Production of polyclonal antibodies

Production of polyclonal antibodies
BS1 antigen was prepared from stable B. subtilis L-forms grown in LPB and harvested (2000 g, 4 C, 10 min) in a High Speed 18 Centrifuge (MSE, Crawley, UK). The pellet was resuspended in 5 ml phosphate solution (0
145 mol
l ÿ1 NaCl, 0
01 mol l ÿ1 phosphate, pH 7
1; Nairn 1976) and sonicated (Soniprep 150 Ultrasonic Disintegrator; MSE)
six times until the L-forms were totally disrupted. Preimmune blood samples were withdrawn via the marginal ear vein from two New Zealand White rabbits prior to the ®rst injection. BS1 antigen, prepared with Freund's incomplete
adjuvant, was injected intramuscularly at two sites. A further seven booster injections were administered over a
24-week period and serum harvested 5 months after the initial antigen injection. 50 mmol l ÿ1 carbonate bicarbonate buffer, pH 9
6, and incubated for 3 h. Plates were blocked with 1% (w/v) BSA in carbonate bicarbonate buffer (200 ml per well) and incubated for 1 h. Samples, standards and marker wells (i.e. a blank (PBST) and a positive control containing a BS1 Lform suspension at a protein concentration of 1
7 mg mlÿ1) were loaded in duplicate. After overnight incubation at 4 C, 0
3 mg mlÿ1 BS1-IgG-biotin was added and incubated for 3 h. This was followed by streptavidin-alkaline phosphatase
(Amersham Pharmacia Biotech UK, Little Chalfont, UK) diluted to 1/1000 and incubated for 1 h.
The substrate, 2 mg mlÿ1 p-nitrophenol phosphate (Sigma,Poole, UK) in 0
1 mol l ÿ1 glycine buffer with 1 mmol l
ÿ1 MgCl2 and 1 mmol l ÿ1 ZnCl2, pH 10
4, was added. The reaction was developed in the dark at room temperature for
approximately 20±40 min and plates then read at 405 nm (MRX Microplate reader; KPL). The positive/negative
threshold was the mean absorbance of control wells ‡4 standard deviations (C ‡ 4 S.D.; Sutula et al. 1986)

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

การผลิตโพลีแอนติบอดี้BS1 antigen ถูกเตรียมจากเสถียร B. subtilis L ฟอร์ม LPB ปลูก และเก็บเกี่ยว (2000 กรัม 4 C, 10 นาที) เหวี่ยง 18 ความเร็วสูง (MSE ครอวเลย์ สหราชอาณาจักร) เม็ดถูก resuspended ใน 5 มล.ฟอสเฟต (0 145 โมลl ÿ1 NaCl โมล 0 01 l ÿ1 ฟอสเฟต pH 7 1 แนร์น 1976) และ sonicated (Soniprep 150 อัลตราโซนิก Disintegrator MSE)หกครั้งจนแบบ L ได้หยุดชะงักโดยสิ้นเชิง ตัวอย่าง preimmune เลือดถูกถอนผ่านหลอดเลือดดำหูกำไรจากกระต่ายขาวนิวซีแลนด์สองก่อน® rst ฉีด BS1 antigen ด้วย Freund ของไม่สมบูรณ์แบบเสริม ถูกฉีดเข้ากล้ามเนื้อที่เว็บไซต์ที่สอง A ต่อเจ็ดฉีดบูสขึ้นผ่านการระยะเวลา 24 สัปดาห์และเซรั่มเก็บเกี่ยว 5 เดือนหลังจากฉีดครั้งแรก antigen 50 มิลลิโมลต่อลิตร ÿ1 คาร์บอเนตไบคาร์บอเนตบัฟเฟอร์ pH 9 6 และได้รับการกกแผ่น 3 h. บล็อกแบบ 1% (w/v) บีเอสเอในบัฟเฟอร์ไบคาร์บอเนตคาร์บอเนต (200 มิลลิลิตรต่อ) และตัวอย่างที่ 1 h. มาตรฐานได้รับการกก และหลุมเครื่องหมาย (เช่นว่างเปล่า (PBST) และควบคุมบวกที่ประกอบด้วยการระงับ BS1 Lform ที่ความเข้มข้นของโปรตีนของ mlÿ1 7 มก. 1) ถูกโหลดในรายการซ้ำ หลังจากบ่มข้ามคืนที่ 4 C, mlÿ1 3 มก. 0 เพิ่ม BS1-IgG-ไบโอติน และรับการกก 3 ชม แล้ว streptavidin อัลคาไลน์ฟอสฟา(ไบโอเทคฟาร์ Amersham UK ชาร์ฟอร์น เซนน้อย UK) เจือจาง 1/1000 และ 1 ชม.ได้รับการกก พื้นผิว 2 มิลลิกรัม mlÿ1 p-nitrophenol ฟอสเฟต (ซิกม่า พูล สหราชอาณาจักร) ใน 0 1 mol l ÿ1 glycine บัฟเฟอร์กับ 1 มิลลิโมลต่อลิตรÿ1 MgCl2 และ 1 mmol l ÿ1 ZnCl2, pH 10 4 ถูกเพิ่ม ปฏิกิริยาที่ได้รับการพัฒนาในมืดที่อุณหภูมิห้องประมาณ 20±40 นาทีและแผ่นอ่านแล้วที่ 405 nm (MRX Microplate reader KPL) บวกเป็นค่าลบเกณฑ์คือ ค่าเฉลี่ยของหลุม 4 ควบคุมค่าเบี่ยงเบนมาตรฐาน (C 4 S.D. Sutula et al. 1986)

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

ผลิตแอนติบอดีโพลี
BS1 แอนติเจนถูกจัดทำขึ้นจาก B. subtilis มั่นคง L-รูปแบบที่ปลูกใน LPB และเก็บเกี่ยว (2000 G, 4? C, 10 นาที) ในความเร็วสูง 18 เครื่องปั่นเหวี่ยง (MSE, Crawley, สหราชอาณาจักร) เม็ดถูก resuspended ในการแก้ปัญหา 5 มล. ฟอสเฟต (0 145 mol?
L Y1 โซเดียมคลอไรด์, 0 01 mol L Y1 ฟอสเฟตพีเอช 7 1?; Nairn 1976) และ sonicated (Soniprep 150 อัลตราโซนิก Disintegrator; MSE)
หกครั้งจนกว่า L- รูปแบบกระจัดกระจายกันโดยสิ้นเชิง ตัวอย่างเลือด Preimmune ถูกถอนผ่านทางหลอดเลือดดำหูร่อแร่จากสองกระต่ายนิวซีแลนด์สีขาวก่อนที่จะมีการฉีด®rst BS1 แอนติเจนที่เตรียมด้วยที่ไม่สมบูรณ์ของ Freund
เสริมได้รับการฉีดที่สองเว็บไซต์ อีกเจ็ดฉีด Booster เป็นยาในช่วง
ระยะเวลา 24 สัปดาห์และซีรั่มที่เก็บเกี่ยว 5 เดือนหลังจากฉีดแอนติเจนเริ่มต้น 50 มิลลิโมลบัฟเฟอร์ L Y1 คาร์บอเนตไบคาร์บอเนตค่า pH 9 6 และบ่มเป็นเวลา 3 ชั่วโมง แผ่นถูกบล็อกด้วย 1% (w / v) บีเอสเอในบัฟเฟอร์ไบคาร์บอเนตคาร์บอเนต (200 มิลลิลิตรต่อกัน) และบ่มเป็นเวลา 1 ชั่วโมง ตัวอย่างมาตรฐานและเครื่องหมายหลุม (เช่นว่าง (PBST) และการควบคุมในเชิงบวกที่มีการระงับ BS1 Lform ที่มีความเข้มข้นของโปรตีน 1? 7 มิลลิกรัมmlÿ1) ได้รับการโหลดในที่ซ้ำกัน หลังจากการบ่มค้างคืนที่ 4? C, 0? 3 มิลลิกรัมmlÿ1 BS1-IgG-ไบโอตินได้รับการเพิ่มและบ่มเป็นเวลา 3 ชั่วโมง นี้ตามมาด้วยสเตอัลคาไลน์ฟอสฟา
(Amersham Pharmacia ไบโอเทคสหราชอาณาจักรเล็ก ๆ น้อย ๆ Chalfont สหราชอาณาจักร) ลดลงเหลือ 1/1000 และบ่มเป็นเวลา 1 ชั่วโมง.
สารตั้งต้น, 2 มิลลิกรัมmlÿ1 P-nitrophenol ฟอสเฟต (Sigma, พูล, สหราชอาณาจักร) ใน 0? 1 mol บัฟเฟอร์ L Y1 glycine 1 มิลลิโมลต่อลิตร
Y1 MgCl2 และ 1 มิลลิโมลต่อลิตร Y1 ZnCl2 ค่า pH 10? 4 ถูกเพิ่มเข้ามา ปฏิกิริยาที่ได้รับการพัฒนาในความมืดที่อุณหภูมิห้อง
ประมาณ 20 ± 40 นาทีและแผ่นแล้วอ่านที่ 405 นาโนเมตร (MRX ไมโครอ่าน; KPL) บวก / เป็นลบ
เกณฑ์การดูดกลืนแสงเป็นค่าเฉลี่ยของการควบคุมหลุม ?? 4 ส่วนเบี่ยงเบนมาตรฐาน (C ?? 4 SD; Sutula et al, 1986).