Lin-Yi Meng et al3484 Asian Pacific

Lin-Yi Meng et al
3484 Asian Pacific Journal of Cancer Prevention, Vol 13, 2012
We found that ECMS induces cell cycle G2/M arrest and
apoptosis by decreasing PI3K/Akt signaling.
Materials and Methods
Materials and reagents
Cochinchina momordica seed was purchased from an
herb market in China. Fetal bovine serum (FBS), RPMI
1640 medium, penicillin G, streptomycin and trypsin
were obtained from the Invitrogen Corporation, USA.
Dimethyl sulfoxide (DMSO) and ribonuclease (RNase)
were purchased from Sigma Chemical, USA. The
3-(4, 5)-dimethylthiahiazo (-z-y1) -3, 5-di-phenytetra-
zoliumromide (MTT) was purchased from AMRESCO
Inc., USA. Hoechst staining kit, Cell cycle analysis
kit, Apoptosis analysis kit, BCA protein analysis kit
and Propidium iodide (PI) agents were purchased from
Beyotime, China. The PVDF membranes were purchased
from Millipore Corporation, Massachusetts, USA. The
polyclone antibodies to PI3K, Akt, NF-κB, caspase-3,
Bax and Bcl-2 were purchased from Cell Signaling, USA.
Preparation of the extract
500 ml of 62% ethanol solution were added to 150 g
(dry weight) of Cochinchina momordica seed flour and
the extract was obtained from a cold soak for 24 h. Then
the extract was refluxed and filtered for 1 h. Collect the
filtrate and added 160 ml of 62% ethanol solution into the
residue. Duplicate the above processes and combine the
filtrates. Add the filtrates into the wet macroporous resin
column. The full absorption in the resin after the resin three
times, the volume of 30%, 50%, 70%, 90% concentration
of ethanol was eluted. Combine and freeze dry the eluent
for ECMS.
Cancer cell line and culture
Human breast cancer MDA-MB-231 cells obtained
from Shanghai Institute for Biological Sciences, China,
and cultured in DMEM medium supplemented with 10%
(v/v) heat-inactivated fetal bovine serum (FBS) and 100
IU/ml penicillin, 100 mg/ml streptomycin, kept at 37℃
in a humidified 5% CO2
incubator. Cells were passaged
every 2-3 days and always used at about 80-90% of the
confluence at passages between 3 and 20 after defreezing.
They were seeded into different culture plates or dishes
at a corresponding density for the respective assays.
Cell proliferation assay
The cell proliferation was measured by MTT method.
Briefly, MDA-MB-231 cells were collected and seeded
in 96-well plates at a density of 5×103
cells/well, and
treated with phosphate buffered saline (PBS), various
concentrations of ECMS and positive control factor,
5-fluorouracil. After incubation for 24 h, 48 h or 72 h, the
medium was removed and replaced with a fresh medium
(180 µl/well). 20 µl of MTT solution (5 mg/ml) added to
each well and the plates were incubated for additional 4 h
at 37℃. Then, the medium was aspirated off, and 150 µl of
DMSO were added to each well. The absorbance was read
at 570 nm as test wavelengths using a microplate reader
(TECAN Infinite 200). Cell viability was expressed as a
percentage of the untreated cells.
Nuclear staining with Hoechst 33258
MDA-MB-231 cells were seeded in 24-well plates at
a density of 5×103
cells/well, and incubated with ECMS
(0.1, 0.2 and 0.4 mg/ml) for 48h. Cellular monolayer in 24-
well plates was fixed and stained with DNA fluorochrome
Hoechst 33258 for 20 min. After washed with PBS, the
morphological features of apoptosis (including cellular
nucleus shrinkage, chromatin condensation, intense
fluorescence and nuclear fragmentation) were monitored
by fluorescence microscopy (Zeiss, German).
Measurement of apoptosis by Annexin V-FITC/PI staining
Flow cytometry was used to quantitatively detect the
apoptotic rate. Cells (5×103
/well) were seeded into 6-well
plates and exposed to ECMS at various concentrations
(0.1, 0.2 and 0.4 mg/ml) for 48 h, and then harvested and
washed with phosphate buffered saline (PBS). Staining
went along with 195 µl bonding buffer containing 5 µl
Annexin V-FITC in the dark at room temperature for 10
min, and then added 10 µl PI in the dark 4℃ for 10 min.
The apoptotic cells were analyzed with FACScan flow
cytometry (BD FACSCalibur).
Analysis of cell cycle by PI staining
Cells (3×105
/well) were seeded into 6-well plates and
exposed to ECMS at various concentrations (0.1, 0.2 and
0.4 mg/ml) for 48 h, and then harvested and washed with
PBS, fixed in 70% ethanol at 4℃. Staining went along
with PBS containing 40 (g/ml RNaseA and 10 µg/ml
PI in the dark at room temperature for 30 min. The cell
cycle was measured using FACScan Flow cytometry (BD
FACSCalibur).
Western blotting assay
When administration with ECMS (0.1, 0.2, 0.3 mg/
ml) for 48 h, MDA-MB-231 cells were collected and
homogenized in 200 µl RIPA lysis buffer. Cell lysate was
centrifuged (12,000×g for 15 min at 4°C) and protein
concentration was determined by the BCA protein
assay kit. Equal amounts of protein were denatured and
separated by 10% SDS-PAGE, then transferred onto
PVDF membranes using a Bio-Rad miniprotein-III wet
transfer unit. Nonspecific binding was blocked with
5% bovine serum albumin dissolved in TBST at room
temperature for 1 h. Subsequently, the membranes were
then washed three times and incubated with individual
primary antibodies of PI3K, Akt, NF-κB, Bax, Bcl-
2, Cdk1, Cyclin B1 and caspase-3 at 4°C over night.
The membranes were incubated with the horseradish
peroxidase-conjugated anti-rabbit IgG secondary antibody
for 1 h at room temperature followed by three washings.
The signals were detected with a chemiluminescence
ECL reagent and quantified by densitometry using a gel
visualizer (Alpha Innotech, CA, USA). GAPDH served
as the loading control, and the results were expressed as
the percentage of control.
Statistical analysis
The data were expressed as means (standard errors of

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

หลินยี่เม้ง et al, 3484 ฉบับที่ 13, 2012 เราพบว่า ECMS แท้จริงจับรอบเซลล์ G2 / M และการตายของเซลล์สตาร์ทPI3K / Akt ปกติตามวัสดุและวิธีหัวเรื่อง: การวัสดุและสารเคมีเมล็ดสมุนไพรโคชิน (FBS) RPMIกลางค. ศ 1640 ยาเพนนิซิลลิน G, streptomycin ริทและปซินได้รับมาจากเนชั่ บริษัท บริษัท Invitrogen สหรัฐอเมริกา Dimethyl sulfoxide (DMSO) และ ribonuclease (RNase) ซื้อจากเนชั่ซิกเคมีสหรัฐอเมริกาที่ 3 (4, 5) -dimethylthiahiazo (- ซี - y1) -3, 5 ดิ -phenytetra - zoliumromide (MTT) ที่ซื้อจาก AMRESCO อิงค์สหรัฐอเมริกาอย่างไร Hoechst ชุดสีย้อมวิเคราะห์วงจรเซลล์ชุดชุดวิเคราะห์Apoptosis ชุดวิเคราะห์โปรตีนเก็บกวาดและซื้อจากตัวแทนPropidium ไอโอไดด์ (PI) Beyotime ประเทศจีนซื้อสาร PVDF จากเนชั่ บริษัท บริษัท มากรัฐแมสซาชูเซตส์สหรัฐอเมริกาที่แอนตี้ polyclone PI3K, สิ้นคิด, NF-κB, caspase-3 แบ็กซ์และ Bcl 2 ถูกซื้อจากเซลล์ตามปกติ 500 มล. 62% ของเอทานอลได้เพิ่ม 150 กรัม (น้ำหนักแห้ง) ของแป้งเมล็ดสมุนไพรโคชินและสารสกัดได้รับจากเนชั่แช่เย็นใน24 ชมแล้ว refluxed ชั่วโมงและ 1 คัดแยกรวบรวมจะสารกรองและเพิ่ม160 มล. ของเอทานอล 62% เป็นสารตกค้างทำซ้ำขั้นตอนข้างคุณต้นและรวมหัวเรื่อง: การfiltrates เพิ่ม filtrates ที่เป็นยาง macroporous ปริมาณ 30%, 50%, 70% ความเข้มข้น 90% ของเอทานอลที่ชะรวมและแห้งตรึงชะสำหรับ MDA-MB-231 เต้านมมนุษย์ที่ได้รับจากเนชั่สถาบันวิทยาศาสตร์ชีวภาพจีนเซี่ยงไฮ้และอ่างใน DMEM เสริมด้วย 10% (v / v) ยกเลิกความร้อนครรภ์วัวซีรั่ม (FBS) และ 100 ยาเพนนิซิลลิน IU / ml 100 มิลลิกรัม / ml streptomycin เก็บไว้ที่ 37 ℃ในความชื้น5% CO2 บ่มเพาะวิสาหกิจเซลล์ถูก passaged ทุก 2-3 วันและมักจะใช้ประมาณ 80-90% หัวเรื่อง: การของบรรจบที่ทางเดินระหว่าง3 และ 20 หลังจาก defreezing พวกเขาถูกเมล็ดแผ่น วัฒนธรรมต่าง ๆ การตรวจ ด้วยวิธี MTT สั้น ๆ รวบรวมและเมล็ดเซลล์ MDA-MB-231 ในดี 96 แผ่นที่ความหนาแน่นของ 5 × 103 เซลล์ / และดีรักษาด้วยน้ำเกลือฟอสเฟตบัฟเฟอร์(พีบีเอส) ๆ ต่างความเข้มข้นของECMS และปัจจัยควบคุมบวก 5 fluorouracil หลังจากบ่ม 24 ชั่วโมง, 48 ชั่วโมงหรือ 72 ชั่วโมงหัวเรื่อง: การเอาออกและแทนที่ด้วยสื่อสดกลาง (180 ไมโครลิตร / ดี) เพิ่ม 20 ไมโครลิตรของ MTT (5 mg / ml)แต่ละบ่อและแผ่นถูกบ่มสำหรับชั่วโมง 4 เพิ่มเติมที่37 ℃ แล้วสำลักการสื่อปิดและ 150 ไมโครลิตรของเพิ่มDMSO ให้ดีละกันดูดซับถูกอ่านที่ที่ 570 นาโนเมตรเป็นความยาวคลื่นทดสอบใช้อ่าน microplate (TECAN 200 ด้วยอย่างไร Hoechst 33258 นิวเคลียร์MDA-MB-231 เซลล์ถูกเมล็ดในดี 24 แผ่นที่ความหนาแน่นของ5 × 103 เซลล์ / ดีและบ่มกับ ECMS (0.1, 0.2 และ 0.4 mg / ml) สำหรับ 48h monolayer โทรศัพท์มือถือใน 24ถาวร และสีกับดีเอ็นเอของสารเรืองแสงแผ่นทั้งอย่างไรHoechst 33258 สำหรับ 20 นาทีความสามารถในหลังจากล้างด้วยพีบีเอสหัวเรื่อง:การลักษณะสัณฐานของการตาย (ทั้งมือรวมถือหดตัวนิวเคลียสโครมาตินมีหยดคุณน้ำเกาะ เรืองแสง) โดยใช้กล้องจุลทรรศน์เรืองแสง (Zeiss เยอรมัน) วัด apoptosis โดยย้อมสี Annexin V-FITC / PI ใช้เซลล์กระแสปริมาณหัวเรื่อง: การตรวจอัตราสมัครapoptotic เซลล์ (5 × 103 / ดี) ถูกเข้าเมล็ด 6 ดีแผ่นและECMS สัมผัสที่ความเข้มข้นต่าง ๆ (0.1, 0.2 และ 0.4 mg / ml) สำหรับ 48 ชั่วโมงและเก็บเกี่ยวผลผลิตแล้วและล้างด้วยน้ำเกลือฟอสเฟตบัฟเฟอร์(พีบีเอส)ย้อมสีไปพร้อมกับบัฟเฟอร์ยึดไมโครลิตร 195 ประกอบด้วย 5 ไมโครลิตร Annexin V FITC ในมืดที่อุณหภูมิห้อง 10 นาทีและ เพิ่ม 10 ไมโครลิตร PI ใน 4 ℃สีดำใน 10 นาทีความสามารถในมีวิเคราะห์เซลล์apoptotic กับไหล FACScan เซลล์ (BD (3 × 105 / ดี) ถูกเมล็ดเป็นดี 6 แผ่นและ ECMS สัมผัสที่ความเข้มข้นต่าง ๆ (0.1, 0.2 และ 0.4 mg / ml) สำหรับ 48 ชั่วโมงและเก็บเกี่ยวผลผลิตแล้วล้างด้วยพีบีเอสถาวรในเอทานอล70% ที่ 4 ℃ย้อมสีไปตามด้วยพีบีเอสประกอบด้วย 40 (g / ml RNaseA และ 10 มล. วันที่ 30 FACScan (BD FACSCalibur) ตะวันตก blotting วิธีวิเคราะห์เมื่อจัดการกับECMS (0.1, 0.2, 0.3 มิลลิกรัม / มล.) สำหรับ 48 ชั่วโมง, MDA-MB-231 เซลล์ถูกรวบรวมและปั่นเป็นกลุ่มใน200 ไมโครลิตรริป้าราคาสลายบัฟเฟอร์มีเซลล์lysateหมุนเหวี่ยง (12, 000 ซื้อกรัมสำหรับ 15 นาทีที่ 4 ° C) และโปรตีนกำหนดความเข้มข้นด้วยโปรตีนเก็บกวาดชุดทดสอบจำนวนเท่าของโปรตีนถูกแปลงสภาพและโดย10% SDS หน้าหัวเรื่อง: การโอนย้ายไปยังแล้วสารPVDF ใช้เป็นไบโอ -Rad miniprotein-III ซีรั่มอัลบูมิวัวละลายใน TBST ห้องอุณหภูมิสำหรับ1 ชั่วโมงในเวลาต่อมาสารถูกแล้วละซักแล้วสามครั้งและบ่มด้วยแอนตี้หลักPI3K, สิ้นคิด, NF κB, แบ็กซ์, Bcl- 2 Cdk1, Cyclin B1 และ caspase-3 ที่ 4 ° C ข้ามคืนสารมีบ่มกับมะรุม peroxidase กลวงป้องกันกระต่าย IgG รองแอนติบอดีสำหรับเอช1 ที่อุณหภูมิห้องตามด้วยสามซักสัญญาณที่พบกับchemiluminescence ที่รีเอเจนต์ECL และวัดโดยใช้เจ densitometry จอภาพ (อัลฟา Innotech , CA, USA) GAPDH บริการให้ควบคุมโหลด (มาตรฐานข้อผิดพลาด

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

Lin-Yi เม้ง, et al,
3484 ฉบับที่ 13, 2012
เราพบว่า ECMS ก่อให้เกิดวงจรมือถือ G2 /
/ (FBS) RPMI 1640 กลาง penicillin G, streptomycin และ trypsin ที่ได้รับจาก Invitrogen คอร์ปอเรชั่นสหรัฐอเมริกา. Dimethyl sulfoxide (DMSO) และ ribonuclease (RNase) ที่ซื้อมาจากซิกเคมี, สหรัฐอเมริกา3 (4, 5) -dimethylthiahiazo (-z- y1) -3, 5-di-phenytetra- zoliumromide (MTT) ซื้อมาจาก (PI) ตัวแทนที่ซื้อมาจากBeyotime จีนเยื่อPVDF ที่ซื้อมาจากคคอร์ปอเรชั่น, แมสซาชูเซตสหรัฐอเมริกาแอนติบอดี polyclone เพื่อ PI3K, สิ้นคิด, NF-κB, caspase-3, แบ็กซ์และ Bcl-2 ที่ซื้อมาจากสัญญาณมือ ถือ, USA. การเตรียมสารสกัด500 มล ของการแก้ปัญหาเอทานอล 62% ถูกเพิ่มเข้าไปใน 150 กรัม(น้ำหนักแห้ง) ชั่วโมงจากเนชั่นั้นสารสกัดที่ถูก refluxed และกรองเป็นเวลา 1 ชั่วโมงเก็บกรองและเพิ่ม160 มล ของการแก้ปัญหาเอทานอล filtrates ลงในเรซิน 30%, 50%, 70%, DMEM เสริมด้วย 10% (v / v) ความร้อนที่ใช้งานซีรั่มวัวของทารกในครรภ์ (FBS) และ 100 IU / ml ยาปฏิชีวนะ 100 mg / ml streptomycin, เก็บไว้ที่ 37 ℃ในความชื้นCO2 5% ศูนย์ เพาะบ่มเซลล์ที่ถูกpassaged ทุก 2-3 วันและมักจะใช้เวลาประมาณ 80-90% ของบรรจบกันที่ทางเดินระหว่าง3 และ 20 หลังจาก MTT. สั้น ๆ , หลุมที่มีความหนาแน่นของ 5 × 103 เซลล์ และปัจจัยที่ควบคุมบวก5 fluorouracil หลังจากการบ่มเป็นเวลา 24 ชั่วโมง 48 ชั่วโมงหรือ ไมโครลิตร / กัน) 20 ไมโครลิตรของการแก้ปัญหา MTT (5 mg / ℃จากเนชั่นั้นสื่อที่ถูกดูดออกไปและ 150 ไมโครลิตรของ DMSO 570 ไมโคร(TECAN ไม่มีที่สิ้นสุด Hoechst 33258 MDA-MB-231 เซลล์เมล็ดในแผ่น 24 หลุมที่มีความหนาแน่นของ5 × 103 เซลล์ / ดีและบ่มกับ ECMS (0.1, 0.2 และ 0.4 mg / ml) สำหรับ 48 ชั่วโมงmonolayer โทรศัพท์มือถือใน 33258 สำหรับ 20 (Zeiss, ภาษาเยอรมัน). การวัดการตายโดย Annexin V-FITC / PI ย้อมสีภูมิคุ้มกัน (5 × 103 / ดี) มีเมล็ดเป็น 6 ดีจานและสัมผัสกับECMS ที่ระดับความเข้มข้นต่างๆ(0.1, 0.2 และ 0.4 mg / ml) เป็นเวลา 195 บัฟเฟอร์พันธะไมโครลิตรมี 5 ไมโครลิตรAnnexin V-FITC ในที่มืดที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 10 นาทีและจากนั้นเพิ่ม 10 ไมโครลิตร PI ในที่มืด 4 ℃เป็นเวลา 10 นาที. เซลล์ apoptotic วิเคราะห์ที่มีการไหล FACScan ภูมิคุ้มกัน (BD FACSCalibur ). การวิเคราะห์วงจรมือถือโดย PI ย้อมสีเซลล์(3 × 105 / ดี) ได้รับเมล็ดลงในแผ่น 6 ดีและสัมผัสกับECMS ที่ระดับความเข้มข้นต่างๆ (0.1, 0.2 และ0.4 mg / ml) เป็นเวลา 48 70% ที่ 4 ℃หัวเรื่อง: การย้อมสีไปพร้อมกับพีบีเอสที่มี 40 (g / ml RNaseA และ 10 ไมโครกรัม / มิลลิลิตรPI ในที่มืดที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 30 นาที. เซลล์รอบวัดโดยใช้FACScan ไหลภูมิคุ้มกัน ECMS (0.1, 0.2, 0.3 mg / ml) เป็นเวลา 48 ชั่วโมง, MDA-MB-231 เซลล์ถูกเก็บรวบรวมและปั่นใน200 ไมโครลิตรสลาย RIPA บัฟเฟอร์. lysate เซลล์หมุนเหวี่ยง(12,000 ×กรัมเป็นเวลา 15 นาทีที่อุณหภูมิ 4 องศา SDS-PAGE จากนั้นก็ย้ายไปยังเยื่อPVDF ใช้ Bio-Rad โปรตีนชนิดหนึ่งในซีรั่มวัวละลายใน TBST ณห้องอุณหภูมิ1 สิ้นคิด, NF-κB, แบ็กซ์, Bcl- 2 Cdk1, Cyclin B1 และ caspase-3 ที่ 4 ° C peroxidase- ผัน IgG ต่อต้านกระต่ายรองเป็นเวลา1 chemiluminescence น้ำยา ECL (อัลฟา Innotech, CA, (ข้อผิดพลาดมาตรฐานของ

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

หลินอี้เม้ง et al
3243 เอเชียแปซิฟิกวารสารการป้องกันมะเร็ง Vol 13 , 2012
เราพบว่า ecms ก่อให้เกิดวัฎจักรเซลล์ G2 / M ( โดยการลด pi3k จับกุมและ

/ akt ส่งสัญญาณ วัสดุและวิธีการวัสดุและสารเคมี

โคชินจีนสมุนไพรเมล็ด
สมุนไพร ซื้อจากตลาดในประเทศจีน แม่วัวเลือด ( FBS ) , RPMI 1640 penicillin G ,
) และสเตร็ปโตมัยซินซิน
ที่ได้รับจากบริษัท Invitrogen , USA
เต๊ะ ( DMSO ) และไรโบนิวคลีเ ( เลส )
ซื้อมาจาก Sigma เคมี , USA
3 - ( 4 , 5 ) - dimethylthiahiazo ( - z-y1 ) - 3 , 5-di-phenytetra -
zoliumromide ( MTT ) ซื้อมาจาก amresco
Inc . , USA Hoechst จากชุด ชุดวิเคราะห์
วัฏจักรเซลล์ ชุดวิเคราะห์โปรตีน ( โปรตีนการวิเคราะห์ชุด
propidium และไอโอไดด์ ( PI ) ตัวแทนซื้อมาจาก
beyotime , จีน ที่ซื้อจากเมมเบรน PVDF
มิลลิ Corporation , Massachusetts , USA
polyclone แอนติบอดี pi3k akt , NF , - κ B , การศึกษาลักษณะ
BAX , และการส่งสัญญาณของเซลล์ bcl-2 ซื้อมาจากอเมริกา การเตรียมสารสกัด

500 มิลลิลิตร สารละลายเอทานอลร้อยละ 62 เพิ่ม 150 g
น้ำหนักแห้งของโคชินจีนสมุนไพรและสารสกัดเมล็ดแป้ง
ได้จากการแช่เย็นเป็นเวลา 24 ชั่วโมง แล้วกรองแยกเป็น refluxed

1 h . เก็บกรองและเพิ่ม 160 มิลลิลิตร สารละลายเอทานอลร้อยละ 62 ใน
กาก ทำซ้ำกระบวนการข้างต้น และรวม
สารละลาย . เติมสารละลายลงในคอลัมน์เรซินเปียก
macroporous .เต็มหลังการดูดซึมในเรซินเรซิน 3
ครั้ง ปริมาณ 30% , 50% , 70% , 90% เอทานอลความเข้มข้น
คือตัวอย่าง . รวมและแช่แข็งแห้งเพื่อ ecms ตัว
.
เซลล์มะเร็ง และเซลล์มะเร็งเต้านมของมนุษย์วัฒนธรรม

mda-mb-231 ได้รับจากสถาบันวิทยาศาสตร์ทางชีวภาพ เซี่ยงไฮ้ประเทศจีน
และเพาะเลี้ยงในอาหารสูตร MS ที่เสริมด้วย dmem 10 %
( v / v ) ซึ่งความร้อนของวัว เซรั่ม ( FBS ) และ 100 IU / ml
เพนนิซิลลิน , 100 มก. / มล. และสเตร็ปโตมัยซิน เก็บไว้ที่อุณหภูมิ 37 ℃
ใน humidified 5% CO2
ตู้ฟักไข่ เซลล์มี passaged
ทุก 2-3 วัน และมักใช้ที่ประมาณ 80-90% ของ
บรรจบในทางเดินระหว่าง 3 และ 20 หลัง defreezing .
พวกเมล็ดลงจาน ต่างวัฒนธรรม หรืออาหารที่สอดคล้องกันสำหรับความหนาแน่น

หรือที่เกี่ยวข้องการใช้เซลล์เซลล์ proliferation
ถูกวัดโดยวิธี MTT .
สั้น mda-mb-231 เซลล์มีการรวบรวมและ seeded
ใน 96 ดีแผ่นในอัตราความหนาแน่น 5 × 103
เซลล์ / ดี และได้รับการรักษาด้วยเกลือฟอสเฟตบัฟเฟอร์

( PBS ) , ความเข้มข้นต่าง ๆ ของ ecms และปัจจัยควบคุมบวก
5-fluorouracil . หลังจากบ่มเป็นเวลา 24 ชั่วโมง , 48 ชั่วโมงหรือ 72 H ,
ขนาดกลางถูกเอาออกไปและแทนที่ด้วย
สื่อสด ( 180 µ L / ดี ) 20 µ L ของ MTT โซลูชั่น ( 5 มก. / มล. ) เพิ่ม

แต่ละอย่างดีและแผ่นถูกบ่มเพิ่ม 4 H
37 ℃ . แล้วสื่อก็สูดลมหายใจเข้าออก และ 150 µ l
DMSO ที่ถูกละดี นได้อ่าน
ที่ 570 nm เป็นความยาวคลื่นที่ทดสอบโดยใช้พื้นที่ภาคเหนือของประเทศไทย
( อ่าน TECAN อนันต์ 200 ) เซลล์ก็แสดงเป็น
จำนวนเซลล์ที่ไม่ได้รับสาร

mda-mb-231 นิวเคลียร์ย้อมด้วย 33258 Hoechst เซลล์ถูก seeded ใน 24 ดีจานที่ความหนาแน่น 5 × 103

เซลล์ / ดี และแยก ecms
( 0.1 , 0.2 และ 0.4 มก. / มล. ) สำหรับเลี้ยง เซลล์ชั้นที่ 24 -
ดีจานคือคงที่และย้อมด้วยดีเอ็นเอ
Hoechst 33258 ฟลู โรโครม 20 นาที หลังจากนั้นล้างด้วย pbs ,
ลักษณะสัณฐานวิทยาของ apoptosis ( รวมทั้งโทรศัพท์มือถือ
นิวเคลียสหดตัว การหยดน้ำ , เรืองแสงและนิวเคลียร์รุนแรง

fragmentation ) ได้ตรวจสอบด้วยกล้องจุลทรรศน์เรืองแสง ( Zeiss , เยอรมัน )
การวัดโดย v-fitc / PI staining ของเซลล์ (
( การใช้ตรวจสอบ
คะแนนในกลุ่มที่มีปริมาณ . เซลล์ ( 5 × 103
/ ดี ) มีเมล็ดใน 6-well
แผ่น และสัมผัสกับ ecms ที่ความเข้มข้นต่าง ๆ
( 0.1 , 0.2 และ 0.4 มิลลิกรัมต่อมิลลิลิตรเป็นเวลา 48 ชั่วโมง แล้วจึงล้างด้วยเกลือฟอสเฟตบัฟเฟอร์
( PBS ) การย้อมสี
ไปพร้อมกับ 195 µผมเชื่อมบัฟเฟอร์ที่มี 5 µ L
ของเซลล์ v-fitc ในที่มืดอุณหภูมิห้อง 10
มิน แล้วเพิ่ม 10 µผมพายในความมืด 4 ℃ 10 นาที

เซลล์ในกลุ่มที่มีมาวิเคราะห์ด้วยการ facscan( ( BD facscalibur ) .
การวิเคราะห์วงจรมือถือโดย PI การย้อมสีเซลล์ ( 3 × 105

/ ดี ) มีเมล็ดในและแผ่น 6-well
ตาก ecms ที่ความเข้มข้นต่างๆ ( 0.1 , 0.2 และ 0.4 มก. / มล.
) 48 ชั่วโมง แล้วจึงล้างด้วย
PBS คงที่ในเอทานอล 70% ใน 4 ℃ . ย้อมไปด้วย
กับ PBS ที่มี 40 ( g / ml rnasea และ 10 µ g / ml
pi ในที่มืดอุณหภูมิห้องเป็นเวลา 30 นาที เซลล์
วงจรวัดกระแสที่ใช้ ( facscan ( BD
facscalibur )

เมื่อการบริหารกับ Western blotting วิธี ecms ( 0.1 , 0.2 , 0.3 มก. /
มิลลิลิตร ) 48 ชั่วโมง mda-mb-231 เซลล์คือข้อมูล
บด 200 µ L RIPA การสลายบัฟเฟอร์ เป็นเซลล์ไฟฟ้า lysate
( 12000 × G สำหรับ 15 นาทีที่ 4 ° C ) และความเข้มข้นของโปรตีน
ถูกกำหนดจากโปรตีนโปรตีน
3 ชุดจํานวนเงินที่เท่ากันของโปรตีนถูกใช้โดยแยก 10% SDS-PAGE และ

แล้วโอนไปยังแผ่น PVDF ใช้ไบโอ ราด miniprotein โอนเปียก
3 หน่วย ไม่จำเพาะผูกพันถูกปิดกั้นด้วย
5 % อัลบูมินใน tbst ละลายที่อุณหภูมิห้อง
1 h . ต่อมา , เยื่อแผ่นแบบ
แล้วล้าง 3 ครั้ง และแยกแต่ละระดับแอนติบอดีต่อ pi3k akt
, ,