Assays. Vitamin K epoxide reductase

Assays. Vitamin K epoxide reductase activity was measured in microsomes resuspended in SI buffer. Vitamin K, 2,3-epoxide (vitamin K,
epoxide) in 10 Al 95% ethanol was added to 0.5 ml of the microsomal
suspension. After preincubation for 1 min, 20 MI DTT in SI buffer was
added and the suspension incubated in open tubes under the various
conditions described in the text. When DTT was added to the test system
before vitamin K epoxide, preincubation was also carried out for 1 min.
Reactions were stopped by the addition of 1 ml isopropanol/hexane (3:
2:vol/wt) and mixed into the test system using a vortex mixer. The mixture
was subjected to a brief centrifugation. 300 AI of the upper hexane phase
was removed and evaporated to dryness at room temperature. The residue
was dissolved in 100 Ml of isopropanol and 20 MI was analyzed by high
performance liquid chromatography (HPLC) using a Rainin gradient
system equipped with a Gilson 704 HPLC system manager. Separation
was achieved on a Rainin Microsorb Short C18 reversed-phase column
in 100% methanol. Absorbance of eluting materials was measured at
254 nm with an ISCO UM-5 detector equipped with an ISCO HPLC
10-Ml flow cell. Retention times for vitamin K1 and vitamin K, epoxide
were 5.8 and 3.6 min, respectively, at a flow rate of 2 ml/min. Quantitation
was based on the integrated absorption peaks when compared with peaks
from standards of vitamin K1 and vitamin K1 epoxide. Reduced vitamin
K1 was not measured in our system. Enzymatically reduced vitamin K1
was reoxidized to the quinone before being analyzed on HPLC. Reoxidation
was achieved by evaporation of the hexane layers in open tubes
over night at room temperature in the dark. Reoxidation of chemically
reduced vitamin K1 served as control. Reduced vitamin K1 (100 MM)
was added to control incubations. These were extracted immediately
with hexane, and these extracts were allowed to evaporate over night
together with the test samples. No nonenzymatic reduction of vitamin
K1 epoxide occurred in the hexane phases. Control samples from zero
time incubations contained no vitamin K1.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

Assays วิตามิน K epoxide reductase กิจกรรมที่วัดใน microsomes resuspended ในบัฟเฟอร์ SI วิตามิน K, 2,3-epoxide (วิตามิน Kepoxide) ใน 10 อัล 95% เอทานอลถูกเพิ่มเข้าไป 0.5 ml ของ microsomal ที่ระบบกันสะเทือน หลังจากที่ถูก preincubation ใน 1 นาที 20 MI DTT ในบัฟเฟอร์ SIเพิ่ม และการระงับ incubated ในท่อเปิดภายใต้การเงื่อนไขข้อความอธิบาย เมื่อมีเพิ่มระบบทดสอบ DTTก่อนวิตามิน K epoxide, preincubation ยังทำออกมาใน 1 นาทีมีหยุดปฏิกิริยาด้านนอก 1 ml isopropanol/โพ ลี (3:2:vol / wt) และแบบผสมเป็นระบบทดสอบที่ใช้ผสม vortex ส่วนผสมถูกยัดเยียดให้ centrifugation โดยสังเขป 300 ไอระยะบนโพลีถูกเอาออก และหายไปกับความแห้งกร้านที่อุณหภูมิห้อง สารตกค้างถูกละลายใน 100 Ml ของ isopropanol และ 20 MI ถูกวิเคราะห์ โดยสูงประสิทธิภาพของเหลว chromatography (HPLC) ใช้ไล่ Raininระบบพร้อมผู้จัดการระบบ Gilson 704 HPLC แยกสำเร็จในคอลัมน์ระยะกลับ Rainin Microsorb สั้น C18ในเมทานอล 100% มีวัด absorbance ของ eluting วัสดุที่254 nm ด้วยการจับ ISCO UM-5 พร้อมการ HPLC ISCOเซลล์กระแส 10 Ml เวลารักษาเควันวิตามิน และวิตามิน K, epoxideได้ 5.8 และ 3.6 นาที ตามลำดับ ที่อัตราการไหลของการวิเคราะห์หาปริมาณ 2 ml/นาทีเป็นไปตามยอดเขาดูดซึมรวมเมื่อเปรียบเทียบกับยอดจากมาตรฐานของเควันวิตามินและวิตามินเควัน epoxide วิตามินลดลงไม่ได้วัด K1 ในระบบของเรา เควันวิตามินลด enzymaticallyถูก reoxidized ไป quinone ก่อนถูกวิเคราะห์ใน HPLC Reoxidationสำเร็จ โดยการระเหยของชั้นเฮกเซนในท่อเปิดข้ามคืนที่อุณหภูมิห้องในมืด Reoxidation ของสารเคมีเควันวิตามินลดลงทำหน้าที่เป็นตัวควบคุม เควันวิตามินลดลง (100 MM)มีเพิ่มการควบคุม incubations เหล่านี้ถูกสกัดทันทีด้วยเฮกเซน และสารสกัดเหล่านี้ได้รับอนุญาตให้ระเหยข้ามคืนร่วมกับตัวอย่างทดสอบ ไม่ลด nonenzymatic ของวิตามินK1 epoxide เกิดขึ้นในระยะของเฮกเซน ตัวอย่างการควบคุมจากศูนย์incubations เวลาประกอบด้วยวิตามินเควันไม่

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

การตรวจ วิตามินเคกิจกรรม reductase อิพอกไซด์วัดในไมโคร resuspended ในบัฟเฟอร์ SI วิตามิน K, 2,3-อิพอกไซด์ (วิตามินเค
อิพอกไซด์) ใน 10 อัลเอทานอล 95% ถูกบันทึกอยู่ใน 0.5 มิลลิลิตรของไมโคร
ระงับ หลังจาก preincubation เวลา 1 นาที, 20 MI DTT ในบัฟเฟอร์ SI ถูก
เพิ่มและระงับการบ่มในหลอดเปิดภายใต้การต่างๆ
เงื่อนไขที่ระบุไว้ในข้อความ เมื่อ DTT ถูกบันทึกอยู่ในระบบการทดสอบ
ก่อนที่จะวิตามินเคอิพอกไซด์, preincubation ได้รับการดำเนินการยังออกเป็นเวลา 1 นาที.
ปฏิกิริยาก็หยุดโดยนอกเหนือจาก 1 มิลลิลิตร isopropanol / เฮกเซน (3:
2: ปริมาตร / น้ำหนัก) และผสมลงในระบบการทดสอบโดยใช้ ผสมน้ำวน ส่วนผสมที่
ถูกยัดเยียดให้การหมุนเหวี่ยงสั้น ๆ 300 AI ของเฟสเฮกเซนบน
จะถูกลบออกและระเหยจนแห้งที่อุณหภูมิห้อง ที่เหลือ
ก็เลือนหายไปใน 100 มล isopropanol และ 20 ไมล์ได้รับการวิเคราะห์โดยสูง
ของเหลว chromatography ประสิทธิภาพ (HPLC) โดยใช้การไล่ระดับสี Rainin
ระบบพร้อมกับ Gilson 704 HPLC ผู้จัดการระบบ แยก
ก็ประสบความสำเร็จใน Rainin Microsorb สั้น C18 คอลัมน์ย้อนกลับเฟส
ในเมทานอล 100% การดูดกลืนแสงของวัสดุเคลือบวัดที่
254 นาโนเมตรที่มี ISCO UM-5 เครื่องตรวจจับพร้อมกับ ISCO HPLC
เซลล์ไหล 10 มิลลิลิตร เวลาการเก็บรักษาสำหรับวิตามิน K1 และวิตามินเคอิพอกไซด์
เป็น 5.8 และ 3.6 นาทีตามลำดับที่อัตราการไหล 2 มิลลิลิตร / นาที ปริมาณ
ขึ้นอยู่กับยอดการดูดซึมแบบบูรณาการเมื่อเทียบกับยอด
จากมาตรฐานของวิตามิน K1 และวิตามิน K1 อิพอกไซด์ วิตามินลด
K1 ไม่ได้วัดในระบบของเรา เอนไซม์ลดลงวิตามิน K1
ถูก reoxidized เพื่อ quinone ก่อนที่จะถูกนำมาวิเคราะห์ใน HPLC Reoxidation
ก็ประสบความสำเร็จจากการระเหยของชั้นเฮกเซนในท่อเปิด
ข้ามคืนที่อุณหภูมิห้องในที่มืด Reoxidation ของสารเคมี
ลดลงวิตามิน K1 ทำหน้าที่เป็นผู้ควบคุม ลดวิตามิน K1 (100 มิลลิเมตร)
ถูกเพิ่มเข้ามาในการควบคุมการฟักตัวของเชื้อ เหล่านี้ถูกสกัดทันที
ด้วยเฮกเซนและสารสกัดเหล่านี้ได้รับอนุญาตให้ระเหยไปคืน
พร้อมกับตัวอย่างทดสอบ ไม่มีการลด nonenzymatic ของวิตามิน
อีพอกไซด์ K1 เกิดขึ้นในขั้นตอนเฮกเซน ตัวอย่างการควบคุมจากศูนย์
ฟักตัวของเชื้อที่เวลามีวิตามิน K1 ไม่มี

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

) . วิตามินเค epoxide เอนไซม์ถูกวัดในจังหวัด resuspended ความเร็วในบัฟเฟอร์ วิตามิน K , 2,3-epoxide ( วิตามิน K ,
epoxide ) ในเอทานอล 10 ล 95% เพิ่ม 0.5 ml ของช่วงล่างเพิ่ม

หลังจากที่พบใน 1 นาที , 20 มี 20 จังหวัดในบัฟเฟอร์
เพิ่มและช่วงล่าง ) เปิดท่อภายใต้เงื่อนไขต่างๆ
อธิบายไว้ในข้อความเมื่อส่วนเพิ่มเพื่อทดสอบระบบ
ก่อนที่วิตามินเค epoxide , พบได้ 1 นาที
ปฏิกิริยาถูกหยุดโดยการเพิ่มของไอโซโพรพานอล / น้ำ 1 มล. ( 3 :
2 : Vol / WT ) และผสมลงในระบบที่ใช้ทดสอบ vortex mixer . ส่วนผสม
คือต้องปั่นสั้นๆ 300 ไอบนเฟส
ถูกลบออกและสารระเหยแห้งที่อุณหภูมิห้องกาก
ละลายใน 100 มิลลิลิตร และไอโซโพรพานอล 20 มิถูกวิเคราะห์โดยวิธีโครมาโทกราฟีของเหลวสมรรถนะสูง ( HPLC )

ระบบการใช้ rainin พร้อมกับ Gilson 704 HPLC ระบบผู้จัดการ แยก
สําเร็จในคอลัมน์ rainin microsorb สั้น c18 reversed-phase
100 % เมทานอล การดูดกลืนแสงของวัสดุที่ถูกวัดที่
hexane254 nm ด้วย isco um-5 เครื่องพร้อมกับ isco 2
10 มิลลิลิตร อัตราการไหลของเซลล์ เวลาการเก็บรักษาสำหรับวิตามิน K1 และวิตามิน K epoxide
คือ 5.8 และ 3.6 นาที ตามลำดับ ที่อัตราการไหล 2 มล. / นาที เซลล์
ขึ้นอยู่กับแบบดูดกลืนยอดเมื่อเทียบกับยอด
จากมาตรฐานของวิตามิน K1 และวิตามิน K1 epoxide ลดวิตามิน K1
ไม่ได้วัดในระบบของเราenzymatically ลดวิตามิน K1
คือ reoxidized กับควิโนนก่อนการใช้ HPLC . reoxidation
ทําได้โดยการระเหยของน้ำในท่อชั้นเปิด
ค้างคืนที่อุณหภูมิห้อง ในที่มืด reoxidation ของเคมี
ลดวิตามิน K1 ทำหน้าที่ควบคุม ลดวิตามิน K1 ( 100 มม. )
เพิ่มการควบคุม incubations . เหล่านี้ทันที
ถูกสกัดด้วยเฮกเซนและสารสกัดเหล่านี้ได้รับอนุญาตให้ระเหยทั้งคืน
ด้วยกันกับตัวอย่างทดสอบ ไม่ลด nonenzymatic วิตามิน
K1 วอมแวมเกิดในน้ำขั้นตอน ตัวอย่างควบคุมจากศูนย์
incubations ที่มีอยู่ไม่มีวิตามิน K1 .