Isolation of Lysozyme from Egg Whit

Isolation of Lysozyme from Egg White

This exercise serves as an introduction to the ideas behind protein purification and determination of enzyme specific activity. Students prepare lysozyme from egg white using ion exchange chromatography. The procedure is simple and requires little time or complicated equipment. It takes advantage of lysozyme's remarkably high pI (over 11); even well above neutral pH, lysozyme has a net positive charge, resulting in its retention by a cation exchange matrix when other proteins in egg white would run through due to a net negative charge. Cation exchange matrices that might be used include phosphocellulose and carboxymethyl- or sulfopropyl-substituted cellulose, Sephadex, or Sepharose (I use S-Sepharose). For cation exchange chromatography, the buffer used should consist of neutral and anionic species. You could go high-tech and use a Good buffer such as TAPS, CHES, or CAPS, but I recommend glycine, which is cheap and has a pKa of around 9.5, which is ideal for this application.

I prepare the egg white mixture ahead of lab by diluting an egg white with five volumes of 25 mM glycine, pH 9.2; even at only 25 mM, the buffer holds the pH at 9.2. I shear the mixture and homogenize gently with a teflon-glass homogenizer, strain through four layers of cheesecloth, and finally, just before the lab period, filter through a fast-flow paper (such as Fisher P8 or Whatman #4). The concern is that if the albumin coagulates, which it does quite readily, it will clog the chromatography column.

Students load 5 mL of this filtered mixture onto a 3-mL bed of S-Sepharose equilibrated with the glycine buffer and wash it on with 4 mL of glycine buffer. They then elute the column with 4 mL portions of glycine buffer containing 0.10 M and 0.75 M NaCl. Incidentally, the flow rate can be increased substantially, without otherwise interfering with the separation, by hanging a 3-4 inch length of plastic tubing (such as PE-205 attached to a blunted 16-gauge hypodermic needle) to the bottom of the column. Lyso

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

แยกของ Lysozyme จากไข่ขาวออกกำลังกายนี้ทำหน้าที่เป็นบทนำแนวความคิดทำให้บริสุทธิ์ของโปรตีนและเอนไซม์เฉพาะกำหนด นักเรียนเตรียม lysozyme จากไข่ขาวโดยใช้สารกรอง chromatography ขั้นตอนง่าย และต้องใช้เวลาน้อยหรืออุปกรณ์ที่ซับซ้อน ใช้ประโยชน์ของของ lysozyme ปี่ทแบบสูง (กว่า 11); แม้ดีเหนือค่า pH เป็นกลาง lysozyme มีประจุบวกสุทธิ ผลการรักษาโดยเมทริกซ์ cation exchange เมื่ออื่น ๆ โปรตีนในไข่ขาววิ่งผ่านเนื่องจากประจุลบสุทธิ เมทริกซ์ cation exchange ที่อาจใช้รวม phosphocellulose และแทน carboxymethyl หรือ sulfopropyl เซลลูโลส Sephadex หรือ (ผมใช้ S Sepharose) Sepharose สำหรับ cation exchange chromatography บัฟเฟอร์ที่ใช้ควรประกอบด้วยพันธุ์กลาง และย้อม คุณสามารถไปที่สูง และใช้บัฟเฟอร์ที่ดี เช่นก๊อก บำรุงทรวงอก หมวก แต่ฉันขอแนะนำ glycine ซึ่งมีราคาถูก และมี pKa ของประมาณ 9.5 ซึ่งเหมาะสำหรับโปรแกรมประยุกต์นี้ฉันเตรียมส่วนผสมไข่ขาวก่อนปฏิบัติ โดย diluting เป็นไข่ขาว มีปริมาณ 25 มม. glycine, pH 9.2; 5 แม้ที่เพียง 25 mM บัฟเฟอร์ให้มี pH ที่ 9.2 ฉัน และแรงเฉือนผสม homogenize เบา ๆ ด้วยการเทฟลอนแก้ว homogenizer ต้องใช้ถึงสี่ชั้นของ cheesecloth และสุดท้าย ก่อนรอบระยะเวลาการปฏิบัติ กรองผ่านกระดาษไหลอย่างรวดเร็ว (เช่น Fisher P8 หรือ Whatman #4) ความกังวลอยู่ว่า ถ้า albumin coagulates ซึ่งมันค่อนข้างพร้อม มันจะอุดตันการคอลัมน์ chromatographyโหลดนักเรียน 5 mL ของผสมนี้กรองบนเตียง 3 mL ของ S Sepharose equilibrated กับบัฟเฟอร์ glycine และล้างบนกับ 4 mL ของ glycine บัฟเฟอร์ นอกจากนี้พวกเขาแล้ว elute คอลัมน์กับ 4 mL บางส่วนของ glycine บัฟเฟอร์ที่ประกอบด้วย 0.10 M และ 0.75 M NaCl บังเอิญ อัตราการไหลสามารถเพิ่มได้มาก โดยไม่มีอย่างอื่น รบกวนแยก โดยแขวน 3-4 นิ้วความยาวของท่อพลาสติก (เช่น PE-205 กับเข็มฉีดยา 16 วัด blunted) ที่ด้านล่างของคอลัมน์ Lyso

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

แยก Lysozyme จากไข่ขาวการออกกำลังกายนี้ทำหน้าที่เป็นผู้แนะนำให้รู้จักกับความคิดที่อยู่เบื้องหลังการทำโปรตีนให้บริสุทธิ์และความมุ่งมั่นของกิจกรรมเฉพาะเอนไซม์ นักเรียนเตรียมความพร้อมไลโซไซม์จากไข่ขาวใช้สารแลกเปลี่ยนไอออน ขั้นตอนที่ง่ายและต้องใช้เวลาน้อยหรืออุปกรณ์ที่มีความซับซ้อน จะใช้ประโยชน์จากของไลโซไซม์ pI สูงอย่างน่าทึ่ง (11); แม้จะดีกว่าค่า pH เป็นกลางไลโซไซม์ที่มีประจุบวกสุทธิผลในการเก็บรักษาโดยการเมทริกซ์การแลกเปลี่ยนประจุบวกเมื่อโปรตีนในไข่ขาวจะวิ่งผ่านเนื่องจากมีประจุลบสุทธิ การฝึกอบรมแลกเปลี่ยนไอออนบวกที่อาจนำมาใช้รวมถึง phosphocellulose และ carboxymethyl- หรือเซลลูโลส sulfopropyl-แทน, Sephadex หรือ Sepharose (ผมใช้ S-Sepharose) สำหรับโคแลกเปลี่ยนประจุบวก, บัฟเฟอร์ที่ใช้ควรประกอบด้วยชนิดที่เป็นกลางและประจุลบ คุณสามารถไปที่มีเทคโนโลยีสูงและใช้บัฟเฟอร์ที่ดีเช่นก๊อก, CHES หรือตัวพิมพ์ใหญ่ แต่ผมขอแนะนำ glycine ซึ่งมีราคาถูกและมี pKa ประมาณ 9.5 ซึ่งเหมาะสำหรับโปรแกรมนี้. ผมเตรียมผสมไข่สีขาวข้างหน้า ของห้องปฏิบัติการโดยเจือจางไข่สีขาวที่มีห้าเล่มของ glycine 25 มิลลิพีเอช 9.2; แม้ในเวลาเพียง 25 มิลลิบัฟเฟอร์ถือที่พีเอช 9.2 ฉันเฉือนผสมเป็นเนื้อเดียวกันและเบา ๆ ด้วยเทฟลอนโฮโมจีไนแก้วสายพันธุ์ผ่านสี่ชั้นของผ้าและในที่สุดก็เพียงแค่ก่อนที่ระยะเวลาในห้องปฏิบัติการที่กรองผ่านกระดาษอย่างรวดเร็วไหล (เช่นฟิชเชอร์ P8 หรือเบอร์ # 4) ความกังวลก็คือว่าถ้าอัลบูมิ coagulates ซึ่งมันจะค่อนข้างพร้อมก็จะเกิดการอุดตันคอลัมน์ร. โหลดนักเรียน 5 มิลลิลิตรผสมกรองนี้ลงบนเตียง 3 มิลลิลิตร S-Sepharose equilibrated กับบัฟเฟอร์ glycine และล้างมันด้วย 4 มิลลิลิตรของบัฟเฟอร์ glycine จากนั้นพวกเขาชะคอลัมน์ 4 มิลลิลิตรส่วนของบัฟเฟอร์ที่มี glycine 0.10 M และโซเดียมคลอไรด์ 0.75 M อนึ่งอัตราการไหลจะเพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญโดยไม่ต้องอื่นรบกวนการแยกด้วยการแขวนคอนิ้วความยาว 3-4 ของท่อพลาสติก (เช่น PE-205 ที่แนบมากับทื่อ 16 วัดเข็มฉีดยา) ที่ด้านล่างของคอลัมน์ . lyso

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

การแยกไลโซไซม์จากไข่ขาว

ออกกำลังกายนี้ทำหน้าที่เป็นบทนำแนวคิดที่อยู่เบื้องหลังผลิตโปรตีนและการวิเคราะห์กิจกรรมของเอนไซม์ที่เฉพาะเจาะจง นักเรียนเตรียมไลโซไซม์จากไข่ขาว ใช้วิธีแลกเปลี่ยนไอออน ขั้นตอนที่ง่ายและใช้เวลาเพียงเล็กน้อยหรืออุปกรณ์ที่ซับซ้อน ใช้ประโยชน์จากของไลโซไซม์สูงอย่างน่าทึ่ง pi ( 11 )แม้สูงกว่า pH เป็นกลาง ไลโซไซม์มีประจุสุทธิเป็นบวก ผลของการเก็บรักษาโดยการแลกเปลี่ยนประจุบวกเมทริกซ์เมื่อโปรตีนอื่น ๆในไข่ขาวจะวิ่งผ่าน เนื่องจากสุทธิประจุลบ ในการแลกเปลี่ยนประจุบวกเมทริกซ์ที่อาจจะใช้รวมถึง phosphocellulose คาร์บอกซีเมทิลเซลลูโลสและ - หรือ sulfopropyl ทดแทนสามารถหรือที่เกี่ยวข้อง ( ผมใช้ s-sepharose )สำหรับเทคนิคในการแลกเปลี่ยนประจุบวก , buffer ที่ใช้ควรมีความเป็นกลางและมีประจุลบชนิด คุณสามารถไปสูงและใช้เป็นกันชนที่ดี เช่น ก๊อก เชส หรือ หมวก แต่ผมแนะนำ ไกลซีน ซึ่งมีราคาถูก และมีความประมาณ 9.5 ซึ่งเหมาะสำหรับโปรแกรมนี้

ผมเตรียมส่วนผสมไข่ขาวก่อน Lab โดย diluting ไข่ขาวกับห้าเล่มของไกลซีน , 25 9.2 มม. M ;แม้เพียง 25 มิลลิเมตร บัฟเฟอร์ pH ที่ 9.2 ถือ . ผมตัดส่วนผสมเดียวกันเบาๆด้วยเทฟลอนแก้ว Homogenizer , ความเครียดผ่านสี่ชั้นของผ้า และสุดท้าย ก่อนคาบ Lab , กรองผ่านกระดาษไหลเร็ว ( เช่น ฟิชเชอร์ P8 หรือ whatman # 4 ) กังวลว่าถ้าอัลบูมิน coagulates ซึ่งมันค่อนข้างพร้อม มันจะแต่คอลัมน์โครมาโทกราฟี .

นักเรียน 5 มิลลิลิตรโหลดกรองส่วนผสมลงบนเตียงของ s-sepharose 3-ml equilibrated กับไกลซีนบัฟเฟอร์และล้างมันกับ 4 ml ที่มีบัฟเฟอร์ จากนั้นพวกเขา elute คอลัมน์ 4 ml ส่วนของไกลซีนบัฟเฟอร์ที่มี 0.10 เมตรและ 0.75 โมลาร์ . อนึ่ง อัตราการไหลจะเพิ่มขึ้นอย่างมากโดยไม่ต้องอื่นรบกวนกับการแยกโดยการแขวนคอ 3-4 นิ้ว ความยาวของท่อพลาสติก ( เช่น pe-205 แนบกับทื่อ 16 วัดเข็มฉีดยา ) ด้านล่างของคอลัมน์ lyso