2.6. Protein extraction and Western

2.6. Protein extraction and Western blot
Total protein was extracted from granulosa cells of
preovulatory follicles and from granulosa cells treated
with different concentrations of resveratrol by protein
extraction reagents. Protein concentration was measured
by Bio-Rad protein assay reagent (Bio-Rad Lab., Hercules,
CA, USA). Protein was separated by using SDS-PAGE
on a 5–8% Tris–glycine gel, transferred to a polyvinylidene
fluoride membrane (Millipore Corporation, Billerica,
MA), and incubated with SIRT1 antibody (1:500 dilution;
Abcam, Cambridge, MA). The secondary antibody (goat
anti-rabbit IgG antibody, Santa Cruz Biotechnology, Santa
Cruz, CA) was diluted 2000-fold. All incubations wereperformed in Tris–HCl buffer (pH 7.5) with 0.1% Tween
20 and 5% dry milk. Immunodetection was performed
by using enhanced chemiluminescence Western blot substrate
(Pierce Biotechnology Inc., Rockford, IL, USA). Signal
intensity was determined (Bandscan 4.5, Dulakshi Co., San
Ramon, CA), and means were calculated for each treatment.
2.7. Cell apoptosis assay
Granulosa cell apoptosis was measured by Annexin
V-EGFP Apoptosis Detection Kit (Kaiji Bio, Nanjing, PR
China) via flow cytometry. Granulosa cells were treated
with resveratrol (10, 25, 50, 75, 100 M/l) and control
were harvested. The procedure was performed as follows:
1 × l06 cells were collected and washed twice with
PBS, then resuspended in 500 l binding buffer (10 mM
HEPES/NaOH, pH 7.4, 140 mM NaCl, 2.5 mM CaCl2). 5 l
FITC-Annexin V was added and mixed sufficiently, 5 l PI
was added after mixing. The mixture was incubated for
10 min in the dark at room temperature and then measured
by flow cytometry.
2.8. Statistical analysis
All results are expressed as mean ± SEM. All statistical
analyses were performed using GraphPad Prism 5
Fi(GraphPad Software Inc., San Diego, CA). T-test was used to
compare two groups, and a one-way ANOVA was used for
more than two groups, with Tukey’s range test applied for
multiple comparisons. P < 0.05 was considered to be statistically
significant and designated “*”; and P < 0.01 was
designated “**”. Different letters indicate significant differences.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

2.6 การโปรตีนสกัดและคืนในตาตะวันตกรวมโปรตีนที่สกัดจากเซลล์ granulosaรูขุมขน preovulatory จากเซลล์ granulosa ถือว่ามีความเข้มข้นแตกต่างกันจำนวนมาก resveratrol โดยโปรตีนreagents สกัด เป็นวัดความเข้มข้นของโปรตีนโดย Rad ชีวภาพการรีเอเจนต์ทดสอบโปรตีน (ห้องปฏิบัติการชีวภาพ Rad เฮอร์คิวลิสCA, USA) มีแยกโปรตีนโดย SDS-หน้าบนเจตรี – glycine 5 – 8% โอนย้ายไป polyvinylideneเมมเบรนฟลูออไรด์ (บริษัทมาก BillericaMA), และ incubated กับ SIRT1 แอนติบอดี (เจือจาง 1: 500Abcam เคมบริดจ์ MA) แอนติบอดีรอง (แพะป้องกันกระต่ายแอนติบอดี IgG เทคโนโลยีชีวภาพซานตาครูซ ซานตาครูซ CA) ถูกผสม 2000-fold Wereperformed incubations ทั้งหมดในตรี – HCl บัฟเฟอร์ (pH 7.5) 0.1% Tween20 และ 5% แห้งนม ทำ Immunodetectionโดยเพิ่ม chemiluminescence ตะวันตกทำลายพื้นผิว(เจาะ Inc. เทคโนโลยีชีวภาพ ร็อคฟอร์ด IL สหรัฐอเมริกา) สัญญาณกำหนดความเข้ม (ซาน Bandscan 4.5, Dulakshi Co.Ramon, CA), และวิธีคำนวณได้สำหรับแต่ละการ2.7 การเซลล์ apoptosis วิเคราะห์Granulosa เซลล์ apoptosis ถูกวัด ด้วย Annexinชุดตรวจจับ Apoptosis V-EGFP (ไบโอ Kaiji หนานจิง PRจีน) ผ่านเซลล์ไหล Granulosa เซลล์ได้รับการรักษามีจำนวนมาก resveratrol (10, 25, 50, 75, 100 M/l) และการควบคุมได้เก็บเกี่ยว ทำขั้นตอนดังนี้:รวบรวม และล้างสองครั้งด้วยเซลล์ l06 1 ×PBS, resuspended แล้ว ในบัฟเฟอร์รวม 500 l (10 มม.HEPES/NaOH, pH 7.4, 140 มม. NaCl, 2.5 mM CaCl2) 5 lเพิ่ม และผสมพอ l 5 ปี่ FITC Annexin Vมีเพิ่มหลังจากการผสม ส่วนผสมคือ incubated สำหรับ10 นาทีในมืดที่อุณหภูมิห้อง และที่วัดแล้วโดยขั้นตอนเซลล์2.8. สถิติวิเคราะห์ผลลัพธ์ทั้งหมดจะแสดงเป็นหมายถึง ± SEM. สถิติทั้งหมดวิเคราะห์ได้ดำเนินการโดยใช้ 5 ปริซึม GraphPadไร้สาย (GraphPad ซอฟต์แวร์ Inc., San Diego, CA) ใช้ T-ทดสอบเปรียบเทียบ 2 กลุ่ม และใช้สำหรับวิเคราะห์ความแปรปรวนแบบทางเดียวมากกว่า 2 กลุ่ม กับการทดสอบช่วงของ Tukey ที่ใช้สำหรับเปรียบเทียบหลาย P < 0.05 ถือเป็นไปได้ทางสถิติอย่างมีนัยสำคัญ และกำหนด " * "; และ P เป็น < 0.01กำหนด " ** " ตัวอักษรต่าง ๆ บ่งชี้ความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญ

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

2.6 การสกัดโปรตีนและตะวันตก blot
รวมโปรตีนสกัดจากเซลล์ granulosa ของ
รูขุม preovulatory และจากเซลล์ granulosa รับการรักษา
ที่มีความเข้มข้นแตกต่างกันของ resveratrol โดยโปรตีน
สารสกัด ความเข้มข้นของโปรตีนวัด
โดย Bio-Rad โปรตีนน้ำยาทดสอบ (Bio-Rad Lab., ดาว,
CA, USA) โปรตีนที่ถูกแยกออกจากกันโดยใช้ระบบ SDS-PAGE
ใน 5-8% ทริสเจล-glycine ย้ายไป Polyvinylidene
เมมเบรนฟลูออไร (คคอร์ปอเรชั่นบิลเลริกา,
แมสซาชูเซต) และบ่มกับแอนติบอดี SIRT1 (1: 500 เจือจาง;
Abcam, เคมบริดจ์ ) แอนติบอดีรอง (แพะ
ต่อต้านกระต่ายแอนติบอดี IgG ซานตาครูซเทคโนโลยีชีวภาพซานตา
ครูซ, แคลิฟอร์เนีย) ถูกเจือจาง 2,000 เท่า ฟักตัวของเชื้อทั้งหมด wereperformed ในบัฟเฟอร์ Tris-HCl (pH 7.5) 0.1% Tween
20 และ 5% นมแห้ง ภูมิคุ้มกันที่ได้ดำเนินการ
โดยใช้การปรับปรุงพื้นผิว chemiluminescence ดวงตะวัน
(เพียร์ซเทคโนโลยีชีวภาพอิงค์ฟอร์ด, อิลลินอยส์, สหรัฐอเมริกา) สัญญาณ
ความรุนแรงที่ถูกกำหนด (Bandscan 4.5 Dulakshi Co. , ซาน
ราโมน, CA) และวิธีการคำนวณในการรักษาแต่ละ.
2.7 ทดสอบการตายของเซลล์
granulosa การตายของเซลล์โดยวัดจาก Annexin
V-EGFP Apoptosis ตรวจจับ Kit (Kaiji Bio, หนานจิง, PR
จีน) ผ่านโฟ granulosa เซลล์ได้รับการรักษา
ด้วย resveratrol (10, 25, 50, 75, 100 M / ลิตร) และการควบคุมการ
เก็บเกี่ยว ขั้นตอนการดำเนินการดังต่อไปนี้
1 × L06 เซลล์ที่ถูกเก็บรวบรวมและล้างครั้งที่สองกับ
พีบีเอสแล้ว resuspended ใน 500 ลิตรมีผลผูกพันบัฟเฟอร์ (10 มิลลิ
HEPES / NaOH พีเอช 7.4, 140 มิลลิโซเดียมคลอไรด์ 2.5 มิลลิ CaCl2) 5 ลิตร
FITC-V Annexin ถูกบันทึกและผสมพอ 5 ลิตร PI
ถูกเพิ่มเข้ามาหลังจากผสม ส่วนผสมที่ถูกบ่มเป็นเวลา
10 นาทีในที่มืดที่อุณหภูมิห้องและวัดแล้ว
โดยโฟ.
2.8 การวิเคราะห์ทางสถิติ
ผลทั้งหมดจะแสดงเป็นค่าเฉลี่ย± SEM ทุกสถิติ
การวิเคราะห์ถูกดำเนินการโดยใช้ปริซึม GraphPad 5
Fi (GraphPad ฟแวร์อิงค์, ซานดิเอโก) t-test ถูกใช้ในการ
เปรียบเทียบสองกลุ่มและทางเดียว ANOVA ที่ใช้สำหรับการ
มากกว่าสองกลุ่มที่มีการทดสอบช่วงของ Tukey นำมาใช้สำหรับ
การเปรียบเทียบหลาย P <0.05 ถือว่าเป็นสถิติ
ที่สำคัญและกำหนด "*"; และ P <0.01 ได้รับการ
กำหนด "**" ตัวอักษรที่แตกต่างกันบ่งบอกถึงความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญ

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

The pagoda four reign. The pagoda is the reign of four him, all of which he was born in time and see each other, is enshrined at the Wat Phra chetuphon wimon mang Clara. History of the pagoda or Wat Pho, four days.The pagoda four reign. The pagoda is the reign of four him, all of which he was born in time and see each other, is enshrined at the Wat Phra chetuphon wimon mang Clara. History of the pagoda or Wat Pho, four days.The pagoda four reign. The pagoda is the reign of four him, all of which he was born in time and see each other, is enshrined at the Wat Phra chetuphon wimon mang Clara. History of the pagoda or Wat Pho, four days.The pagoda four reign. The pagoda is the reign of four him, all of which he was born in time and see each other, is enshrined at the Wat Phra chetuphon wimon mang Clara. History of the pagoda or Wat Pho, four days.The pagoda four reign. The pagoda is the reign of four him, all of which he was born in time and see each other, is enshrined at the Wat Phra chetuphon wimon mang Clara. History of the pagoda or Wat Pho, four days.The pagoda four reign. The pagoda is the reign of four him, all of which he was born in time and see each other, is enshrined at the Wat Phra chetuphon wimon mang Clara. History of the pagoda or Wat Pho, four days.