2. Materials and methodsThirteen St

2. Materials and methods
Thirteen St. John's Wort products were selected including six
capsules, five tablets and two tinctures (Table 1). H. perforatum
plant material was grown from seeds supplied by Chiltern Seeds
(Bortree Stile, Ulverston, Cumbria, LA12 7PB, England) and used
as a positive control. The ITS region of this plant had been
sequenced previously to ensure its identity [7].
DNA extraction was carried out using the Qiagen DNeasy
Plant Mini Kit (Qiagen Inc. CA, USA) with different preparation
methods for the different types of material. Fresh plant material
was measured (0.2 g) and then homogenised manually using a
plastic micro-pestle. Capsules were opened and the contents
emptied into a weighing boat and mixed manually using a
spatula before sampling in order to obtain a representative
sample (0.2 g). This was necessary as capsules contain additional
materials such as diluents, filler material, glidants, lubricants
and stabilisers [14]. Different particle sizes of excipients and
active components can result in a gradient within the capsule,
with smaller fragments settling toward the base and larger ones
toward the top. Non-coated tablets were crushed using a pestle
and mortar before sampling. Coated tablets were broken and
0.2 g of material taken from the middle to ensure the coating
was not included.
For tinctures, an adaptation of the method described by
Novak (2007) [15] was designed. 10 ml of the tincture was
placed in a 25 ml centrifuge tube and 10 ml of 100% (v/v)
ethanol added. The solution was shaken for 5 min and then
centrifuged for 10 min at 8000 rpm. The supernatant was
discarded and 400 μl of the residue was used for the extraction
of DNA.
Polymerase chain reaction was conducted as described in
[7] using both the H. perforatum specific primer pair FO2 and
HRI-S and the more generic ITS1 and ITS4. The specific primers
were selected after extensive testing on H. perforatum accessions
and several other Hypericum species. Four other potential
specific primer pairs were also tested and those selected
verified as the most effective and efficient in terms of specificity
[16]. Distilled water was used as a negative control and DNA
extracted from H. perforatum leaf was used as a positive control.
PCR products were analysed on 100 ml agarose gels made
with 0.5× TBE, and 2 μl SYBR Safe DNA stain (Invitrogen,
Paisley UK). The 80 bp fragments from the primers FO2 and
HRI-S were analysed on 2% (w/v) gels, and the 850 bp ITS
fragments on 1% (w/v) gels. Five μl of each sample was loaded
into the gel, including the BioLine EasyLadder I (BioLine, London
UK). Gels were run at 90 V for 30 min and visualised using a
BioRad Illuminator, ChemiDoc XRS Camera and Quantity One
Software (BioRad, Hertfordshire UK).

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

2. วัสดุและวิธีการเลือกผลิตภัณฑ์ Wort สิบสามเซนต์จอห์นรวมทั้งหกแคปซูล ยาเม็ดห้า และสอง tinctures (ตาราง 1) H. perforatumวัสดุพืชถูกปลูกจากเมล็ดโดยเมล็ด Chiltern(Bortree Stile, Ulverston คัมเบรีย LA12 7PB อังกฤษ) และใช้เป็นตัวควบคุมที่เป็นค่าบวก ภูมิภาคของของโรงงานนี้ได้เรียงลำดับก่อนหน้านี้เพื่อให้ข้อมูลประจำตัว [7]สกัดดีเอ็นเอดำเนินการโดยใช้ Qiagen DNeasyพืชชุดมินิ (CA Qiagen Inc., USA) ด้วยการเตรียมการต่าง ๆวิธีการสำหรับชนิดของวัสดุ วัสดุพืชสดเป็นวัด (0.2 กรัม) แล้ว นี้ด้วยตนเองโดยใช้การไมโครพลาสติกสาก เปิดแคปซูล และเนื้อหาอบเป็นเรือชั่งน้ำหนัก และผสมโดยใช้การคนก่อนสุ่มตัวอย่างเพื่อให้ได้ตัวแทนตัวอย่าง (0.2 กรัม) จำเป็นแคปซูลประกอบด้วยเพิ่มเติมเป็นวัสดุตัว วัสดุฟิลเลอร์ glidants น้ำมันหล่อลื่นและบังคับ [14] ขนาดอนุภาคต่าง ๆ ของสาร และส่วนที่ใช้งานสามารถส่งผลให้การไล่ระดับสีภายในแคปซูลมีชิ้นส่วนเล็กที่ชำระไปฐาน และมีขนาดใหญ่ไปด้านบน เม็ดเคลือบไม่ถูกบดโดยใช้ครกและปูนก่อนสุ่มตัวอย่าง เม็ดเคลือบที่ไม่ และ0.2 กรัมของวัสดุที่นำมาจากตรงกลางเพื่อให้การเคลือบไม่รวมสำหรับ tinctures การปรับตัวของวิธีอธิบายโนวัคในฮวาร์ (2007) [15] ได้รับการออกแบบ ถูก 10 มล.ทิงเจอร์วางลง ในหลอดหมุนเหวี่ยง 25 มล. และ 10 มล. 100% (v/v)เพิ่มเอทานอล การแก้ปัญหาถูกเขย่า 5 นาที จากนั้นเหวี่ยงสำหรับ 10 นาทีที่ 8000 รอบต่อนาที Supernatant ถูกใช้การสกัดทิ้ง และ 400 μl กับกากของดีเอ็นเอปฏิกิริยาลูกโซ่พอลิเมอเรสดำเนินการตามที่อธิบายไว้ใน[7] ใช้ทั้ง H. perforatum รองพื้นเฉพาะคู่ FO2 และHRI S และทั่ว ITS1 และ ITS4 ไพรเมอร์เฉพาะเลือกจากผลการทดสอบบน H. perforatum accessionsและหยาบกร้านอื่น ๆ หลายสายพันธุ์ 4 ศักยภาพอื่น ๆรองพื้นเฉพาะคู่ยังทดสอบและผู้เลือกตรวจสอบมีประสิทธิภาพมากที่สุด และมีประสิทธิภาพในแง่ของความ[16] . Distilled น้ำใช้เป็นตัวควบคุมค่าลบและดีเอ็นเอแยกจาก H. perforatum ใบถูกใช้เป็นตัวบวกผลิตภัณฑ์ PCR ถูกนำมาวิเคราะห์บนเจ agarose 100 มิลลิลิตรทำการกับ 0.5 × TBE, μl 2 สีย้อมดีเอ็นเอปลอดภัย SYBR (Invitrogenสหราชอาณาจักร Paisley) ส่วน bp 80 จากไพรเมอร์ FO2 และHRI S ถูกวิเคราะห์ในเจ 2% (w/v) และ 850 bp ของส่วนบนเจ 1% (w/v) Μl ห้าของแต่ละอย่างถูกโหลดเป็นเจ รวม BioLine EasyLadder ฉัน (BioLine ลอนดอนสหราชอาณาจักร) เจถูกเรียกใช้ที่ 90 V 30 นาที และ visualised โดยใช้การเลขบอก BioRad, ChemiDoc XRS กล้อง และปริมาณหนึ่งซอฟต์แวร์ (BioRad, Hertfordshire UK)

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

2. วัสดุและวิธีการ
ที่สิบสามเซนต์จอห์น Wort ผลิตภัณฑ์ได้รับการคัดเลือกรวมทั้งหก
แคปซูลห้าแท็บเล็ตและสอง tinctures (ตารางที่ 1) เอช perforatum
วัสดุจากพืชปลูกจากเมล็ดที่จัดทำโดยเมล็ดพันธุ์ชิลเทิร์
(Bortree Stile, Ulverston, Cumbria, LA12 7PB อังกฤษ) และใช้
เป็นตัวควบคุมในเชิงบวก ภูมิภาคของพืชชนิดนี้ได้รับการ
จัดลำดับขั้นตอนก่อนหน้านี้เพื่อให้แน่ใจว่าตัวตน [7].
สกัดดีเอ็นเอได้ดำเนินการโดยใช้ Qiagen DNeasy
Kit โรงงานขนาดเล็ก (Qiagen อิงค์ CA, USA) กับการเตรียมที่แตกต่างกัน
วิธีการสำหรับประเภทที่แตกต่างกันของวัสดุ วัสดุจากพืชสด
วัด (0.2 กรัม) แล้ว homogenised ด้วยตนเองโดยใช้
พลาสติกไมโครสาก แคปซูลถูกเปิดและเนื้อหา
การยอบเป็นเรือชั่งน้ำหนักและผสมด้วยตนเองโดยใช้
ไม้พายก่อนการสุ่มตัวอย่างเพื่อที่จะได้เป็นตัวแทน
ของกลุ่มตัวอย่าง (0.2 กรัม) นี้เป็นสิ่งจำเป็นเป็นแคปซูลประกอบด้วยเพิ่มเติม
วัสดุเช่นสารวัสดุบรรจุ glidants หล่อลื่น
และความคงตัว [14] ขนาดอนุภาคที่แตกต่างกันของสารเพิ่มปริมาณและ
ส่วนประกอบที่ใช้งานสามารถส่งผลในการไล่ระดับสีภายในแคปซูลที่
มีชิ้นส่วนขนาดเล็กไปยังปักหลักฐานและคนใหญ่
ไปทางด้านบน แท็บเล็ตแบบไม่เคลือบถูกบดขยี้โดยใช้สาก
และปูนก่อนการสุ่มตัวอย่าง แท็บเล็ตเคลือบถูกทำลายและ
0.2 กรัมนำมาจากตรงกลางเพื่อให้แน่ใจว่าการเคลือบวัสดุที่
ไม่ได้ถูกรวม.
สำหรับ tinctures การปรับวิธีการอธิบายโดย
โนวัค (2007) [15] ได้รับการออกแบบ 10 มิลลิลิตรทิงเจอร์ถูก
วางไว้ในหลอด 25 มล. centrifuge และ 10 มล. 100% (v / v)
เอทานอลเพิ่ม วิธีการแก้ปัญหาถูกเขย่าเป็นเวลา 5 นาทีแล้ว
ปั่นเป็นเวลา 10 นาทีที่ 8000 รอบต่อนาที ใสถูก
ทิ้งและ 400 ไมโครลิตรของสารตกค้างที่ใช้สำหรับการสกัด
ดีเอ็นเอ.
ปฏิกิริยาลูกโซ่โพลีเมอได้ดำเนินการตามที่อธิบายใน
[7] ใช้ทั้งเอช perforatum คู่ไพรเมอร์ที่เฉพาะเจาะจงและ FO2
HRI-S และทั่วไปมากขึ้น ITS1 และ ITS4 . ไพรเมอร์ที่เฉพาะเจาะจง
ได้รับการคัดเลือกหลังจากการทดสอบอย่างกว้างขวางในสายเอช perforatum
และอื่น ๆ อีกหลายชนิด Hypericum ที่อาจเกิดขึ้นอีกสี่
คู่ไพรเมอร์โดยเฉพาะนอกจากนี้ยังได้รับการทดสอบและผู้ที่เลือก
การตรวจสอบว่ามีประสิทธิภาพมากที่สุดและมีประสิทธิภาพในแง่ของความจำเพาะ
[16] น้ำกลั่นได้ถูกใช้เป็นตัวควบคุมเชิงลบและดีเอ็นเอ
ที่สกัดจากใบเอช perforatum ถูกนำมาใช้เป็นตัวควบคุมในเชิงบวก.
ผลิตภัณฑ์พีซีอาร์ถูกนำมาวิเคราะห์ใน 100 มล. เจล agarose ทำ
กับ 0.5 × TBE และ 2 ไมโครลิตร SYBR ดีเอ็นเอคราบปลอดภัย (Invitrogen,
ลายสหราชอาณาจักร ) 80 เศษ bp จากไพรเมอร์ FO2 และ
HRI-S ถูกนำมาวิเคราะห์ในวันที่ 2% (w / v) เจลและ 850 bp ITS
เศษเมื่อวันที่ 1% (w / v) เจล ห้าไมโครลิตรของแต่ละตัวอย่างถูกโหลด
ลงในเจลรวมทั้ง Bioline EasyLadder ฉัน (Bioline ลอนดอน
สหราชอาณาจักร) เจลวิ่งที่ 90 V เป็นเวลา 30 นาทีและมองเห็นการใช้
BioRad กระจ่างกล้อง ChemiDoc XRS และจำนวนหนึ่ง
ซอฟต์แวร์ (BioRad, Hertfordshire สหราชอาณาจักร)