2.2. Isolation of lactic acid bacte

2.2. Isolation of lactic acid bacteria
Onewhole fish taken as a samplewaswithdrawn fromits plastic bag
and was aseptically cut into small pieces prior to homogenization and
dilution. The homogenateswere aseptically prepared using a Stomacher
400 Lab Blender (Seward Ltd.,Worthington,UK) at high speed for 3 min.
Serial decimal dilutions were prepared in saline peptone water (0.1%
(w/v) peptone and 0.85% (w/v) NaCl in distilled water) and used as
inoculums in triplicate for colony counting and isolation by the spread
plate technique (Speck, 1984). LAB were isolated using microaerobic
incubation in a candle jar at 30 °C for 3–5 days on MRS agar (Man et al.,
1960) modified by the addition of 1.0% (w/v) CaCO3. Acid producing
bacterial colonies were picked from the agar plates.Where possible, up
to 100 isolates were taken for each sample time. All isolates were
purified and primarily confirmed as LAB based on their microscopic and
biochemical characterizations by performing the Gram's stain, catalase
test, and O–F glucose fermentative test. All LAB isolates were stored at
−80 °C in a freezing medium (Gibson and Khoury, 1986) until
identification by amplified ribosomal DNA restriction analysis
(ARDRA) and ribosomal DNA sequencing.
2.3. Extraction and preparation of genomic DNA from LAB isolates
LAB isolates were cultured for 12 h in 1.5 ml MRS broth at 30 °C
and cells were collected by centrifugation at 5000 rpm for 3 min
[refrigerated microcentrifuge (model: Sigma 3K15, SIGMA Laborzentrifugen
GmbH, Germany)]. MRS broth was removed from the tube
and genomic DNA was extracted from the cell pellets according to a
modified method described by Anderson and McKay (1983) and
Wilson (1990). The extracted genomic DNA from each LAB isolate was
checked by horizontal gel electrophoresis [horizontal gel apparatus
(GelMate GEP102, Toyobo Co., Ltd., Osaka, Japan)] with 0.8% (w/v)
agarose containing 0.5 μg/ml ethidium bromide in 0.5X TBE using
100 V for 20 min. The gel was visualized using an Image Master® VDS
(Amersham Plc., Buckinghamshire, UK). The DNA concentration and
purity were also determined using a spectrophotometric method
(UV–VIS spectrophotometer, Shimadzu Corp., Kyoto, Japan) described
by Maniatis et al. (1982). The DNA preparations were stored in 40 μl
nuclease-free water at −20 °C until required.
2.4. Amplification of 16S rDNA of LAB isolates
DNA from the −20 °C stock was diluted to between 10 pg and
1 μg/50 μl using nuclease-free double distilled water. The 16S rDNA
fragment was amplified by PCR with the universal primer set of 27-f
(5′-AGT TTG ATC CTG GCT CAG-3′) and 1490-r (5′-GTT ACC TTG TTA
CGA CTT C-3′) according to Chen et al. (2005) using an iCycler
Thermal Cycler (Bio-Rad Laboratories Inc., Hercules, USA). All
reagents used in PCR amplification were purchased from Fermentas
International Inc., Ontario, Canada. The amplification was done in
50 μl reaction volumes as described by Hoefel et al. (2005). Each PCR
reaction consisted of 200 μM of each dNTP, 1.0 μM of each primer,
2.5 mM MgCl2, 1X PCR buffer, 2.5 U of Taq DNA polymerase, and 1 μl
DNA template. The thermal cycling included an initial denaturation
step at 95 °C for 10 min; 30 cycles of a denaturation step at 95 °C for
30 s, an annealing step at 50 °C for 1 min, an extension step at 72 °C
for 2 min; and a final extension at 72 °C for 10 min. The PCR product
was checked using 0.8% (w/v) agarose gel electrophoresis. The gel was
visualized using an Image Master® VDS.
2.5. Restriction analyses of 16S rDNA PCR products
The 16S rDNA PCR product from each LAB isolate was cut with an
individual tetrameric restriction endonuclease enzyme: Acc II (CG/CG)
or Hae III (GG/CC) according to Sato et al. (2000) and Chen et al. (2005),
following the procedure described by Fermentas International Inc.,
Ontario, Canada. The restriction endonuclease reaction mixture was
mixed gently and spun down for a few seconds. The reaction mixture
was then incubated at 37 °C for 3 h. The restriction patterns or ARDRA
profileswere examined using 3.0% (w/v) agarose gels in 0.5X TBE buffer
at 100 V for 40 min [horizontal gel apparatus (GelMate GEP102, Toyobo
Co., Ltd., Osaka, Japan)] with a DNA ladder (GeneRuler™ 100 bp DNA
ladder). The gel was visualized using an Image Master® VDS.
2.6. 16S rDNA sequencing
Representatives of each ARDRA pattern group were randomly
chosen for sequence analysis. DNA sequence analysis was performed
according to the dideoxy-mediated chain termination method
(Sanger et al., 1977) using a MegaBACE 1000 automated DNA
sequencer (Pharmacia Biotech, Sweden) at the special DNA sequencing
laboratory of the Department of Biochemistry, Faculty of Medicine,
Khon Kaen University. Homology searches of the 16S rDNA sequences
were performed in the GenBank with the Blastn program.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

2.2. การแยกแบคทีเรียกรดแลคติOnewhole ปลาที่นำมาเป็นถุงพลาสติก fromits samplewaswithdrawnและตัดเป็นชิ้นเล็ก ๆ ก่อน homogenization aseptically และเจือจาง Homogenateswere aseptically จัดทำขึ้นโดยมีแผงประดับหน้าอก400 แล็บปั่น (เซวาร์ด จำกัด ธธิง UK) ที่ความเร็วสูง 3 นาทีวจัดอนุกรมทศนิยมเจือจางในน้ำเกลือ peptone (0.1%(w/v) peptone และ 0.85% (w/v) NaCl ในน้ำกลั่น) และใช้เป็นinoculums ลข้อสำหรับอาณานิคมการนับและการแยก โดยการแพร่กระจายแผ่นเทคนิค (แว๊ก 1984) ห้องปฏิบัติการที่ถูกแยกโดยใช้ microaerobicกกไข่โหลเทียนที่ 30 ° C 3 – 5 วันบนอาหารเลี้ยงเชื้อ MRS (คน et al.,1960) แก้ไข โดยการเพิ่ม 1.0% (w/v) CaCO3 กรดที่ผลิตโคโลนีแบคทีเรียถูกรับจากแผ่นวุ้น ค่าเป็นไปได้เพื่อแยก 100 ถ่ายแต่ละครั้งอย่างนี้ ทั้งหมดที่แยกได้บริสุทธิ์ และได้รับการยืนยันเป็นหลักเป็นการปฏิบัติตามของพวกเขาด้วยกล้องจุลทรรศน์ และcharacterizations ชีวเคมี โดยทำสีย้อมของกรัม คาทดสอบ และ O – F ทดสอบหมักกลูโคส แยกห้องปฏิบัติการทั้งหมดถูกเก็บไว้ที่−80 ° C ในการแช่แข็งกลาง (กิบสันและคูรี่ 1986) จนถึงโดยการวิเคราะห์ข้อจำกัดดีเอ็นเอ ribosomal ขยาย(ARDRA) และ ribosomal ลำดับดีเอ็นเอ2.3. การสกัดและการเตรียมดีเอ็นเอออกจากห้องปฏิบัติแยกแยกห้องปฏิบัติได้ล้างสำหรับ 12 ชม.ในน้ำซุป 1.5 ml MRS ที่ 30 ° Cและเซลล์ถูกรวบรวม โดยหมุนเหวี่ยงที่ 5000 rpm เป็นเวลา 3 นาที[ตู้เย็นไมโคร (รุ่น: Sigma 3K 15 ซิก LaborzentrifugenGmbH เยอรมนี)] นางซุปถูกเอาออกจากหลอดและถูกแยก DNA ออกจากเซลล์เม็ดตามแบบปรับเปลี่ยนวิธีการอธิบายไว้ โดยแอนเดอร์สันและแมค (1983) และวิลสัน (1990) เป็นดีเอ็นเอแยกออกจากโปรตีนแต่ละห้องปฏิบัติการตรวจสอบ โดยแนวเจอิ [เครื่องแนวนอนเจล(GelMate GEP102 อลส์ Co., Ltd. โอซาก้า ญี่ปุ่น)] 0.8% (w/v)agarose ประกอบด้วยโบรไมด์ ethidium 0.5 μ/ml โดยใช้ X TBE 0.5100 V 20 นาที เจถูกแสดงเป็นภาพใช้ VDS®เป็นภาพต้นแบบ(Amersham Plc. บักกิงแฮมเชอร์ สหราชอาณาจักร) ความเข้มข้นของดีเอ็นเอ และนอกจากนี้ยังกำหนดความบริสุทธิ์โดยวิธี spectrophotometricอธิบาย (UV – VIS สเปค Shimadzu Corp. เกียวโต ญี่ปุ่น)โดย Maniatis et al. (1982) การเตรียมดีเอ็นเอที่ถูกเก็บอยู่ใน 40 μlnuclease ฟรีน้ำที่ −20 ° C จนกว่าจำเป็น2.4. การขยายของ 16S rDNA ของห้องปฏิบัติแยกดีเอ็นเอจากหุ้น −20 ° C ถูกเจือจางไประหว่าง 10 pg และ1/50 μ μl ที่ใช้น้ำกลั่นฟรี nuclease คู่ การ 16S rDNAส่วนถูกขยาย โดย PCR กับไพรเมอร์สากล 27-f(5 ′-AGT ทั้ง ATC CTG แผ่น CAG-3′) และ 1490-r (5 ′-GTT ACC ทั้ง TTACGA CTT C-3′) ตาม Chen et al. (2005) โดยใช้การ iCyclerความร้อน Cycler (Bio-ล้อ Laboratories Inc. เฮอร์คิวลิส สหรัฐอเมริกา) ทั้งหมดสารรีเอเจนต์ที่ใช้ในกระบือซื้อจาก Fermentasอินเตอร์เนชั่นแนล อิงค์ ออนตาริโอ แคนาดา ทำการขยายสัญญาณใน50 μl ปฏิกิริยาการไดรฟ์ข้อมูลตามที่อธิบายไว้โดย Hoefel et al. (2005) PCR แต่ละปฏิกิริยาประกอบด้วย 200 μ m ของแต่ละ dNTP, 1.0 ไมครอนแต่ละพื้นขนาด 2.5 มม. MgCl2 บัฟเฟอร์ X PCR 1, 2.5 U ของ Taq DNA พอลิเมอเรส และ 1 μlดีเอ็นเอแม่แบบ ความร้อนขี่จักรยานรวมแปรสภาพเป็นต้นขั้นตอนที่ 95 ° C 10 นาที ขั้นตอนการแปรสภาพที่ 95 ° C สำหรับ 30 รอบ30 s การหลอมขั้นตอนขั้นตอนการขยาย 72 ° c, 50 ° C เป็นเวลา 1 นาทีสำหรับ 2 นาที และนามสกุลเป็นขั้นสุดท้ายที่ 72 องศาเซลเซียส 10 นาที ผลิตภัณฑ์ PCRถูกตรวจสอบโดยใช้อิเจ agarose 0.8% (w/v) เป็นเจแสดงเป็นภาพใช้ VDS®เป็นภาพต้นแบบ2.5. จำกัดการวิเคราะห์ผลิตภัณฑ์ 16S rDNA PCRตัดผลิตภัณฑ์ PCR 16S rDNA จาก isolate แต่ละห้องปฏิบัติการด้วยการเอนไซม์แต่ละ tetrameric จำกัด endonuclease: Acc II (CG/CG)หรือแฮ III (GG/CC) ตามซา et al. (2000) และ Chen et al. (2005),ทำตามขั้นตอนที่อธิบายไว้ โดย Fermentas อินเตอร์เนชั่นแนล อิงค์ออนตาริโอ แคนาดา มีส่วนผสมของปฏิกิริยา endonuclease จำกัดผสมเบา ๆ และปั่นลงกี่วินาที ส่วนผสมของปฏิกิริยาแล้ว incubated ที่ 37 ° C เป็นเวลา 3 ชั่วโมง รูปแบบข้อจำกัดหรือ ARDRAprofileswere ตรวจสอบโดยใช้เจล agarose 3.0% (w/v) ในบัฟเฟอร์ X TBE 0.5100 V สำหรับ 40 นาที [เครื่องมือแนวนอนเจล (GelMate GEP102 อลส์Co., Ltd. โอซาก้า ญี่ปุ่น)] ด้วยบันได DNA (GeneRuler™ 100 bp ดีเอ็นเอบันได) เจถูกแสดงเป็นภาพใช้ VDS®เป็นภาพต้นแบบ2.6. 16S rDNA ลำดับตัวแทนของแต่ละกลุ่มรูปแบบ ARDRA ได้แบบสุ่มเลือกสำหรับการวิเคราะห์ลำดับ ดำเนินการวิเคราะห์ลำดับดีเอ็นเอตามวิธีการเลิกจ้างสื่อ dideoxy โซ่(Sanger et al. 1977) ใช้แบบ 1000 MegaBACE อัตโนมัติดีเอ็นเอซีเควนเซอร์ (ฟาร์ไบโอเทค สวีเดน) ที่ลำดับดีเอ็นเอพิเศษห้องปฏิบัติการของภาควิชาชีวเคมี คณะแพทย์มหาวิทยาลัยขอนแก่น ค้นหา homology 16S rDNA ลำดับดำเนินการใน GenBank กับโปรแกรม Blastn

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

2.2 การแยกแบคทีเรียแลคติก
ปลา Onewhole นำมาเป็น samplewaswithdrawn fromits ถุงพลาสติก
และถูกตัดปลอดเชื้อเป็นชิ้นเล็ก ๆ ก่อนที่จะเป็นเนื้อเดียวกันและ
เจือจาง homogenateswere ปลอดเชื้อเตรียมใช้ Stomacher
400 Lab ปั่น (เอิร์ด จำกัด วอร์ชิงตันสหราชอาณาจักร) ที่ความเร็วสูงเป็นเวลา 3 นาที.
อนุกรมเจือจางทศนิยมได้จัดทำน้ำเกลือเปปโตน (0.1%
(w / v) เปปโตนและ 0.85% (w / V) โซเดียมคลอไรด์ในน้ำกลั่น) และใช้เป็น
หัวเชื้อแบคทีเรียในเพิ่มขึ้นสามเท่านับอาณานิคมและการแยกโดยการแพร่กระจาย
เทคนิคแผ่น (จุด, 1984) LAB ถูกแยกโดยใช้ microaerobic
บ่มในขวดเทียนที่อุณหภูมิ 30 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 3-5 วันใน MRS agar (Man et al.,
1960) แก้ไขโดยการเพิ่มขึ้นของ 1.0% (ที่ w / v) CaCO3 กรดผลิต
แบคทีเรียที่ถูกเลือกจากวุ้น plates.Where เป็นไปได้เพิ่มขึ้น
ถึง 100 สายพันธุ์ถูกนำแต่ละครั้งตัวอย่าง ไอโซเลททั้งหมดถูก
ทำให้บริสุทธิ์และได้รับการยืนยันเป็นหลักเป็น LAB ขึ้นอยู่กับกล้องจุลทรรศน์ของพวกเขาและ
สมบัติทางชีวเคมีโดยการดำเนินคราบกรัม, catalase
ทดสอบ O-F ทดสอบกลูโคสหมัก สายพันธุ์ LAB ทั้งหมดถูกเก็บไว้ที่
-80 องศาเซลเซียสในการแช่แข็งปานกลาง (กิบสันและ Khoury, 1986) จนกว่า
บัตรประจำตัวโดยการขยายการวิเคราะห์ข้อ จำกัด ดีเอ็นเอไรโบโซม
(ARDRA) และลำดับดีเอ็นเอโซมอ.
2.3 การสกัดและการเตรียมความพร้อมของดีเอ็นเอจากห้องปฏิบัติการที่แยก
สายพันธุ์ LAB เพาะเลี้ยงเป็นเวลา 12 ชั่วโมงใน 1.5 มล. MRS น้ำซุปที่ 30 ° C
และเซลล์ที่ถูกเก็บรวบรวมโดยการหมุนเหวี่ยงที่ 5000 รอบต่อนาทีเป็นเวลา 3 นาที
[ตู้เย็นไมโคร (Model: ซิก 3K15 ซิก Laborzentrifugen
GmbH, เยอรมนี)] น้ำซุป MRS ถูกลบออกจากหลอด
และดีเอ็นเอถูกสกัดจากเม็ดเซลล์ตามการ
ดัดแปลงวิธีการอธิบายโดยเดอร์สันและแม็คเคย์ (1983) และ
วิลสัน (1990) ดีเอ็นเอจีโนมที่สกัดจากปฏิบัติการในแต่ละแยกถูก
ตรวจสอบโดยแนวนอน gel electrophoresis [อุปกรณ์เจลแนวนอน
(GelMate GEP102, Toyobo จำกัด , โอซาก้าประเทศญี่ปุ่น)] ด้วย 0.8% (w / v)
agarose มี 0.5 ไมโครกรัม / มิลลิลิตร ethidium bromide ใน 0.5 เท่า TBE ใช้
100 V สำหรับ 20 นาที เจลได้รับการมองเห็นโดยใช้ภาพMaster® VDS
(Amersham บมจ. Buckinghamshire สหราชอาณาจักร) ความเข้มข้นของ DNA และ
ความบริสุทธิ์นอกจากนี้ยังได้รับการพิจารณาโดยใช้วิธีการสเปก
(UV-VIS spectrophotometer, Shimadzu คอร์ป, เกียวโตญี่ปุ่น) อธิบาย
โดย Maniatis et al, (1982) การเตรียมดีเอ็นเอถูกเก็บไว้ใน 40 ไมโครลิตร
น้ำ Nuclease ฟรีที่ -20 ° C จนต้อง.
2.4 การขยายของ 16S rDNA ของแล็บแยก
ดีเอ็นเอจาก -20 ° C สต็อกลดลงระหว่าง 10 และ PG
1 ไมโครกรัม / 50 ไมโครลิตรโดยใช้น้ำกลั่น Nuclease ฟรีคู่ 16S rDNA
ชิ้นส่วนได้รับการขยายโดยวิธี PCR กับชุดไพรเมอร์สากลของ 27-F
(5'-AGT TTG ATC CTG GCT CAG-3) และ 1490-R (5'-GTT แม็ก TTG TTA
CGA CTT C-3 ') ตาม Chen et al, (2005) โดยใช้ iCycler
Thermal Cycler (Bio-Rad Laboratories Inc. , Hercules, สหรัฐอเมริกา) ทั้งหมด
น้ำยาที่ใช้ในการขยาย PCR ที่ซื้อมาจาก Fermentas
อินเตอร์เนชั่นแนลอิงค์, Ontario, แคนาดา ขยายได้ทำใน
ปริมาณ 50 ไมโครลิตรปฏิกิริยาตามที่อธิบาย Hoefel et al, (2005) แต่ละวิธี PCR
ปฏิกิริยาประกอบด้วย 200 ไมครอนของแต่ละ dNTP 1.0 ไมครอนของแต่ละไพรเมอร์
ขนาด 2.5 มม MgCl2, 1X PCR บัฟเฟอร์ 2.5 U ของ Taq DNA Polymerase และ 1 ไมโครลิตร
ดีเอ็นเอแม่แบบ ขี่จักรยานการระบายความร้อนรวมถึงการสูญเสียสภาพธรรมชาติเริ่มต้น
ขั้นตอนที่ 95 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 10 นาที; 30 รอบของการเป็นขั้นตอน denaturation ที่ 95 องศาเซลเซียสเป็นเวลา
30 วินาที, ขั้นตอนการอบที่อุณหภูมิ 50 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 1 นาที, ขั้นตอนการขยายที่ 72 องศาเซลเซียส
เป็นเวลา 2 นาที; และขยายสุดท้ายที่ 72 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 10 นาที ผลิตภัณฑ์ PCR
ได้รับการตรวจสอบโดยใช้ 0.8% (w / v) electrophoresis agarose เจล เจลได้รับการ
มองเห็นโดยใช้ภาพMaster® VDS.
2.5 การวิเคราะห์ข้อ จำกัด ของผลิตภัณฑ์ 16S rDNA PCR
ผลิตภัณฑ์ 16S rDNA PCR จากแต่ละ LAB แยกตัดกับ
เอนไซม์ จำกัด endonuclease แต่ละ tetrameric: Acc สอง (CG / CG)
หรือเฮ III (GG / CC) ตาม Sato, et al (2000) และเฉิน, et al (2005)
ต่อไปนี้ขั้นตอนที่อธิบายโดย Fermentas อินเตอร์เนชั่นแนลอิงค์
Ontario, แคนาดา ส่วนผสมข้อ จำกัด endonuclease ปฏิกิริยาถูก
ผสมเบา ๆ และหมุนตัวลงไม่กี่วินาที ผสมปฏิกิริยา
ถูกบ่มแล้วที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 3 ชั่วโมง รูปแบบการ จำกัด หรือ ARDRA
profileswere ตรวจสอบโดยใช้ 3.0% (w / v) เจล agarose ใน 0.5 เท่า TBE บัฟเฟอร์
ที่ 100 V สำหรับ 40 นาที [อุปกรณ์เจลแนวนอน (GelMate GEP102, Toyobo
จำกัด , โอซาก้าประเทศญี่ปุ่น)] ด้วย บันไดดีเอ็นเอ (GeneRuler ™ 100 bp ดีเอ็นเอ
บันได) เจลได้รับการมองเห็นโดยใช้ภาพMaster® VDS.
2.6 16S rDNA ลำดับ
ตัวแทนของแต่ละกลุ่มรูปแบบ ARDRA ถูกสุ่ม
เลือกสำหรับการวิเคราะห์ลำดับ การวิเคราะห์ลำดับดีเอ็นเอที่ได้ดำเนินการ
ไปตาม dideoxy พึ่งวิธีการเลิกจ้างโซ่
(Sanger et al., 1977) โดยใช้ MegaBACE 1000 อัตโนมัติดีเอ็นเอ
ซีเควน (Pharmacia ชีวภาพสวีเดน) ในลำดับดีเอ็นเอพิเศษ
ห้องปฏิบัติการของภาควิชาชีวเคมีคณะแพทยศาสตร์ ,
มหาวิทยาลัยขอนแก่น การค้นหาที่คล้ายคลึงกันของลำดับ 16S rDNA
ได้ดำเนินการใน GenBank กับโปรแกรมดังกล่าวหา

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

2.2 . การคัดแยกแบคทีเรียกรดแลกติกonewhole ปลาถ่ายเป็น samplewaswithdrawn fromits ถุงพลาสติกและ aseptically ตัดเป็นชิ้นเล็ก ๆก่อนการ และเจือจาง การ homogenateswere aseptically เตรียมใช้แผงประดับหน้าอก400 Lab เครื่องปั่น ( ซีเวิร์ดจำกัด , Worthington , UK ) ที่ความเร็วสูงเป็นเวลา 3 นาทีเตรียมน้ำเกลือเจือจางแบบทศนิยมในน้ำ ( 0.1 % ตามลำดับ( w / v ) ตามลำดับและ 0.85 % ( w / v ) เกลือโซเดียมคลอไรด์ในน้ำ ) และใช้เป็น18 ชั่วโมงทั้งสามใบสำหรับอาณานิคมนับและแยกโดยการแพร่กระจายเทคนิคจาน ( จุด , 1984 ) แยกใช้ microaerobic แล็บบ่มเพาะในเทียนขวด 30 ° C เป็นเวลา 3 – 5 วันและนางวุ้น ( et al . ,1960 ) ดัดแปลงโดยเพิ่ม 1% ( w / v ) CaCO3 . การผลิตกรดแบคทีเรียโคโลนีได้รับเลือกจากวุ้นแผ่น ที่เป็นไปได้ , ขึ้น100 ไอโซเลทนำสำหรับแต่ละตัวอย่างเวลา ทุกไอโซเลทบริสุทธิ์และเป็นหลักยืนยันเป็นแล็บตามด้วยการศึกษาคุณสมบัติทางชีวเคมีโดยการดำเนินการของกรัมคราบคาทาเลสทดสอบและ O F กลูโคสและวิศวกรรมเคมี ทดสอบ แล็บทั้งหมดถูกเก็บไว้ในเลท− 80 °องศาเซลเซียสในการแช่แข็งปานกลาง ( กิ๊บสัน และเคารี่ , 1986 ) จนกระทั่งจากการวิเคราะห์ดีเอ็นเอของไรโบโซม ระบุข้อ จำกัด( ardra ) ลำดับ DNA และ Protein .2.3 การสกัดและการแยกดีเอ็นเอจากแล็บห้องปฏิบัติการเพาะเลี้ยงเชื้อเป็นเวลา 12 ชั่วโมงใน 1.5 ml MRS broth ที่ 30 ° Cและเซลล์มีจำนวนที่ 5 , 000 รอบต่อนาที ปั่น 3 นาที[ ตู้เย็นไมโครเซนตริฟิวจ์ ( Model : Sigma 3k15 , Sigma laborzentrifugenGmbH , Germany ) ] MRS broth จะถูกลบออกจากหลอดพันธุกรรมและดีเอ็นเอจากเซลล์เม็ดตามที่เป็นแก้ไขวิธีที่อธิบายโดย Anderson และแม็คเคย์ ( 1983 ) และวิลสัน ( 1990 ) สกัดดีเอ็นเอจากแต่ละห้องแยก คือตรวจสอบโดยเครื่องมือเจลเจล [ แนวนอนแนวนอน( gelmate gep102 toyobo , จำกัด , โอซาก้า , ญี่ปุ่น ) 0.8 % ( w / v )( μที่มี 0.5 g / ml โบรไมด์ ( ทีบีใช้คู่ใน100 V สำหรับ 20 นาที เจลคือภาพโดยใช้ภาพต้นแบบ® VDS( ที่ จำกัด . , เหมือนเดิม , UK ) ดีเอ็นเอ สมาธิความบริสุทธิ์ก็ตัดสินใจใช้วิธีสเปกโตรโฟโตมิเตอร์( UV ) ซึ่ง Spectrophotometer Shimadzu คอร์ป , เกียวโต , ญี่ปุ่น ) อธิบายโดย maniatis et al . ( 1982 ) การเตรียมดีเอ็นเอที่ถูกเก็บไว้ในμ 40 ลิตรนิวเคลียสฟรีน้ำ 20 −° C จนต้อง2.4 . การเพิ่มปริมาณของ 16S rDNA ของแล็บไอโซเลทดีเอ็นเอจาก− 20 ° C หุ้นเจือจางระหว่าง 10 PG และ1 μกรัม / 50 μผมใช้นิวเคลียสฟรีคู่น้ำกลั่น ช่วง 16S rDNAเบสถูกขยายโดยวิธี PCR ด้วย primer ชุด 27-f สากล( 5 ’ - agt ทีทีจี ATC CTG GCT cag-3 School ) และ 1490-r ( 5 ’ - gtt บัญชีทีทีจีซีส์ได้รับ c-3 CGA CTT ) ตาม Chen et al . ( 2005 ) โดยใช้ icyclerThermal cycler ( ไบโอ ราดห้องปฏิบัติการอิงค์ , Hercules , USA ) ทั้งหมดสารเคมีที่ใช้ในการเพิ่มปริมาณดีเอ็นเอ ซื้อมาจาก fermentasอินเตอร์เนชั่นแนลอิงค์ , Ontario , แคนาดา การเพิ่มปริมาณได้ใน50 μ L ปริมาณปฏิกิริยาตามที่อธิบายไว้โดย hoefel et al . ( 2005 ) โดยแต่ละปฏิกิริยาจำนวน 200 μ M ของแต่ละ dntp 1.0 M ของแต่ละμไพรเมอร์ชุด 2.5 มม. , 1x PCR buffer , 2.5 U ของดีเอ็นเอพอลิเมอเรส ทัค และ 1 μ lแม่แบบดีเอ็นเอ การขี่จักรยานความร้อนรวม ( เริ่มต้นขั้นตอนที่ 95 องศา C นาน 10 นาที ( ; 30 รอบของขั้นตอนที่ 95 องศา C สำหรับ30 วินาที เป็นขั้นที่ 50 องศา C อบนาน 1 นาที ต่อขั้นตอนที่ 72 ° C2 นาที และงานสุดท้ายที่ 72 ° C 10 นาทีผลิตภัณฑ์ PCRตรวจสอบการใช้ 0.8 % ( w / v ) , เจล เจล คือภาพโดยใช้ภาพต้นแบบ® VDS .2.5 จำกัดการวิเคราะห์ 16S rDNA และผลิตภัณฑ์ช่วง 16S rDNA ) ผลิตภัณฑ์จากแต่ละห้องแยกถูกตัดด้วยบุคคล tetrameric ตัดด้วยเอนไซม์ตัดจำเพาะเอนไซม์ ACC 2 ( CG / CG )หรือแฮ III ( GG / CC ) ตามซาโต้ et al . ( 2000 ) และ Chen et al . ( 2005 )ทำตามขั้นตอนที่อธิบายไว้โดย fermentas อินเตอร์เนชั่นแนลอิงค์ออนแทรีโอ , แคนาดา การตัดด้วยเอนไซม์ตัดจำเพาะปฏิกิริยาผสมผสมเบา ๆและปั่นลงไม่กี่วินาที ปฏิกิริยาผสมจากนั้นบ่มที่ 37 ° C เป็นเวลา 3 ชั่วโมง หรือ ardra จำกัดรูปแบบตรวจสอบการใช้ profileswere 3.0 % ( w / v ) หรือเจลในบัฟเฟอร์ ( ทีบีที่ 100 V สำหรับ 40 นาที [ แนวนอนเจล ( gelmate gep102 toyobo , เครื่องมือCo . , Ltd . , โอซาก้า , ญี่ปุ่น ) ] กับดีเอ็นเอบันได ( generuler ™ 100 BP ดีเอ็นเอบันได ) เจลคือปรากฏการณ์การใช้ภาพต้นแบบ® VDS .2.6 ลำดับ 16S rDNAตัวแทนของแต่ละกลุ่ม ardra แบบสุ่มเลือกการวิเคราะห์ลำดับ การวิเคราะห์ลำดับเบสดีเอ็นเอแสดงตามไป dideoxy วิธีบอกเลิกโดยโซ่( Sanger et al . , 1977 ) การใช้ megabace 1000 ดีเอ็นเอแบบอัตโนมัติซีเควน ( มุ่งมั่น ไบโอเทค , สวีเดน ) ในการจัดลำดับดีเอ็นเอพิเศษห้องปฏิบัติการของภาควิชาชีวเคมี คณะแพทยศาสตร์มหาวิทยาลัยขอนแก่น ลำดับการค้นหาของยีน 16S rDNAแสดงในขนาดด้วยโปรแกรม blastn .