When freshly isolated Toxoplasma ce

When freshly isolated Toxoplasma cells were maintained at 378C in the absence of host cells, they rapidly lost their ability to invade host cells (data not shown), suggesting that the factors that mediate invasion are transitory. To investigate this phenomenon further, we exposed parasites to repeated cycles of incubation at 378C for 10min, followed by centrifugation and resuspension in fresh medium. At each cycle, supernatants were analysed by Western blotting, and parasites were tested for invasion of host cell monolayers. Parasites were able to invade during cycle 1 but not in any of the subsequent cycles (Fig. 2, top). When parasites from cycle 2 were resuspended without removal of the cycle 1 supernatant, they were still unable to invade (denoted as 2* inFig. 2), eliminatingthe possibility thattheir defect in later cycles was simply the result of the removal of soluble factor secreted into the culture supernatant during cycle 1. To test whether the observed loss of infectivity correlated with microneme secretion, we analysed culture supernatants (Fig. 2A, second row) and parasite cell pellets (Fig. 2A, third row) for their content of MIC2 by Western blotting. Micronemes were discharged in cycle 1, releasing 2467.8% (mean6SD, nˆ4) of the total cellular MIC2; however, no further discharge occurred during any of the subsequent cycles. Although soluble MIC2 was present in supernatants of cycle 2*, because of carryover from cycle 1, no further release occurred, and these cells remained non-invasive. Identical results were obtained for MIC4(datanotshown),suggestingthattemperaturecycling affected microneme secretion in general. To rule out the possibility that this treatment affected other secretory functions, we monitored dense granule and rhoptry secretion and the composition of surface proteins during treatment. We observed no signi®cant changes in dense granule secretion, and rhoptry secretion was again not detected (data not shown). Additionally, no changes in the biotinlabelled surface proteins, including three previously characterized antigens (SAGs 1±3) (Fig. 2B), were observed. This result suggests that the invasion-reducing effects of temperature cycling were not caused by altered expression or modi®cation of the major surface glycoproteins. Furthermore, the effects of temperature cycling were not attributable to reduced viability, as parasites that were allowed to recover for 4h regained their ability to invade host cells and secrete micronemal proteins (Fig. 2A, ®rst row). Restoration of invasion and micronemal discharge were both cyclohexamide dependent, suggesting a requirement for protein synthesis (Fig. 2A). Combined with the above ®ndings, these results imply that only parasites that are actively secreting micronemal proteins are capable of invading host cells.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

เมื่อเซลล์ Toxoplasma สดแยกถูกเก็บที่ C 378 ของเซลล์โฮสต์ พวกเขาหายไปอย่างรวดเร็วความสามารถในการโจมตีเซลล์โฮสต์ (ข้อมูลไม่แสดง), แนะนำว่า ปัจจัยที่บรรเทาการบุกรุกเป็นอนิยม ตรวจสอบปรากฏการณ์นี้ต่อไป เราเปิดกับการซ้ำวงจรการฟักตัวที่ 378C ใน 10 นาที ตามด้วย centrifugation resuspension ตะกอนในสด ในแต่ละรอบ supernatants ได้ analysed โดย blotting วิธีตะวันตก และทดสอบกับการบุกรุกของ monolayers เซลล์โฮสต์ ปรสิตสามารถโจมตีใน ระหว่างฤดูกาลที่ 1 แต่ในรอบต่อ ๆ ไปกิน 2 สูงสุด) ไม่ได้ เมื่อปรสิตจากรอบ 2 ได้ resuspended ไม่เอารอบ 1 supernatant พวกเขายังคงไม่สามารถรุก (ตาม 2 * inFig. 2), eliminatingthe ข้อบกพร่อง thattheir ความเป็นไปได้ในรอบต่อไปเป็นเพียงผลของการกำจัดของตัวละลายที่ secreted เป็นวัฒนธรรม supernatant ระหว่างรอบ 1 เพื่อทดสอบว่าสูญเสียสังเกต infectivity correlated กับหลั่ง microneme เรา analysed supernatants วัฒนธรรม (Fig. 2A สองแถว) และปรสิตเซลล์อัดเม็ด (Fig. 2A แถวที่สาม) สำหรับเนื้อหาของ MIC2 โดย blotting วิธีเวสเทิร์น Micronemes ถูกปล่อยออกในรอบ 1 ปล่อย 2467.8% (mean6SD, n 4) MIC2 โทรศัพท์มือถือรวม อย่างไรก็ตาม ไปปล่อยเกิดขึ้นในรอบต่อไป แม้ว่า MIC2 ละลายมีใน supernatants ของรอบ 2 *, เพราะ carryover จากรอบ 1 ไปปล่อยเกิดขึ้น และเซลล์เหล่านี้ยังคงไม่รุกรานกัน ผลเหมือนได้รับการ MIC4 (datanotshown), suggestingthattemperaturecycling ได้รับผลกระทบ microneme หลั่งใน การยกเลิกสามารถรักษานี้ได้รับผลกระทบอื่น ๆ ฟังก์ชัน secretory เราติดตามหลั่งเม็ดและ rhoptry หนาแน่นและองค์ประกอบของโปรตีนผิวขณะทำการรักษา เราสังเกตไม่ signi ® ต้อนเปลี่ยนในหลั่งเม็ดหนาแน่น และหลั่ง rhoptry อีกไม่ถูกตรวจพบ (ข้อมูลไม่แสดง) นอกจากนี้ ไม่เปลี่ยนแปลงใน biotinlabelled ผิวโปรตีน รวมสามก่อนหน้านี้ลักษณะ antigens (กระชาก 1±3) (Fig. 2B), สุภัค ผลลัพธ์นี้แนะนำที่ผลลดการบุกรุกของอุณหภูมิ ขี่จักรยานได้ก็เกิดจากการเปลี่ยนแปลงนิพจน์หรือ modi ® cation ของ glycoproteins ผิวหลัก นอกจากนี้ ผลกระทบอุณหภูมิ ขี่ไม่รวมชีวิตลด เป็นปรสิตที่ได้รับอนุญาตให้กู้คืนสำหรับ 4h จากความสามารถในการรุกรานเซลล์โฮสต์ และหลั่งโปรตีน micronemal (Fig. 2A, ® rst แถว) คืนบุกรุกและปล่อย micronemal ได้ทั้ง cyclohexamide ขึ้น การแนะนำความต้องการสำหรับการสังเคราะห์โปรตีน (Fig. 2A) รวมกับข้าง ® ndings ผลลัพธ์เหล่านี้เป็นสิทธิ์แบบว่า ปรสิตที่อยู่อย่าง secreting micronemal โปรตีนจะสามารถบุกรุกเซลล์โฮสต์

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

เมื่อแยกเซลล์สด Toxoplasma ถูกเก็บรักษาไว้ที่ 378C ในกรณีที่ไม่มีของเซลล์โฮสต์ที่พวกเขาอย่างรวดเร็วสูญเสียความสามารถในการที่จะบุกเซลล์โฮสต์ (ไม่ได้แสดงข้อมูล) ชี้ให้เห็นว่าปัจจัยที่เป็นสื่อกลางในการบุกรุกชั่วคราว ในการตรวจสอบปรากฏการณ์นี้ต่อไปเราสัมผัสปรสิตวงจรซ้ำของการบ่มที่ 378C สำหรับ 10 นาทีตามด้วยการหมุนเหวี่ยงและ resuspension ในสื่อสด ในแต่ละรอบ supernatants วิเคราะห์ซับตะวันตกและปรสิตได้มีการทดสอบสำหรับการบุกรุกของ monolayers เซลล์โฮสต์ ปรสิตก็สามารถที่จะบุกในระหว่างรอบ 1 แต่ไม่ได้อยู่ในใด ๆ ของรอบถัดไป (รูปที่ 2. ด้านบน) เมื่อปรสิตจากวงจร 2 ถูก resuspended โดยไม่ต้องกำจัดของวงจร 1 ใสที่พวกเขายังไม่สามารถที่จะบุก (แสดงเป็น 2 * inFig. 2) ความเป็นไปได้ eliminatingthe thattheir ข้อบกพร่องในรอบต่อมาเป็นเพียงผลของการกำจัดปัจจัยที่ละลายน้ำได้หลั่งเข้ามาใน ใสวัฒนธรรมระหว่างรอบ 1. เพื่อทดสอบว่าการสูญเสียที่สังเกตของการติดเชื้อมีความสัมพันธ์กับการหลั่ง microneme เราวิเคราะห์ supernatants วัฒนธรรม (รูป. 2A สองแถว) และเม็ดเซลล์ปรสิต (รูป. 2A, แถวที่สาม) สำหรับเนื้อหาของพวกเขาโดย MIC2 เวสเทิร์ซับ Micronemes ถูกปล่อยในรอบ 1 ปล่อย 2,467.8% (mean6SD, n ?? 4) แห่ง MIC2 โทรศัพท์มือถือรวม; แต่ไม่มีการปล่อยต่อไปเกิดขึ้นในช่วงใด ๆ ของรอบถัดไป แม้ว่าที่ละลายน้ำได้ MIC2 ถูกนำเสนอใน supernatants ของวงจร 2 * เพราะยกยอดจากวงจร 1 ไม่มีการเปิดตัวต่อไปเกิดขึ้นและเซลล์เหล่านี้ยังคงไม่รุกราน ผลที่ได้รับเหมือนกันสำหรับ MIC4 (datanotshown) suggestingthattemperaturecycling ได้รับผลกระทบการหลั่ง microneme ทั่วไป ที่จะออกกฎความเป็นไปได้ว่าการรักษานี้ได้รับผลกระทบฟังก์ชั่นหลั่งอื่น ๆ ที่เราตรวจสอบเม็ดหนาแน่นและการหลั่ง rhoptry และองค์ประกอบของโปรตีนผิวในระหว่างการรักษา เราสังเกตเห็นการเปลี่ยนแปลงในการหลั่งsigni®cantเม็ดหนาแน่นและการหลั่ง rhoptry อีกครั้งตรวจไม่พบ (ไม่ได้แสดงข้อมูล) นอกจากนี้ไม่มีการเปลี่ยนแปลงในโปรตีนผิว biotinlabelled รวมทั้งสามลักษณะแอนติเจนก่อนหน้านี้ (1 SAGs ± 3) (รูป. 2B) ถูกตั้งข้อสังเกต ผลที่ได้นี้แสดงให้เห็นว่าผลการบุกรุกลดอุณหภูมิของการขี่จักรยานที่ไม่ได้เกิดจากการเปลี่ยนแปลงการแสดงออกหรือmodi®cationของไกลโคโปรตีนผิวที่สำคัญ นอกจากนี้ผลกระทบของการขี่จักรยานอุณหภูมิไม่ได้มีชีวิตที่เกี่ยวข้องกับการลดลงเป็นปรสิตที่ได้รับอนุญาตในการกู้คืนสำหรับ 4h คืนความสามารถในการที่จะบุกเซลล์โฮสต์และหลั่งโปรตีน micronemal (รูป. 2A แถว®rst) การฟื้นฟูของการบุกรุกและการปล่อย micronemal ทั้งสอง cyclohexamide ขึ้นอยู่กับความต้องการแนะนำสำหรับการสังเคราะห์โปรตีน (รูป. 2A) บวกกับ®ndingsข้างต้นผลลัพธ์เหล่านี้บ่งบอกว่าปรสิตเดียวที่มีความกระตือรือร้นในการหลั่งโปรตีน micronemal มีความสามารถในการบุกรุกเซลล์โฮสต์

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

เมื่อสดแยกเซลล์ถูกเก็บรักษาไว้ที่ 378c Toxoplasma ในการขาดงานของเซลล์โฮสต์พวกเขาอย่างรวดเร็วสูญเสียความสามารถในการบุกรุกเซลล์โฮสต์ ( ข้อมูลไม่แสดง ) , ชี้ให้เห็นว่าปัจจัยที่ไกล่เกลี่ยการบุกรุกที่ชั่วคราว . เพื่อศึกษาปรากฏการณ์นี้ต่อไป เราสัมผัสกับวงจรชีวิตของพยาธิซ้ำบ่ม 378c สำหรับวันที่ ,และตามด้วยปั่น resuspension ปานกลาง สด ในแต่ละรอบ supernatants วิเคราะห์โดย Western blotting และปรสิต ทดสอบการรุกรานของเซลล์โฮสต์ monolayers . ปรสิตสามารถบุกในช่วงฤดูกาลที่ 1 แต่ไม่ในใด ๆของรอบถัดไป ( รูปที่ 2 ด้านบน ) เมื่อปรสิตจากรอบ 2 resuspended โดยไม่ต้องเอารอบสูง 1 ,พวกเขายังไม่สามารถบุก ( กล่าวคือ เป็น 2 * infig . 2 ) ความเป็นไปได้ที่บกพร่องในหน้าที่ของ eliminatingthe ต่อไปเป็นเพียงผลของการหลั่งในวัฒนธรรมที่ปัจจัยนำในรอบ 1 เพื่อทดสอบว่าอัตราการสูญเสียของการติดเชื้อมีความสัมพันธ์กับ microneme หลั่ง เราวิเคราะห์ supernatants ( รูปที่ 2A , วัฒนธรรมแถวที่สอง ) และปรสิตเซลล์เม็ด ( รูปที่ 2A , แถวที่สาม ) สำหรับเนื้อหาของ mic2 โดย Western blotting . micronemes ถูกไล่ออกในรอบ 1 , ปล่อย 2467.8 % ( mean6sd N ˆ 4 ) ของจำนวนเซลล์ mic2 อย่างไรก็ตาม ไม่มีการเกิดขึ้นในช่วงใดของวงจรชีวิตที่ตามมา แม้ว่า mic2 ละลายอยู่ใน supernatants ของรอบ 2 * * * * เพราะคงไปจากวงจรที่ 1