุ่มย่อย 16 ที่แตกต่างอย่างชัดเจน(ข้อมูลไม่แสดง) รายงานพื้นที่สำหรับจัดแสดงนิทรรศการการรูปแบบ interspecies สูงกว่ารูปแบบ intraspecies geneswithout rRNAในบาซิลลัส (Ouoba et al. 2004) โปรไฟล์ของ PCR และ ARDRA

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

( เริ่มด้วยการเริ่มต้นที่ 94 ° C ( สำหรับ10 นาที ตามด้วย 35 รอบ 94 ° C ( ที่ 1 นาที การอบอ่อนที่ 55 องศา C เป็นเวลา 1 นาทีที่ 72 ° C ) ไพรเมอร์ 1 minwith ครั้งสุดท้ายส่วนขยายของ 72 ° C 10 นาที 5 μฉันสามารถขยายผลิตภัณฑ์ของ บริษัท คือวิเคราะห์ข้อมูลโดยใช้ร้อยละ 1.5 เจล .2.5.4 . ชื่อเรื่อง การวิเคราะห์ไพรเมอร์ opd18 : 5 ’ - ’ gagagccaac-3 ; opn13 : 5 ’ - agcgtcactc -3 ดูแล ; e11 : 5 ’ - ’ ctggcttggtgtatgt-3 ; opd-05 : 5 ’ - ’ tgagcggaca-3 ; และM13 : 5 ’ - ’ ( gagggtggcggttct-3 pulido et al . , 2005 ) ใช้สำหรับชื่อเรื่องที่แตกต่างในระดับความเครียด2.6 เจลอิเลคโตรโฟเรซีสไพรเจลดีเอ็นเอแยกผ่านโดยการใช้ 10 μ L ของแต่ละผลิตภัณฑ์ PCR กับ 1.5 ลิตรμโหลดสี { 6 × ) dv4371 promega , USA } ในบ่อ 1.5 % ,( v3125 promega , gel ที่มี 1.5 μ L / มลทิเดียมโบรไมด์ ( etbr )( h5041 promega , ) เครื่องหมายดีเอ็นเอ ( ขนาด rmbd135 genei g5711 , ; ,promega ) เพิ่มเป็นมาตรฐานสำหรับการคำนวณขนาดของชิ้นส่วนดีเอ็นเอ เจลใช้ใน 0.5 ×ทีบีบัฟเฟอร์ ( 89 mm / L ทั้งนี้( h5131 promega , ) , 69 มิลลิเมตร กรดบอริก ( h5003 promega , ) , 25 มม.na2edta ( h5031 promega , pH 8.0 ) 2 H 80 V ( subcell biorad GT ,สหรัฐอเมริกา ) และถ่ายภาพโดยใช้ระบบเอกสาร ( geldoc FQ เจล ,biorad , USA )2.7 . การวิเคราะห์ลำดับเบส 16S rDNAการติดตามปฏิกิริยาโดยใช้ปริซึม 3100 อาบีวิเคราะห์ทางพันธุกรรม ( Applied Biosystems ) ทั้งใน directionswith สากลไพรเมอร์ใช้เครื่องขยายเสียงและในกรณีของปฏิกิริยาที่ไม่ประสบความสำเร็จไพรเมอร์ภายในถูกออกแบบและใช้โดยผู้ให้บริการ( genei mwg และ บังกาลอร์ , อินเดีย ) การ electrophenogram ข้อมูลลำดับ 16S rDNA ถูกตรวจสอบโดยใช้ Chromas 2.33 ซอฟแวร์( www.technelysium . com au ) ได้ลำดับถูกจับคู่กับเผยแพร่ก่อนหน้านี้แบคทีเรียลำดับ 16S rDNA ที่มีอยู่ในฐานข้อมูลขนาดการใช้ระเบิดและโครงการฐานข้อมูลไรโบโซมอล( เพลง )2.8 . การวิเคราะห์ phylogeneticการ its-pcr โปรไฟล์ ( แถบชื่อเรื่องและรูปแบบ ) คะแนนด้วยตนเองและประมวลผลการใช้ ntsyspc ซอฟแวร์รุ่น 2.20f รุ่นการวิเคราะห์กลุ่มใน dendrogrambased Jaccard บนความเหมือนสัมประสิทธิ์ ( SJ ) และสหประชาชาติ กลุ่มใช้วิธีชั่งคู่ค่าเฉลี่ยเลขคณิต ( UPGMA ) ตรวจสอบใกล้ญาติบางส่วนของลำดับเบส 16S rDNA ได้ , ฐานข้อมูลการค้นหาแสดงใน ncbi พบ Protein และฐานข้อมูลโครงการ ( RDP ) รุ่นที่ 10 การใช้ระเบิดและ seqmatch โปรแกรมตามลำดับ2.9 . อpH ของตัวอย่าง ( 10 กรัม ) ถูกกำหนดโดยตรงด้วยระบบดิจิตอลเครื่องวัด ( ประเภท 361 , systronics อินเดีย ) เทียบกับสารมาตรฐานโซลูชั่น ( Merck ) หลังจากการโฮโมจีไนเซชั่นใน 20 ml ของคาร์บอนไดออกไซด์ฟรีน้ำกลั่น3 . ผลและการอภิปรายจำนวน 39 ตัวอย่าง และตัวอย่างของ bekang tungrymbai 43 คือจำนวนประชากรจุลินทรีย์ ( ตารางที่ 1 ) ทั้งใน tungrymbaiและ bekang จำนวนเฉลี่ยของ Bacillus spp . คือ 8.2 ± 0.1 เข้าสู่ระบบCFU / g จำนวนแล็บใน 4.1 ± 0.1 log CFU / g ยีสต์คือโหลด2.8 ± 0.2 log CFU / g และทั้งหมดได้ countwas 8.9 ± 0.1 log CFU / กรัม ตามลำดับเป็นเชื้อราที่ไม่พบในตลาดใด ๆ ตัวอย่างของและ tungrymbai bekang . ค่าเฉลี่ยและค่า pH tungrymbai bekangคือ 7.4 ± 0.2 และ 7.1 ± 0.1 ตามลำดับ ( ตารางที่ 1 )เนื่องจากการปกครอง ( n107 log CFU / g ) และใน tungrymbai บาซิลลัสbekang , Bacillus สายพันธุ์ที่แยกได้และลักษณะนี้การศึกษา ทั้งหมด 5 สายพันธุ์ ( สายพันธุ์จาก 39 tungrymbai 211 ตัวอย่าง217 ไอโซเลทและจาก 43 bekang ) ถูกเลือกโดยกลุ่มที่แตกต่างกันของพวกเขาลักษณะความสามารถในการเติบโตในการใช้วุ้นแป้งและอาร์จินีน , Catalase , การเจริญเติบโตที่อุณหภูมิที่แตกต่างกันอและน้ำตาล หมัก ( ข้อมูลไม่แสดง ) การ ardra รูปแบบของข้อ จำกัดเอนไซม์รวมเพื่อให้บรรลุกลุ่ม ardra ต่าง ๆสุ่มเลือกและ 48 สายพันธุ์ Bacillus spp . ที่แบ่งออกเป็น 7กลุ่ม ( ตารางที่ 2 ) อย่างไรก็ตาม มีบางข้อ จำกัด ที่จะ ardra นี้( เช่นการใช้ไพรเมอร์รองพื้นเฉพาะในสากลมากกว่าสำหรับเพิ่มขยาย . ดังนั้น ภายหลังการเป็นชนิดอาศัยในการจำแนกสกุลก่อนโดยคุณสมบัติทางชีวเคมีวิธีการ การกำหนดรหัสโดยใช้ API 50 chb อยู่ดีสอดคล้องกับที่ โดยระบุพันธุกรรมคือ สายพันธุ์ของ B . subtilis และจำแนกออกเป็นกลุ่มผม ( ยกเว้น 7 กลุ่มสำหรับbav สายพันธุ์ : b15 ) ที่ B . licheniformis ( 4 ) กลุ่ม 2สำหรับ B . cereus และจำแนกเป็น 2 กลุ่ม คือ กลุ่มที่ 3 และ4 และผู้ lysinibacillus fusiformis และจำแนกออกเป็นสองกลุ่ม , กลุ่มที่ 5 และ 6 ตาม ardra ( ตารางที่ 2 )its-pcr โปรไฟล์ชัดเจนแตกต่างของ ardra 16 กลุ่มย่อย 7 กลุ่มของ ( ข้อมูลไม่แสดง ) ภูมิภาคของรายงานเพื่อแสดงเป็นสูงกว่า interspecies รูปแบบกว่า rRNA geneswithout intraspecies รูปแบบเชื้อ ( ouoba et al . , 2004 ) และที่ ardra its-pcr โปรไฟล์