2.6. RNA extraction, cDNA synthesis

2.6. RNA extraction, cDNA synthesis and cloning of a cysteine
peptidase
Petals of Dendrobium cv. Khao Sanan flowers, five days after
treatment with ethylene, were homogenised and frozen. Total RNA
was isolated from the frozen material using the CTAB method
(Chang et al., 1993). Before reverse transcription reactions, contaminated
DNA in total RNA at various stages of senescence of flowers
was eliminated using DeoxyribonucleaseI (DNaseI, RNase-free, Fermentus,
Canada). The first strand cDNA was reverse transcribed
fromDNase-treatedRNA of Dendrobium usingM-MLV reverse Transcription
System Kit (Promega, USA). A pair of forward and reverse
primers of cysteine peptidase gene (5-GATCATGGGGTTGCAATCGT-Table 1
Effect of ethylene and 1-MCP on the time to petal senescence in Dendrobium cv. Khao
Sanan. Results are means of 10 replicate flowers±SE.
Treatment Time to petal senescence (days)
Distilled water 10.1 ± 0.9
0.4LL−1 ethylene 4.9 ± 0.7
500nLL−1 1-MCP 29.3 ± 1.0
500nLL−1 1-MCP + 0.4LL−1 ethylene 28.9 ± 1.1
3 and 5-ATCCCTGCTCTTGTGCGAAG-3) was designed from a
sequence of cysteine peptidase gene from Phalaenopsis in the
NCBI database (accession number U34747). Partial cDNAs were
cloned and sequenced. A new pair of specific primers for the gene
encoded for cystene peptidase fromDendrobiumwas designed (forward
primer 5-GGCTACGGGAAAACACAG-3) and reverse primer
5-AGGATAAGAAGCCTCCATTGC-3) and used for semi-quantitative
RT-PCR and quantitative real time RT-PCR.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

2.6 สกัดอาร์เอ็นเอ การสังเคราะห์ cDNA และของ cysteine เป็นpeptidaseกลีบของดอกกล้วยไม้สกุลหวายพันธุ์สนั่นเขา ห้าวันหลังจากรักษา ด้วยเอทิลีน homogenised และแช่แข็ง อาร์เอ็นเอทั้งหมดถูกแยกต่างหากจากวัสดุแข็งใช้วิธี CTAB(ช้างร้อยเอ็ด al., 1993) ก่อนปฏิกิริยาย้อนกลับ transcription ปนเปื้อนดีเอ็นเอในอาร์เอ็นเอทั้งหมดในขั้นตอนต่าง ๆ ของ senescence ดอกไม้ถูกตัดออกโดยใช้ DeoxyribonucleaseI (DNaseI, RNase ฟรี Fermentusแคนาดา) CDNA สาระแรกถูกกลับทับfromDNase-treatedRNA ของราชบัณฑิตยสถานกลับ usingM MLV กล้วยไม้สกุลหวายชุดระบบ (Promega สหรัฐอเมริกา) คู่ไปข้างหน้า และย้อนกลับไพรเมอร์ของยีน cysteine peptidase (5 - GATCATGGGGTTGCAATCGT-ตาราง 1ผลของเอทิลีนและ 1-MCP เวลา senescence กลีบดอกไม้ในกล้วยไม้สกุลหวายพันธุ์เขาพลตรีสนั่น ผลลัพธ์มีวิธีการ 10 replicate flowers±SEเวลารักษา senescence กลีบดอกไม้ (วัน)น้ำกลั่น 10.1 ± 0.90.4 LL−1 เอทิลีน 4.9 ± 0.7500nLL−1 1-MCP 29.3 ± 1.0500nLL−1 1-MCP + 0.4 LL−1 เอทิลีน 28.9 ± 1.13 และ 5 - ATCCCTGCTCTTGTGCGAAG-3) ถูกออกแบบมาจากการลำดับของยีน cysteine peptidase จาก Phalaenopsis ในการฐานข้อมูล NCBI (เลขทะเบียน U34747) CDNAs บางส่วนได้โคลน และเรียงลำดับ คู่ใหม่ของไพรเมอร์เฉพาะสำหรับยีนเข้ารหัส fromDendrobiumwas peptidase cystene ออก (ไปข้างหน้ารองพื้น 5 - GGCTACGGGAAAACACAG-3) และกลับพื้น5 - AGGATAAGAAGCCTCCATTGC-3) และใช้สำหรับกึ่งเชิงปริมาณRT-PCR และเชิงปริมาณจริงเวลา RT-PCR

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

2.6 สกัด RNA สังเคราะห์ cDNA และโคลน cysteine
​​peptidase
กลีบพันธุ์กล้วยไม้สกุลหวาย ดอกไม้เขาสนั่นห้าวันหลังจาก
การรักษาด้วยเอทิลีนได้ปั่นและแช่แข็ง รวมอาร์เอ็นเอ
ที่แยกได้จากวัสดุแช่แข็งโดยวิธี CTAB
(ช้าง et al., 1993) ก่อนที่จะเกิดปฏิกิริยาการถอดความกลับปนเปื้อน
ดีเอ็นเออาร์เอ็นเอทั้งหมดในขั้นตอนต่างๆของการเสื่อมสภาพของดอกไม้
ถูกกำจัดโดยใช้ DeoxyribonucleaseI (DNaseI, RNase ฟรี Fermentus,
แคนาดา) cDNA สาระแรกที่ถูกคัดลอกกลับ
fromDNase-treatedRNA ของกล้วยไม้สกุลหวาย usingM-MLV กลับถอดความ
ชุดระบบ (Promega, ประเทศสหรัฐอเมริกา) คู่ไปข้างหน้าและย้อนกลับ
ไพรยีน cysteine ​​peptidase (5? -GATCATGGGGTTGCAATCGT-ตารางที่ 1
ผลกระทบของเอทิลีนและ 1 MCP ในเวลาที่จะกลีบชราภาพพันธุ์ Dendrobium. เขา
สนั่นผล. มีวิธีการทำซ้ำ 10 ดอกไม้± SE.
การรักษา ใช้เวลาในการกลีบชราภาพ (วัน)
น้ำกลั่น 10.1 ± 0.9
0.4? LL-1 เอทิลีน 4.9 ± 0.7
500nLL-1-MCP 1 29.3 ± 1.0
500nLL-1-MCP 1 + 0.4? LL-1 เอทิลีน 28.9 ± 1.1
3? และ 5 ? -ATCCCTGCTCTTGTGCGAAG-3?) ได้รับการออกแบบจาก
ลำดับของยีน peptidase cysteine ​​จาก Phalaenopsis ใน
ฐานข้อมูล NCBI (ภาคยานุวัติจำนวน U34747) cDNAs บางส่วนถูก
โคลนและหาลำดับ คู่ใหม่ของไพรเมอร์ที่เฉพาะเจาะจงสำหรับยีน
เข้ารหัสสำหรับ peptidase fromDendrobiumwas cystene ออกแบบ (ไปข้างหน้า
รองพื้น 5? -GGCTACGGGAAAACACAG-3?) และย้อนกลับไพร
5? -AGGATAAGAAGCCTCCATTGC-3?) และใช้สำหรับกึ่งเชิงปริมาณ
RT-PCR เชิงปริมาณและเรียลไทม์ RT-PCR

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

2.6 การสกัด DNA การสังเคราะห์ cDNA และโคลน , ของกรดอะมิโนเปปไทด์

กลีบของกล้วยไม้พันธุ์ เขา ระบุ ดอกไม้ ห้าวันหลังจากที่
รักษากับเอทิลีนเป็น homogenised และแช่แข็ง
อาร์เอ็นเอทั้งหมดถูกแยกจากตรึงวัสดุโดยใช้วิธี ctab
( ชาง et al . , 1993 ) ก่อนกลับ ถอดความ ปฏิกิริยา ที่ปนเปื้อน
ดีเอ็นเออาร์เอ็นเอทั้งหมดที่ขั้นตอนต่างๆของการเสื่อมสภาพของดอกไม้
ถูกใช้ deoxyribonucleasei ( dnasei เลส , ฟรี , fermentus
, แคนาดา ) วิธีแรก คือ สาระและ fromdnase กลับ
treatedrna ของกล้วยไม้ usingm mlv ย้อนกลับถอดความ
ระบบชุด ( promega , USA ) คู่ของไปข้างหน้าและย้อนกลับ
ไพรเมอร์ของซีสเตอีนลูกเต้ายีน ( 5  - gatcatggggttgcaatcgt ตารางที่ 1 ผลของเอทิลีนและ 1-MCP ในเวลาที่จะลงในกลีบกล้วยไม้พันธุ์ข้าว
สนั่น . ผลลัพธ์จะหมายถึง 10 เลียนแบบดอกไม้±เซ .
รักษาเวลาลงกลีบ ( วัน )
น้ำกลั่น 10.1 ± 0.9
0.4  จะ− 1 เอทิลีน 4.9 ± 0.7
500nll − 1 ชุด เริ่ม± 1.0
500nll − 1 ชุด 0.4  − 1 จะ± 1.1
3  เอทิลีนต่ำและ  - 5 atccctgctcttgtgcgaag-3  ) ถูกออกแบบจากลำดับของกรดอะมิโนเปปไทด์ (

ncbi Phalaenopsis ในฐานข้อมูล ( เข้าเบอร์ u34747 )cdnas บางส่วนถูก
สามารถนี้ คู่ใหม่ของไพรเมอร์ที่จำเพาะสำหรับยีนที่เข้ารหัสสำหรับ cystene
ลูกเต้า fromdendrobiumwas ออกแบบ (  - รองพื้นข้างหน้า
5 ggctacgggaaaacacag-3  ) และย้อนกลับรองพื้น
5  - aggataagaagcctccattgc-3  ) และใช้วิธี RT-PCR และกึ่งปริมาณ
จริง เวลา ปริมาณ