Isolation and partial characterizat

Isolation and partial characterization of P-galactosidase activity produced by a thermotolerant strain of Kluyveromyces marxianus during growth on lactose-containing media
D. Brady, R. Marchant, L. McHale, and A. P. McHale
Biotechnology Group, School of Applied Biological and Chemical Sciences, University of Ulster, Coleraine, Co. Londonderry, Northern Ireland
A thermotolerant yeast strain, Kluyveromyces marxianus IMB3, has previously been shown to be capable of ethanol production following growth on lactose-containing media at 45°C. Here, we demonstrate that the organism is capable of producing inducible P-galactosidase activity in the presence of lactose. The majority of the activiw appears to be cell associated. Enzyme, isolated following disruption of the cells, has been partially characterized and shown to have a K,,, of 5 mM for the substrate o-nitrophenyl-P-o-galactoside, whereas thatfor lactose was found to be 40 mM. The activity was shown to have an optimal operating temperature of 50°C. although the half-life of the enzyme was shown to be 37”C. It has been suggested that the use of whey concentrates would be expected to overcome problems associated with low con- centrations of lactose2; however, this causes problems as- sociated with lactose intolerance of previously used strains of Kluyveromyces marxianus.3 Hence, there is a require- ment for yeast strains capable of functioning at elevated temperatures. As a result of continuous ethanol recovery from whey fermentations at elevated temperatures, the re- quirement for concentration of whey preparations would be negated. A series of thermotolerant strains of K. marxianus have been isolated,4 and one of those strains, IMB3, has been reported to be capable of ethanol production at 45°C during growth on glucose, cellobiose,5 sucrose,6 and lactose- containing media.’ With respect to growth on lactose-
Enzyme and Microbial Technology 17:69&699, 1995 0 1995 by Elsevier Science Inc. 655 Avenue of the Americas, New York, NY 10010
0141-0229/95/$10.00 SSDI 0141-0229(94)00115-8
P-Galactosidase activity production: 0. Brady et al.
Gels were transferred to a UV transilluminator for visualization and photography.
containing media, the organism produced significant quan- tities of ethanol, although conversion was somewhat lim- ited, even though the organism was shown to produce a cell-associated P-galactosidase activity (EC 3.2.1.23). ’ It was shown during the study that supplementation of the medium with enzyme derived from homogenized cells of K. marxianus IMB3 resulted in increased ethanol production from lactose, and the limitation in ethanol production in unsupplemented media was postulated to result from inac- tivation of the exogenously added enzyme at 45°C. In this study we describe the isolation of the P-galactosidase ac- tivity from K. marxianus IMB3 grown on lactose- containing media at 45”C, and report on the partial charac- terization of that activity.
Materials and methods Growth of microorganism
Kluyveromyces marxianus IMB3 was maintained on malt extract agar at 45°C. The organism was grown in submerged culture in shake-flasks containing yeast growth medium as described previ- 0us1y,~ except that sucrose was replaced by lactose [2% (w/v)]. Flasks were incubated in an orbital shaker at 45°C.
Extraction of P-galactosidase
Cells were harvested by centrifugation at 36 h and washed in 0.1 M sodium phosphate buffer, pH 7.0. Cells were homogenized in 0.1 M sodium phosphate buffer, pH 7.0, using a Braun homoge- nizer together with glass beads as described previously.’ Homoge- nates were clarified by centrifugation at 10,000 g for 30 mins and concentrated by passage through a 100,000 KDa cutoff ultrafiltra- tion membrane. The extract was stored at - 20°C.
@Galactosidase assay
Activity was determined by assay at 30°C using the substrate o-ni- trophenyl-P-D-galactoside in 50 mM sodium phosphate buffer, pH 7.0. Enzyme activity is expressed as kmoles a-nitrophenol pro- duced per minute per milliliter of sample. Protein concentration was determined using a previously described method.8 Using lac- tose as substrate, reactions consisted of the relevant concentration of substrate in 50 mu sodium phosphate buffer, pH 7.0. Assays were performed at 3O”C, after which the concentration of glucose produced was determined using the glucose oxidase-peroxidase kit produced by Boehringer Mannheim, GmbH (Germany) in ac- cordance with the manufacturer’s instructions.
Nondenaturing pofyacrylamide gradient gel electrophoresis
Polyacrylamide gradient gel electrophoresis (PAGGE) was per- formed essentially as described previously.9 Electrophoresis was carried out using 4-15% gels at 200 V for IO min following application of the sample. Subsequently, running conditions were changed to 150 V and electrophoresis was allowed to continue for 1.5 h.
P-Galactosidase zymogram staining procedure
Gels to be stained were placed in substrate solution (5 mu meth- ylumbelliferyl-P-D-galactoside in 50 mM sodium phosphate buffer, pH 7.0) and incubated for 2 to 5 h at room temperature.
Determination of ethanol
Samples harvested from fermentations were analyzed for ethanol content using a gas chromatograph (GLC 8410; Perkin Elmer) as described previously.6
Results Production of P-galactosidase during growth of K. marxianus IMB3 on glucose and lactose-containing media
The organism was grown on media containing 2% (w/v) lactose and glucose, and samples harvested at various times were analyzed for cell associated P-galactosidase activity. The results are shown in Figure 1. The organism was shown to produce maximum amounts of enzyme at 20 to 25 h, both on glucose- and lactose-containing media. In the case of enzyme production by the organism in glucose-containing media, the amount of enzyme was low but significant. These results suggest that the organism is capable of pro- ducing low, constitutive amounts of activity in the presence of glucose. No activity was detected in extracellular culture supematants. When grown on 2% (w/v) glucose, the organisms pro- duced a maximum concentration of 8.5 g l- 1 ethanol (Fig- ure 2), which represented 83% of the maximum theoretical yield. When the organism was grown on media containing 2% (w/v) lactose, the maximum amount of ethanol pro- duced was found to be 4 g l-l, which represented 39% of the maximum theoretical yield. In view of the latter finding we decided to isolate and further characterize the P-galac- tosidase activity produced by the organism during growth on lactose-containing media.
Figure 1 Production of p-galactosidase activity during growth of Kluyveromyces marxianus IMB3 on glucose (0) and lactose (0) containing media. Samples were harvested at the indicated times and cells were homogenized as described in METHODS. Activity is expressed in units per milligram protein.
Enzyme Microb. Technol., 1995, vol. 17, August 697
Papers
7.5
5
2.5
0
TERll’ (“C)
Figure 2 Ethanol production during growth of Kluyveromyces marxianos IMB3 on lactose (0) and glucose (Cl) containing me-
Figure 3 The effect of temperature on cell-associated l3-galac-
dia
tosidase activity produced during growth of Kluyveromyces marxianus IMB3 on lactose-containing media
Partial characterization of f3-galactosidase produced by K. marxianus during growth on lactose-containing media
Discussion
Cells were harvested and the P-galactosidase was isolated as described in METHODS. Partial characterization consisted of examining the temperature and pH optimum of the ac- tivity together with its thermal stability at a variety of tem- peratures. This activity was characterized with respect to its K,,, using both lactose and o-nitrophenyl-P-D-galactoside as substrates. The activity was found to have a relatively broad temperature optimum between 40 and 50°C with activity decreasing relatively rapidly at temperatures above this (Figure 3).
Although, as previously shown,’ the thermotolerant yeast K. marxianus IMB3 is capable of ethanol production on lactose-containing media at 45”C, the level of ethanol pro-
We found that whereas the activity was stable for at least 7 h at 3O”C, it had half-lives of 15 and 5 min at 45 and 5O”C, respectively. The activity was shown to have a relatively sharp pH profile that peaked at pH 7.5. The activity was also shown to e

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

แยกและสมบัติบางส่วนของ P-galactosidase กิจกรรมผลิต โดยต้องใช้ thermotolerant ของ Kluyveromyces marxianus ในระหว่างการเจริญเติบโตบนประกอบด้วยแล็กโทสสื่อ
D. เบรดี้ R. Marchant, L. McHale และ A. P. McHale
กลุ่มเทคโนโลยีชีวภาพ โรงเรียนของใช้ และชีวภาพเคมี วิทยา มหาวิทยาลัยอัลสเตอร์ Coleraine รี่จำกัด ไอร์แลนด์เหนือ
ต้องใช้ยีสต์ thermotolerant แสดง Kluyveromyces marxianus IMB3 สามารถผลิตเอทานอลต่อเกษตรกรรมประกอบด้วยแล็กโทสก่อนหน้านี้สื่อที่ 45 องศาเซลเซียส ที่นี่ เราแสดงว่า สิ่งมีชีวิตที่มีความสามารถในการผลิตกิจกรรม P-galactosidase inducible ในต่อหน้าของแล็กโทส ส่วนใหญ่ของ activiw ดูเหมือนจะ เป็นเซลล์ที่เกี่ยวข้อง เอนไซม์ แยกต่างหากต่อทรัพยเซลล์ แล้วบางส่วนลักษณะ และแสดงให้ K, 5 มม.สำหรับพื้นผิว o-nitrophenyl-P-o-galactoside ในขณะที่ thatfor แล็กโทสพบเป็น 40 มม. กิจกรรมที่แสดงให้ได้ 50 องศาเซลเซียสอุณหภูมิทำงานเหมาะสม แม้ว่า half-life ของเอนไซม์ถูกแสดงจะ < 5 นาทีที่อุณหภูมิการ Half-life ของเอนไซม์แยกที่ 4S "C ยีสต์ fermenting อุณหภูมิสูงสุดที่แสดงเป็น 15 นาที เอนไซม์มีเสถียรภาพที่ 30° C สำหรับน้อย 8 h 7.5 pH เหมาะสมได้ เมื่อเราวิเคราะห์ผลใช้ electrophoresis เจลไล่ระดับ nondenaturing polyactyl amide ร่วมกับ zymogram ย้อมสี ด้วย methylumbelltferyl-P-o-galactoside เป็นพื้นผิว รูปแบบแตกต่างกันสองกิจกรรมบ่มนาน observedfollowing กับพื้นผิวได้ ผลการแนะนำที่แม้ว่ายีสต์นี้จะสามารถผลิตเอทานอลที่ 4S " C เอนไซม์ที่เกี่ยวข้องกับผสมกลมกลืนของแล็กโทสไม่ประจำ thermotolerance
คำสำคัญ: Kluyveromyces marxianus thermotolerant เอทานอล แล็กโทส P-galactosidase
แนะนำ
บางครั้ง แล็กโทสในเวย์ได้ถูกรู้จักว่าเป็นพื้นผิวเหมาะสำหรับการผลิตเชื้อเพลิงและใช้เอทานอลผ่านการหมัก ' แปลงที่มีประสิทธิภาพและออกแบบกระบวนการได้ถูกผู้ที่ขัดขวาง โดยข้อเท็จจริงว่า concentra-สเตรชันของแล็กโทสในเวย์ค่อนข้างต่ำ และ yeasts fermenting ค่อนข้างน้อยความสามารถในการย่อยแลคโตสใช้ประโยชน์ เพิ่มทางเลือกทั่วไปโดยใช้สายพันธุ์ดั้งเดิมของ Saccharomyces cerevisiae ร่วมกับ exogenously
ขอให้ดร. McHale เทคโนโลยีชีวภาพ โรงเรียนของใช้ชีวภาพ และ กลุ่มสารเคมี วิทยาศาสตร์ มหาวิทยาลัยรี่อัลสเตอร์ โคล raine, BT52 ISA บริษัท ไอร์แลนด์เหนือได้รับ 29 1994 กรกฎาคม พิมพ์ที่อยู่ ปรับปรุง 8 1994 พฤศจิกายน 18 พฤศจิกายน 1994 ยอมรับ
เอนไซม์รวมสายพันธุ์ของ Kluyveromyces ถึงแม้ว่าเหล่านี้จะไม่สามารถทำงานที่อุณหภูมิ > 37 " c มันได้ถูกแนะนำว่า จะต้องใช้เวย์มุ่งเพื่อเอาชนะปัญหาที่เกี่ยวข้องกับคอน centrations ต่ำของ lactose2 อย่างไรก็ตาม นี้ทำให้ปัญหาเป็น sociated กับแล็กโทสของสายพันธุ์ก่อนหน้านี้ใช้ของ Kluyveromyces marxianus.3 ดังนั้น มีความต้องการติดขัดสำหรับยีสต์สามารถทำงานได้ที่อุณหภูมิสูง จากเอทานอลอย่างต่อเนื่องฟื้นจากการหมักแหนมเวย์ที่อุณหภูมิ quirement ใหม่สำหรับความเข้มข้นของเวย์เตรียมจะเป็น negated ชุดของสายพันธุ์ thermotolerant ของคุณ marxianus ได้แยก 4 และหนึ่งในบรรดาสายพันธุ์ IMB3 มีรายงานว่า สามารถผลิตเอทานอลที่ 45° C ในระหว่างการเจริญเติบโตในกลูโคส cellobiose ซูโครส 5, 6 และแล็กโทส - ประกอบด้วยสื่อ ' เกี่ยวกับการเจริญเติบโตบนแล็กโทส -
เอนไซม์และจุลินทรีย์เทคโนโลยี 17:69&699, 1995 0 1995 โดย Elsevier วิทยาศาสตร์ Inc. 655 ถนนของอเมริกา New York, NY 10010
0141-0229/95/$10.00 SSDI 0141-0229 (94) 00115-8
P-Galactosidase กิจกรรมผลิต: 0 เบรดี้ et al.
เจถูกโอนย้ายไป transilluminator UV สำหรับแสดงภาพประกอบเพลงและการถ่ายภาพ
ประกอบด้วยสื่อ สิ่งมีชีวิตที่ผลิตควน tities สำคัญของเอทานอล แม้ว่าแปลงได้ค่อนข้างริม-ited แม้ว่าสิ่งมีชีวิตที่ถูกแสดงเพื่อสร้างการเชื่อมโยงเซลล์ P-galactosidase กิจกรรม (EC 3.2.1.23) ' มันถูกแสดงในระหว่างการศึกษาว่า ผลแห้งเสริมกลางกับเอนไซม์ที่ได้มาจากคุณ marxianus IMB3 homogenized เป็นกลุ่มเซลล์ในการผลิตเอทานอลที่เพิ่มขึ้นจากการย่อยแลคโตส และข้อจำกัดในการผลิตเอทานอลในสื่อ unsupplemented ได้ postulated เป็นผล inac-tivation ของเอนไซม์ exogenously เพิ่มที่ 45 องศาเซลเซียส ในการศึกษานี้เราอธิบายแยกของ ac-tivity P-galactosidase จากคุณ marxianus IMB3 ปลูกในแล็กโทส - ประกอบด้วยสื่อที่ 45 " C และรายงานเกี่ยวกับ charac-terization บางส่วนของกิจกรรมนั้น
วิธีการเจริญเติบโตของจุลินทรีย์และวัสดุ
marxianus Kluyveromyces IMB3 มีอยู่ในข้าวมอลต์สกัด agar ที่ 45 องศาเซลเซียส สิ่งมีชีวิตที่ถูกปลูกในวัฒนธรรมน้ำท่วมน้ำปั่นที่ประกอบด้วยอาหารเลี้ยงเชื้อยีสต์เป็นอธิบาย previ-0us1y, ~ ยกเว้นว่าซูโครสถูกแทนที่ ด้วยแล็กโทส [2% (w/v)] น้ำถูก incubated ในเชคเกอร์การโคจรที่ 45 องศาเซลเซียส
สกัด P-galactosidase
เซลล์เก็บเกี่ยว โดย centrifugation ที่ 36 h และล้างใน 0.1 M โซเดียมฟอสเฟตบัฟเฟอร์ ค่า pH 7.0 เซลล์ถูก homogenized เป็นกลุ่มใน 01 M โซเดียมฟอสเฟตบัฟเฟอร์ ค่า pH 7.0 ใช้ homoge-nizer เป็น Braun พร้อมลูกปัดแก้วตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ ' Homoge-nates ได้ขึ้ โดย centrifugation ที่ 10000 g 30 นาที และเข้มข้น โดยเส้นทางผ่านเมมเบรน ultrafiltra-สเตรชันตัดยอด KDa 100000 การดึงข้อมูลถูกเก็บไว้ที่ - 20 องศาเซลเซียส ทดสอบ
@Galactosidase
กิจกรรมที่ถูกกำหนด โดยวิเคราะห์ที่ 30° C ใช้พื้นผิว o-ni-trophenyl-P-D-galactoside 50 mM โซเดียมฟอสเฟตบัฟเฟอร์ ค่า pH 7.0 เอนไซม์จะแสดงเป็น kmoles เป็น nitrophenol pro-duced ต่อนาทีละ milliliter ของตัวอย่าง กำหนดความเข้มข้นของโปรตีนโดยใช้ method.8 อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ใช้ tose ลัคเป็นพื้นผิว ปฏิกิริยาประกอบด้วยสมาธิที่เกี่ยวข้องของพื้นผิวในหมู่ 50 โซเดียมฟอสเฟตบัฟเฟอร์ ค่า pH 7.0 Assays ดำเนินที่ 3O "C หลังจากที่ความเข้มข้นของกลูโคสที่ผลิตได้กำหนดใช้ชุด oxidase peroxidase กลูโคสผลิต โดย Boehringer มันน์ไฮม์ GmbH (เยอรมนี) ac-cordance คำแนะนำของผู้ผลิต
Electrophoresis ไล่ระดับสีเจ nondenaturing pofyacrylamide
Polyacrylamide electrophoresis เจลไล่ระดับสี (PAGGE) ถูกต่อ - รูปแบบอธิบายเป็นหลัก previously.9 Electrophoresis ทำออกใช้เจ 4-15% 200 V min IO ต่อแอพลิเคชันของตัวอย่าง ในเวลาต่อมา ใช้เงื่อนไขถูกเปลี่ยน 150 V และ electrophoresis ได้รับอนุญาตให้ต่อ 1.5 h.
กระบวนการย้อมสี zymogram P-Galactosidase
เจจะมีสีอยู่ในพื้นผิวโซลูชัน (หมู่ที่ 5 จาก-ylumbelliferyl-P-D-galactoside ใน 50 mM โซเดียมฟอสเฟตบัฟเฟอร์ ค่า pH 7.0) และ incubated สำหรับ 2-5 h ที่อุณหภูมิห้อง
ความมุ่งมั่นของเอทานอล
ตัวอย่างเก็บเกี่ยวผลผลิตจากการหมักแหนมได้วิเคราะห์เนื้อหาเอทานอลโดยใช้ chromatograph ก๊าซ (GLC 8410 เพอร์เอลเมอ) เป็น previously.6 อธิบาย
ผลิตผลของ P-galactosidase ในระหว่างการเจริญเติบโตของคุณ marxianus IMB3 กลูโคสและแล็กโทสประกอบด้วยสื่อ
สิ่งมีชีวิตที่ถูกปลูกในสื่อประกอบด้วย 2% (w/v) แล็กโทสและกลูโคส และตัวอย่างที่เก็บเกี่ยวในช่วงเวลาต่าง ๆ ที่วิเคราะห์สำหรับ P-galactosidase กิจกรรมเชื่อมโยงเซลล์ ผลลัพธ์จะแสดงในรูปที่ 1 สิ่งมีชีวิตที่ถูกแสดงในการผลิตเอนไซม์ที่ 20 ถึง 25 h สูงสุดยอดทั้งในสื่อที่ประกอบด้วยกลูโคส และแล็กโทส ในกรณีของการผลิตเอนไซม์จากสิ่งมีชีวิตในน้ำตาลกลูโคสประกอบด้วยสื่อ จำนวนเอนไซม์ต่ำ แต่ที่สำคัญ ผลลัพธ์เหล่านี้แนะนำว่า สิ่งมีชีวิตที่มีความสามารถในโป ducing ต่ำ ขึ้นยอดของกิจกรรมในต่อหน้าของกลูโคส กิจกรรมไม่พบในวัฒนธรรม extracellular supematants เมื่อปลูกในกลูโคส 2% (w/v) ที่สิ่งมีชีวิตโป-duced ความเข้มข้นสูงสุดของ 8.5 g l 1 เอทานอล (ฟิก-ure 2), ซึ่งแสดงถึง 83% ของค่าสูงสุดที่ทฤษฎีผลผลิต เมื่อสิ่งมีชีวิตที่ถูกปลูกในสื่อประกอบด้วยแล็กโทส 2% (w/v) ยอดสูงสุดของเอทานอลโปร-duced พบเป็น 4 g l-l ซึ่งแสดงถึง 39% ของผลผลิตทางทฤษฎีสูงสุด มุมมองการค้นหาหลัง เราตัดสินใจที่จะแยก และเพิ่มเติม ลักษณะกิจกรรม P-galac-tosidase ที่ผลิตในระหว่างการเจริญเติบโตบนประกอบด้วยแล็กโทส โดยสิ่งมีชีวิตที่สื่อ
รูป 1 การผลิตของ p-galactosidase กิจกรรมในระหว่างการเจริญเติบโตของ Kluyveromyces marxianus IMB3 (0) กลูโคสและแล็กโทส (0) ประกอบด้วยสื่อ ตัวอย่างถูกเก็บเกี่ยวในการระบุเวลา และเซลล์ถูก homogenized เป็นกลุ่มตามที่อธิบายไว้ในวิธีการ กิจกรรมจะแสดงในหน่วยต่อโปรตีน milligram
เอนไซม์ Microb Technol., 1995 ปี 17, 697 สิงหาคม
กระดาษ
7.5
5
2.5
0
TERll' ("C)
ผลิตเอทานอล 2 รูปในระหว่างการเจริญเติบโตของ Kluyveromyces marxianos IMB3 (0) แล็กโทสและกลูโคส (Cl) ประกอบด้วยฉัน-
รูปที่ 3 ผลของอุณหภูมิในการเชื่อมโยงเซลล์ l3-galac -
dia
tosidase กิจกรรมผลิตในระหว่างการเจริญเติบโตของสื่อ Kluyveromyces marxianus IMB3 บนประกอบด้วยแล็กโทส
คุณสมบัติบางส่วนของ f3-galactosidase ผลิต โดย marxianus คุณในระหว่างการเจริญเติบโตบนประกอบด้วยแล็กโทสสื่อ
สนทนา
เซลล์ถูกเก็บเกี่ยว และ P-galactosidase ได้แยกตามที่อธิบายไว้ในวิธีการ จำแนกบางส่วนประกอบด้วยตรวจสอบอุณหภูมิและค่า pH เหมาะสมของ ac-tivity กับเสถียรภาพของความร้อนที่หลากหลาย peratures ยการ กิจกรรมนี้ถูกลักษณะกับ K ของ ใช้แล็กโทสและ o-nitrophenyl-P-D-galactoside เป็นพื้นผิว กิจกรรมที่พบจะมีอุณหภูมิค่อนข้างกว้างเหมาะสมระหว่าง 40 และ 50 ° C กับกิจกรรมลดค่อนข้างรวดเร็วที่อุณหภูมิสูงกว่านี้ (รูปที่ 3)
แม้ว่า แสดงว่าก่อนหน้านี้ ยีสต์ thermotolerant marxianus คุณ IMB3 มีความสามารถในการผลิตเอทานอลในการย่อยแลคโตสที่ประกอบด้วยสื่อที่ 45 " C ระดับของเอทานอลโปร
เราพบว่าในขณะที่กิจกรรมที่มีเสถียรภาพสำหรับน้อย 7 h ที่ 3O "C มันมีครึ่งชีวิต 15 และ 5 นาทีที่ 45 และ 5O" C ตามลำดับ กิจกรรมที่แสดงให้มีค่า pH ค่อนข้างคมที่ peaked ที่ pH 7.5 กิจกรรมยังแสดงให้อี

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

การแยกและลักษณะบางส่วนของกิจกรรม P-galactosidase ผลิตโดยสายพันธุ์ทนร้อนของ Kluyveromyces marxianus ระหว่างการเจริญเติบโตในสื่อแลคโตสที่มี
ดี เบรดี้อาร์ชานท์, แอลแมคและแมค AP
เทคโนโลยีชีวภาพกลุ่มโรงเรียนที่ประยุกต์ทางชีวภาพและเคมีวิทยาศาสตร์มหาวิทยาลัยคลุม Coleraine, จำกัด ลอนดอน, ไอร์แลนด์เหนือ
สายพันธุ์ยีสต์ทนร้อน, Kluyveromyces marxianus IMB3 ได้ก่อนหน้านี้แสดงให้เห็นว่า มีความสามารถในการผลิตเอทานอลต่อไปนี้การเจริญเติบโตในสื่อที่มีแลคโตสที่ 45 ° C ที่นี่เราแสดงให้เห็นว่าสิ่งมีชีวิตที่มีความสามารถในการผลิตกิจกรรม P-galactosidase กระตุ้นในการปรากฏตัวของแลคโตส ส่วนใหญ่ของ activiw ดูเหมือนจะเป็นมือถือที่เกี่ยวข้อง เอนไซม์หยุดชะงักต่อไปนี้แยกของเซลล์ที่ได้รับโดดเด่นบางส่วนและการแสดงที่มี K,, จาก 5 มิลลิสำหรับพื้นผิว o-Nitrophenyl-po-galactoside ขณะ thatfor แลคโตสพบว่ามี 40 มิลลิ กิจกรรมที่ได้รับการแสดงที่มีอุณหภูมิในการทำงานที่ดีที่สุดของ 50 ° C แม้ว่าครึ่งชีวิตของเอนไซม์ที่แสดงให้เห็นว่า <5 นาทีที่อุณหภูมิที่ ครึ่งชีวิตของเอนไซม์ที่แยก 4S "C, อุณหภูมิที่เหมาะสมของการหมักยีสต์ได้รับการแสดงให้เห็นว่า 15 นาที เอนไซม์มีเสถียรภาพที่ 30 ° C เป็นเวลาอย่างน้อย 8 ชั่วโมง ค่า pH ที่เหมาะสมที่สุดคือ 7.5 เมื่อเราวิเคราะห์ผลโดยใช้ nondenaturing polyactyl-amide เจลลาดอิร่วมกับการย้อมสีด้วย zymogram methylumbelltferyl-po-galactoside เป็นสารตั้งต้นทั้งสองรูปแบบที่แตกต่างของกิจกรรมที่ได้รับการบ่มเพาะเป็นเวลานาน observedfollowing ด้วยพื้นผิว ผลลัพธ์ที่แสดงให้เห็นว่าแม้ว่ายีสต์นี้มีความสามารถในการผลิตเอทานอลที่ 4S "C, thermotolerance ไม่ได้สะท้อนให้เห็นในการทำงานของเอนไซม์ที่เกี่ยวข้องกับการดูดซึมของแลคโตส
คำสำคัญ: Kluyveromyces marxianus; ทนร้อน; เอทานอล; แลคโตส; P-galactosidase
บทนำ
บางเวลา แลคโตสในนมได้รับการยอมรับในฐานะที่เป็นพื้นผิวที่เหมาะสำหรับการผลิตทั้งน้ำมันเชื้อเพลิงและเอทานอลผ่านการหมักดื่ม 'การแปลงที่มีประสิทธิภาพและการออกแบบกระบวนการที่ได้รับการขัดขวางโดยข้อเท็จจริงที่เข้มข้น-tion ของแลคโตสในนมค่อนข้างต่ำและยีสต์หมักค่อนข้างน้อยมีความสามารถในการใช้แลคโตส ทางเลือกที่พบมากที่สุดในการใช้สายพันธุ์ดั้งเดิมของ Saccharomyces cerevisiae พร้อมกับเข้ามาจากภายนอก
การร้องขอการพิมพ์ที่อยู่ ดร. แมคเทคโนโลยีชีวภาพกลุ่มโรงเรียนที่ประยุกต์ทางชีวภาพและเคมีวิทยาศาสตร์มหาวิทยาลัยของเสื้อคลุมโคล-raine, BT52 อิ จำกัด ลอนดอนเหนือ ไอร์แลนด์ได้รับ 29 กรกฎาคม 1994; แก้ไข 8 พฤศจิกายน 1994; ยอมรับ 18 พฤศจิกายน 1994
เอนไซม์รวมถึงสายพันธุ์ของ Kluyveromyces แม้ว่าเหล่านี้มีความสามารถในการทำงานที่อุณหภูมิ> 37 "C. จะได้รับการชี้ให้เห็นว่าการใช้งานของเวย์โปรตีนเข้มข้นจะได้รับการคาดหวังว่าจะเอาชนะปัญหาที่เกี่ยวข้องกับต่ำ con centrations ของ lactose2; แต่นี้ทำให้เกิดปัญหาตามที่ sociated ด้วยแพ้แลคโตของสายพันธุ์ที่ใช้ก่อนหน้านี้ของ marxianus.3 Kluyveromyces จึงมี ต้อง-ment กับสายพันธุ์ยีสต์ที่มีความสามารถในการทำงานที่อุณหภูมิสูง อันเป็นผลมาจากการฟื้นตัวอย่างต่อเนื่องเอทานอลจากเวย์หมักที่อุณหภูมิสูง, ใหม่ quirement ความเข้มข้นของการเตรียมเวย์จะถูกทำให้ไร้ผล ชุดของสายพันธุ์ทนร้อนของ marxianus เคได้รับการแยก 4 และเป็นหนึ่งในสายพันธุ์เหล่านั้น IMB3 ได้รับรายงานว่าจะมีความสามารถในการผลิตเอทานอลที่ 45 ° C ในระหว่างการเจริญเติบโตในกลูโคส cellobiose 5 ซูโครส 6 และแลคโตสที่มี สื่อ. ที่เกี่ยวกับการเจริญเติบโตในแลคโตส-
เอนไซม์และจุลินทรีย์และเทคโนโลยี 17:69 699 1995 0 1995 Elsevier Science อิงค์ 655 อเวนิวของอเมริกา, New York, NY 10010
0141-0229/95 / $ 10.00 SSDI 0141-0229 (94) 00115 - 8
การผลิต P-galactosidase กิจกรรม: 0 เบรดี้และอัล
เจลถูกย้ายไป transilluminator ยูวีสำหรับการแสดงและการถ่ายภาพ
ที่มีสื่อสิ่งมีชีวิตที่ผลิตอย่างมีนัยสำคัญ Quan tities ของเอทานอลถึงแม้ว่าการแปลงค่อนข้างลิ้ม-ited แม้ว่าสิ่งมีชีวิตถูกนำมาแสดงในการผลิตพีเซลล์ที่เกี่ยวข้อง -galactosidase กิจกรรม (EC 3.2.1.23) มันก็แสดงให้เห็นในระหว่างการศึกษาว่าการเสริมของกลางที่มีเอนไซม์ที่ได้จากเซลล์หดหายของ K. marxianus IMB3 ผลในการผลิตเอทานอลเพิ่มขึ้นจากแลคโตสและข้อ จำกัด ในการผลิตเอทานอลในสื่อ unsupplemented ถูกกล่าวอ้างเป็นผลมาจาก INAC-tivation ของ เอนไซม์เข้ามาจากภายนอกที่ 45 ° C ในการศึกษานี้เราจะอธิบายแยก P-galactosidase AC-TIVITY จาก K. marxianus IMB3 ปลูกในสื่อที่มีแลคโตสที่ 45 "C, และรายงานเกี่ยวกับบางส่วนของลักษณะของ-terization ว่ากิจกรรม
วัสดุและวิธีการการเจริญเติบโตของจุลินทรีย์
Kluyveromyces marxianus IMB3 ได้รับการเก็บรักษาไว้ในสารสกัดจากมอลต์วุ้นที่ 45 ° C สิ่งมีชีวิตที่ได้รับการปลูกในวัฒนธรรมจมอยู่ใต้น้ำในการสั่นขวดที่มีสื่อการเจริญเติบโตของยีสต์ตามที่อธิบายไว้อย่างก่อนหน้าถ้า 0us1y, ~ ยกเว้นซูโครสที่ถูกแทนที่ด้วยแลคโตส [2% (w / v)] ขวดบ่มในเครื่องปั่นโคจรที่ 45 ° C
การสกัด P-galactosidase
เซลล์ที่ถูกเก็บเกี่ยวโดยการหมุนเหวี่ยงที่ 36 ชั่วโมงและล้างในฟอสเฟตบัฟเฟอร์ 0.1 M โซเดียม pH 7.0 เซลล์ปั่นในฟอสเฟตบัฟเฟอร์ 0.1 M โซเดียม pH 7.0 โดยใช้เบราน์ homoge-nizer ร่วมกับลูกปัดแก้วตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้. Homoge-Nates ได้ชี้แจงโดยการหมุนเหวี่ยงที่ 10,000 กรัมเป็นเวลา 30 นาทีและความเข้มข้นโดยผ่าน 100,000 kDa ซึ่งตัด ultrafiltra ชั่นเมมเบรน สารสกัดที่ได้รับการเก็บรักษาไว้ที่ - 20 ° C.
@ galactosidase ทดสอบ
กิจกรรมถูกกำหนดโดยการทดสอบที่ 30 ° C โดยใช้สารตั้งต้น o-ni-trophenyl-PD-galactoside ใน 50 มิลลิบัฟเฟอร์โซเดียมฟอสเฟต pH 7.0 เอนไซม์จะแสดงเป็น kmoles-nitrophenol โปร duced ต่อนาทีต่อมิลลิลิตรของตัวอย่าง ความเข้มข้นของโปรตีนที่ถูกกำหนดโดยใช้ method.8 อธิบายไว้ก่อนหน้าการใช้ครั่ง-Tose เป็นสารตั้งต้นปฏิกิริยาประกอบด้วยความเข้มข้นที่เกี่ยวข้องของสารตั้งต้นใน 50 mu ฟอสเฟตบัฟเฟอร์โซเดียม pH 7.0 ได้ดำเนินการตรวจที่ 3O "C หลังจากที่ความเข้มข้นของน้ำตาลในการผลิตถูกกำหนดโดยใช้ชุด oxidase-peroxidase น้ำตาลที่ผลิตโดย Boehringer ไฮม์ GmbH (เยอรมนี) ใน AC-cordance พร้อมกับคำแนะนำของผู้ผลิต
Nondenaturing pofyacrylamide ลาดเจลอิเลค
เจลอะคริเลตลาด อิ (PAGGE) เป็นต่อที่เกิดขึ้นเป็นหลักเป็น previously.9 อธิบาย Electrophoresis ถูกดำเนินการโดยใช้เจล 4-15% ที่ 200 V for IO นาทีโปรแกรมต่อไปของกลุ่มตัวอย่าง ต่อมาสภาพการทำงานที่มีการเปลี่ยนแปลงถึง 150 โวลต์และอิได้รับอนุญาตให้ดำเนินการต่อไป 1.5 ชั่วโมง
P-galactosidase zymogram ขั้นตอนการย้อมสี
เจลสีที่จะถูกวางไว้ในการแก้ปัญหาพื้นผิว (5 mu-meth ylumbelliferyl-PD-50 galactoside ในฟอสเฟตบัฟเฟอร์โซเดียมมิลลิ ค่า pH 7.0) และบ่ม 2-5 ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้อง
การกำหนดเอทานอล
ตัวอย่างเก็บเกี่ยวจากกระบวนการหมักวิเคราะห์สำหรับเนื้อหาเอทานอลโดยใช้แก๊ส (GLC 8410; Perkin Elmer) ตามที่อธิบายไว้ previously.6
ผลการผลิต P-galactosidase ในระหว่าง การเจริญเติบโตของ K. marxianus IMB3 กับน้ำตาลกลูโคสและแลคโตสที่มีสื่อ
สิ่งมีชีวิตที่ได้รับการปลูกในสื่อที่มี 2% (w / v) และแลคโตสกลูโคสและตัวอย่างการเก็บเกี่ยวในหลาย ๆ ครั้งถูกนำมาวิเคราะห์สำหรับเซลล์ที่เกี่ยวข้องกิจกรรม P-galactosidase ผลลัพธ์ที่ได้จะแสดงในรูปที่ 1 สิ่งมีชีวิตที่ได้รับการแสดงเพื่อผลิตจำนวนสูงสุดของเอนไซม์ที่ 20 ถึง 25 ชั่วโมงทั้งในกลูโคสและสื่อที่มีแลคโตส ในกรณีของการผลิตเอนไซม์โดยสิ่งมีชีวิตในสื่อกลูโคสที่มีปริมาณเอนไซม์ต่ำ แต่มีความหมาย ผลการศึกษานี้แสดงให้เห็นว่าสิ่งมีชีวิตที่มีความสามารถของโปร ducing ต่ำจำนวนเงินที่เป็นส่วนประกอบของกิจกรรมในการปรากฏตัวของกลูโคส ไม่มีกิจกรรมที่ถูกตรวจพบใน supematants วัฒนธรรม extracellular เมื่อโต 2% (w / v) น้ำตาลในชีวิตโปร duced เข้มข้นสูงสุด 8.5 กรัมต่อลิตร-1 เอทานอล (รูปที่ 2) ซึ่งเป็นตัวแทน 83% ของผลผลิตทางทฤษฎีสูงสุด เมื่อสิ่งมีชีวิตที่ถูกปลูกในสื่อที่มี 2% (w / v) แลคโตส, จำนวนเงินสูงสุดของเอทานอลโปร duced พบว่ามี 4 กรัม? จะซึ่งเป็นตัวแทน 39% ของผลผลิตทางทฤษฎีสูงสุด ในมุมมองของการค้นพบหลังเราตัดสินใจที่จะแยกและเพิ่มเติมลักษณะกิจกรรม P-galac-tosidase ผลิตโดยสิ่งมีชีวิตในช่วงการเจริญเติบโตแลคโตสที่มีสื่อ
รูปที่ 1 การผลิตของกิจกรรมพีกาแลคโตในระหว่างการเจริญเติบโตของ Kluyveromyces marxianus IMB3 กับกลูโคส (0 ) และแลคโตส (0) ที่มีสื่อ ตัวอย่างที่เก็บเกี่ยวในเวลาที่ระบุและเซลล์ปั่นตามที่อธิบายไว้ในวิธีการ กิจกรรมจะแสดงในหน่วยต่อมิลลิกรัมโปรตีน
เอนไซม์ microb เทคโนโลยี. 1995 ฉบับ 17 สิงหาคม 697
เอกสาร
7.5
5
2.5
0
TERll '("C)
รูปที่ผลิตเอทานอ 2 ในระหว่างการเจริญเติบโตของ Kluyveromyces marxianos IMB3 กับแลคโตส (0) และกลูโคส (Cl) ที่มีฉัน
รูปที่ 3 ผลของอุณหภูมิที่มีต่อเซลล์ที่เกี่ยวข้อง l3- galac-
เส้นผ่าศูนย์กลาง
กิจกรรม tosidase ผลิตในช่วงการเจริญเติบโตของ Kluyveromyces marxianus IMB3 ในสื่อแลคโตสที่มี
ลักษณะบางส่วนของ f3-galactosidase ผลิตโดย K. marxianus ระหว่างการเจริญเติบโตในแลคโตสที่มีสื่อ
การอภิปราย
เซลล์ที่ถูกเก็บเกี่ยวและ P-galactosidase แยกได้ตามที่อธิบายไว้ในวิธีการ . ตัวละครบางส่วนประกอบด้วยการตรวจสอบอุณหภูมิและพีเอชที่เหมาะสมของ AC-TIVITY ร่วมกับความร้อนที่มีความหลากหลายของ Tem-peratures กิจกรรมนี้ก็มีลักษณะที่เกี่ยวกับของ K,, ใช้ทั้งแลคโตสและ o-Nitrophenyl-PD-galactoside เป็นพื้นผิว กิจกรรมพบว่ามีอุณหภูมิที่เหมาะสมค่อนข้างกว้างระหว่าง 40 และ 50 องศาเซลเซียสด้วยกิจกรรมที่ลดลงค่อนข้างรวดเร็วที่อุณหภูมิสูงกว่านี้ (รูปที่ 3)
แต่ตามที่ปรากฏก่อนหน้านี้ 'ยีสต์ทนร้อน K. marxianus IMB3 มีความสามารถในการผลิตเอทานอล ในสื่อที่มีแลคโตสที่ 45 "C ระดับของเอทานอลโปร
เราพบว่าในขณะที่กิจกรรมที่มีเสถียรภาพอย่างน้อย 7 ชั่วโมงที่ 3O "C มันมีครึ่งชีวิต 15 และ 5 นาทีที่ 45 และ 5O" C ตามลำดับ กิจกรรมที่ได้รับการแสดงที่มีรายละเอียดค่าความเป็นกรดค่อนข้างคมที่แหลมที่ pH 7.5 กิจกรรมนี้ยังได้รับการแสดงเพื่อส่ง

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

การแยกและศึกษาคุณสมบัติบางส่วนของกิจกรรม p-galactosidase ผลิตโดยสายพันธุ์ที่ทนของ kluyveromyces marxianus ในระหว่างการเจริญเติบโตในภาวะที่มีสื่อ
d เบรดี้ อาร์ มาร์แชนท์ ฉันแมเฮล และ เอ. พี. แมเฮล
ชีวภาพ กลุ่มโรงเรียนวิชาชีววิทยาและเคมี มหาวิทยาลัยของเสื้อคลุม Coleraine , บริษัท , ลอนดอนเดรีย์ ไอร์แลนด์เหนือ : ยีสต์ทนเมื่อยkluyveromyces marxianus imb3 ได้ก่อนหน้านี้เคยแสดงให้เห็นความสามารถในการผลิตเอทานอลต่อการเจริญเติบโตในภาวะที่มีสื่อที่ 45 องศา นี่ เรา แสดงให้เห็นว่า สิ่งมีชีวิตมีความสามารถในการผลิตกิจกรรม p-galactosidase inducible ในการแสดงตนของแลกโตส ส่วนใหญ่ของ activiw ปรากฏเป็นเซลล์ที่เกี่ยวข้อง เอนไซม์ , แยกตามการหยุดชะงักของเซลล์มีลักษณะเป็นบางส่วนและมี K , 5 มม. สำหรับพื้นผิว o-nitrophenyl-p-o-galactoside ส่วนว่า แลคโตส คือ 40 มม. กิจกรรมแสดงให้มีอุณหภูมิสูงที่สุด 50 องศา ถึงแม้ว่าครึ่งชีวิตของเอนไซม์เป็น < 5 นาทีที่อุณหภูมิที่ ครึ่งชีวิตของการแยกเอนไซม์ที่ 4S " Cอุณหภูมิที่เหมาะสมในการหมักยีสต์ก็เป็น 15 นาที โดยเอนไซม์ที่อุณหภูมิ 30 องศา C เป็นเวลาอย่างน้อย 8 ชั่วโมง pH 7.5 . เมื่อเราวิเคราะห์ผลโดยใช้เมื่อ polyactyl - เจลร่วมกับไอโซไซม์และการย้อมด้วย methylumbelltferyl-p-o-galactoside เป็นตั้งต้นสองรูปแบบที่แตกต่างกันของกิจกรรมบ่มเพาะ observedfollowing นานด้วยสาร พบว่ายีสต์สามารถผลิตเอทานอลที่ 4S " C , thermotolerance ไม่สะท้อนให้เห็นในกิจกรรมของเอนไซม์ที่เกี่ยวข้องกับการผสมผสานของแลกโตส
คำสำคัญ : kluyveromyces marxianus ; สาร ; เอทานอล ; นม ; p-galactosidase

แนะนำตัวบ้างแลคโตสในเวย์ ได้รับการยอมรับว่าเป็นอุดมคติวัสดุการผลิต ทั้งเชื้อเพลิงและเครื่องดื่มเอทานอลผ่านการหมัก ' ที่มีประสิทธิภาพการแปลงและกระบวนการออกแบบได้ถูกขัดขวางโดยข้อเท็จจริงที่ครุ่นคิด - tion ของแลคโตสในเวย์ค่อนข้างต่ำและค่อนข้างน้อยหมักยีสต์ มีความสามารถในการใช้ทางเลือกที่พบมากที่สุดที่จะใช้สายพันธุ์ดั้งเดิมของ Saccharomyces cerevisiae ร่วมกับ exogenously เพิ่ม
ที่อยู่พิมพ์ขอให้กลุ่มชีวภาพ ดร. แมเฮล , โรงเรียนวิชาชีววิทยาและเคมีคลุม , มหาวิทยาลัย , โคล - เรนท์ ทำซ่า บริษัท เดอ ไอร์แลนด์เหนือ ได้รับ 29 กรกฎาคม 1994 ; แก้ไข 8 พฤศจิกายน 2537 ; ยอมรับ 18 พฤศจิกายน 1994
เอนไซม์รวมสายพันธุ์ของ kluyveromyces ถึงแม้ว่าเหล่านี้มีความสามารถในการทํางานที่อุณหภูมิ > 37 " C . มันได้รับการแนะนำว่าใช้หางนมเข้มข้นจะได้รับการคาดหวังที่จะเอาชนะปัญหาที่เกี่ยวข้องกับต่ำคอน - centrations ของ lactose2 ; แต่นี้เป็นปัญหาที่ sociated กับแล็กโตส intolerance ของก่อนหน้านี้ใช้สายพันธุ์ของ kluyveromyces marxianus 3 ดังนั้น ,มีต้อง ment สำหรับสายพันธุ์ยีสต์ที่มีความสามารถในการทำงานที่อุณหภูมิสูง เป็นผลจากการฟื้นตัวจากเวย์ fermentations เอทานอลอย่างต่อเนื่องที่อุณหภูมิสูง , Re - quirement สำหรับความเข้มข้นของการเตรียมเวย์จะถูกยกเลิก ชุดของสายพันธุ์ทนของ K . marxianus ถูกโดดเดี่ยว และหนึ่งในนั้น imb3 สายพันธุ์ ,มีรายงานว่า จะสามารถผลิตเอทานอลที่ 45 ° C ในช่วงการเจริญเติบโตในกลูโคส ซูโครสที่ 5 , 6 และ แลคโตส - ที่มีสื่อ ' ด้วยความเคารพของแลคโตส -
เอนไซม์และจุลินทรีย์ เทคโนโลยี 17:69 & 699 , 0 2538 2538 โดย Elsevier Science Inc 655 ถนนของอเมริกา , นิวยอร์ก , นิวยอร์ก .
0141-0229 / 95 / $ 10.00 บริการ 0141-0229 ( 94 ) 00115-8
กิจกรรม p-galactosidase การผลิต : 0เบรดี้ et al .
เจลถูกโอนไปยัง UV transilluminator สำหรับภาพและการถ่ายภาพ
ที่มีสื่อ , สิ่งมีชีวิตที่ผลิตได้มาเฉวียน - Tities เอทานอลแม้ว่าการแปลงเป็นค่อนข้างลิม - ited แม้ว่าสิ่งมีชีวิตแสดงการผลิตเซลล์ที่เกี่ยวข้องกิจกรรม p-galactosidase ( EC 3.2.1.23 )' พบระหว่างการศึกษาว่า การเสริมอาหารที่มีเอนไซม์ที่ได้จากเซลล์ของ K . marxianus โฮโม imb3 ทำให้เพิ่มการผลิตเอทานอลจากแลคโตส และข้อจำกัดในการผลิตเอทานอลในสื่อซึ่งได้รับผลมาจาก inac - tivation ของเพิ่ม exogenously เอนไซม์ที่ 45 องศาในการศึกษานี้เราอธิบายการแยกของ tivity p-galactosidase AC - จาก K . marxianus imb3 เติบโต แลคโตส - ที่มีสื่อที่ 45 " C , และรายงานเกี่ยวกับ charac - terization บางส่วนของกิจกรรมที่
วัสดุและวิธีการเจริญเติบโตของจุลินทรีย์
kluyveromyces marxianus imb3 malt extract agar คือ รักษาที่อุณหภูมิ 45 องศาอินทรีย์ที่ปลูกในเหลวในขวดเขย่าที่มีขนาดกลางการเจริญเติบโตของยีสต์ตามที่อธิบายไว้ previ - 0us1y ~ ยกเว้นซูโครสถูกแทนที่โดยแล็กโตส [ 2 % ( w / v ) ] ถูกบ่มในขวดเขย่า วงโคจรที่ 45 องศา p-galactosidase

การสกัดเซลล์ถูกเก็บเกี่ยวโดยการปั่นเหวี่ยงที่ 36 ชั่วโมงและล้างใน 0.1 M ฟอสเฟตบัฟเฟอร์ พีเอช 7.0 . เซลล์มีการบดใน 01 M ฟอสเฟตบัฟเฟอร์ พีเอช 7.0 ใช้บร homoge - nizer ด้วยกันกับลูกปัดแก้วตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ . ' homoge - บั้นท้ายได้ชี้แจงโดยการเหวี่ยงแยกที่ 10 , 000 G สำหรับ 30 นาที และเข้มข้น โดยผ่านการเป็น 100000 ) ultrafiltra , เมมเบรน สารสกัดที่ถูกเก็บไว้ที่อุณหภูมิ - 20 องศา C .
@
galactosidase การทดสอบกิจกรรมที่กำหนดโดยวิธีที่ 30 องศา C โดยใช้พื้นผิว o-ni - trophenyl-p-d-galactoside 50 มิลลิเมตรโซเดียมฟอสเฟตบัฟเฟอร์ pH 7.0 . กิจกรรมของเอนไซม์จะแสดงเป็น kmoles a-nitrophenol Pro - duced ต่อนาทีต่อมิลลิลิตรของตัวอย่าง ความเข้มข้นของโปรตีนถูกกำหนดโดยใช้วิธีการที่อธิบายก่อนหน้านี้ 8 ใช้ครั่ง - tose เป็นตั้งต้นปฏิกิริยาที่เกี่ยวข้องคือ ความเข้มข้นของสารอาหารใน 50 หมู่ฟอสเฟตบัฟเฟอร์ พีเอช 7.0 . จำนวนที่พบ 30 " C , หลังจากที่ความเข้มข้นของกลูโคสที่ผลิตได้ถูกกำหนดโดยใช้เอนไซม์ กลูโคสชุดผลิตโดย Boehringer Mannheim , GmbH ( เยอรมัน ) ใน AC - คอร์แดนซ์กับคำแนะนำของผู้ผลิต
เมื่อ pofyacrylamide ลาดเจล
polyacrylamide gel electrophoresis ( pagge ) คือ การต่อขึ้นเป็นหลักตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ คือ 9 electrophoresis โดยใช้ 4-19 % เจลที่ 200 V สำหรับ IO มินตามการตัวอย่าง ต่อมาใช้เงื่อนไขเปลี่ยนไป 150 V และ electrophoresis ได้รับอนุญาตต่อ 1.5
hทดลองย้อมสี p-galactosidase ขั้นตอน
เจลจะติดอยู่ในหลากหลายโซลูชั่น ( 5 หมู่เมท - ylumbelliferyl-p-d-galactoside 50 มิลลิเมตรโซเดียมฟอสเฟตบัฟเฟอร์ pH 7.0 ) และบ่มเป็นเวลา 2 ถึง 3 ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้อง

หาตัวอย่างเอทานอลจากการเก็บเกี่ยว fermentations วิเคราะห์ปริมาณเอทานอลโดยใช้แก๊สโครมาโตกราฟ ( glc 8410 ;เพอร์กินเอลเมอร์ ) ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ 6
ผลการผลิต p-galactosidase ในระหว่างการเจริญเติบโตของ K . imb3 marxianus ในกลูโคสและแล็กโตสที่มีสื่อ
สิ่งมีชีวิตโตในสื่อที่มี 2 % ( w / v ) แลคโตส และกลูโคส และตัวอย่างที่เก็บเกี่ยวในช่วงเวลาต่าง ๆ วิเคราะห์เซลล์ที่เกี่ยวข้อง p-galactosidase กิจกรรม ผลลัพธ์ที่ได้จะแสดงในรูปที่ 1สิ่งมีชีวิตที่ถูกแสดงเพื่อผลิตปริมาณของเอนไซม์สูงสุดที่ 20 ถึง 25 ชั่วโมง ทั้งใน และ แลคโตส ที่มีสื่อ ในกรณีของการผลิตเอนไซม์โดยสิ่งมีชีวิตในกลูโคสที่มีสื่อ , ปริมาณของเอนไซม์ต่ำ แต่ที่สำคัญ ผลลัพธ์เหล่านี้ชี้ให้เห็นว่าสิ่งมีชีวิตสามารถ Pro ducing ต่ำ , และปริมาณของกิจกรรมในการแสดงตนของกลูโคสไม่มีกิจกรรมที่ตรวจพบในวัฒนธรรมและ supematants . เมื่อปลูกใน 2 % ( w / v ) กลูโคส สิ่งมีชีวิต Pro - duced สูงสุด 8.5 กรัมต่อลิตรความเข้มข้นของเอทานอล ( มะเดื่อ - ที่มี - 1 2 ) ซึ่งแสดง 83 % ของทฤษฎีสูงสุด ผลผลิต เมื่อสิ่งมีชีวิตถูกปลูกในสื่อที่มี 2 % ( w / v ) แลคโตส ยอดสูงสุดของเอทานอล Pro - duced ถูกพบว่าเป็นฉัน - 4 กรัมซึ่งแสดงถึง 39% ของทฤษฎีสูงสุด ผลผลิต ในมุมมองของหลังหาเราตัดสินใจที่จะแยกและเพิ่มเติมลักษณะ p-galac - กิจกรรม tosidase ที่ผลิตโดยสิ่งมีชีวิตในระหว่างการเจริญเติบโตในภาวะที่มีสื่อ
รูปที่ 1 การผลิตกิจกรรม p-galactosidase ในระหว่างการเจริญเติบโตของ kluyveromyces marxianus imb3 กลูโคส ( 0 ) และแลคโตส ( 0 ) ที่มี สื่อจำนวนที่พบเวลาเก็บเกี่ยวและเซลล์เป็นโฮโมตามที่อธิบายไว้ในวิธีการ กิจกรรมจะแสดงในหน่วยต่อมิลลิกรัมโปรตีน .
เอนไซม์ microb . Technol . , 1995 , 17 ฉบับ สิงหาคมแล้ว



2.5 5 7.5 เอกสาร
0
terll ' ( " C )
รูปที่ 2 การผลิตเอทานอลในช่วงการเจริญเติบโตของ kluyveromyces marxianos imb3 ในแลคโตส ( 0 ) และกลูโคส ( CL ) ที่มี ฉัน -
รูปที่ 3 ผลของอุณหภูมิต่อเซลล์ที่เกี่ยวข้อง galac - L3

tosidase Dia กิจกรรมผลิตในระหว่างการเจริญเติบโตของ kluyveromyces marxianus imb3 ในแลคโตสที่มีสื่อ
บางส่วนลักษณะของ F3 galactosidase ผลิตโดย K . marxianus ในระหว่างการเจริญเติบโตในภาวะที่มีการสื่อ

เซลล์ถูกเก็บเกี่ยวและ p-galactosidase ได้อธิบายไว้ในวิธีการการตรวจสอบบางส่วน ได้แก่ อุณหภูมิ และ pH ที่เหมาะสมของ AC - tivity ร่วมกับเสถียรภาพทางความร้อนที่หลากหลายแบบ - peratures . กิจกรรมนี้มีลักษณะส่วนของ K , , , ใช้ทั้ง แลคโตส กับ o-nitrophenyl-p-d-galactoside เป็นทกิจกรรมพบว่ามีค่อนข้างกว้าง อุณหภูมิที่เหมาะสมอยู่ระหว่าง 40 และ 50 องศา C กับกิจกรรมลดลงค่อนข้างอย่างรวดเร็วที่อุณหภูมิข้างบนนี้ ( รูปที่ 3 )
ถึงแม้ว่าก่อนหน้านี้แสดง ' สารยีสต์ K . marxianus imb3 คือความสามารถในการผลิตเอทานอลในภาวะที่มีสื่อที่ 45 " C , ระดับของเอทานอล Pro -
เราพบว่าในขณะที่มีกิจกรรมอย่างน้อย 7 H ที่ 30 " C มันมีครึ่งชีวิตของ 15 และ 5 นาทีที่ 45 และ 5o " C ตามลำดับ กิจกรรมแสดงได้ค่อนข้างคม Ph โปรไฟล์ที่แหลมที่ pH 7.5 . กิจกรรมแสดงและ