Amylase assay Cell-free culture fil

Amylase assay
Cell-free culture filtrates were used as crude enzyme preparation to assay amylase activity. Amylase activity was determined by the method described by Zambere (2011). The reaction mixture consisted 1.25ml of 1% soluble starch 0.25ml of 0.1M acetate buffer (PH 5.0), 0.25ml of distilled water and 0.25ml of crude enzyme extract. After 10 minutes incubation at 50oc, the liberated reducing sugars (glucose equivalents) were estimated by dinitrosalicylic (DNS) method of Zambere (2011). The blank contained 0.5ml of 0.1M acetate buffer (PH 5.0), 1.25ml of 1% starch solution and 0.25ml of distilled water. Colour intensity was determined at 540nm using a spectrophotometer. One International Unit (IU) of alpha amylase was defined as the amount of enzyme that releases one milligram of reducing-sugar (glucose equivalents) per minute under standard assay conditions. The isolate with the highest enzyme activity was selected for further studies.

Hydrolysis of starch by Bacillus cereus
The investigation of starch hydrolysis by Bacillus cereus was carried out in submerged
cultivation. The cultivation medium contained in g/l, Bacteriological Peptone 6, MgSO4L7
H2O 0.5, KCI 0.5, soluble starch 1g and the initial pH adjusted to 6.5. Five millilitres (5ml) of bacteria culture that was equivalent to 1.0 McFarland (3.0x106 CFU/ml) was inoculated into 250ml of the medium and cultivated by shaking flask at 200 rpm, for 7 days at 37 oC . Supernatants of the fermented broth were collected daily, centrifuged at 5000 rpm for 15 min in a cooling centrifuge and the reducing sugar was determined.

Optimization of the conditions for starch hydrolysis
Incubation time, The effect of incubation time on starch was carried out to determine the optimum incubation time for hydrolysis. The hydrolysis was carried out for 7 days at 37oC and pH of 6.5. Samples were collected daily and analyzed for amylase activity. pH, The effect of pH on amylase production and starch hydrolysis was determined by culturing the bacterium at various pH 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0, 8.5 and 9 in the hydrolysis reaction to obtain the optimum pH. Samples were collected after 24hrs for amylase activity determination. Temperature, Temperature plays an important role in the production of amylase. The effect of temperature was studied by incubating the culture media at various temperatures 30, 35, 40, 45, and 50 oC in order to obtain the optimum temperature for amylase production.

Results and Discussion
Bacillus species are considered to be the most important sources of alpha-amylase and have been used for enzyme production (Pandey et al., 2000). The cultural and physiological properties of the Bacillus spp isolated from the soil revealed that all the isolates had colonies that were round in shape. The colonies were raised, large, flat, rough, dry and pink in colour with zones of egg yolk precipitate on MYP agar. The isolates were also rod shaped, gram positive and spore forming indicating they belong to the genus Bacillus as shown on Table 1.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

ทดสอบอะไมเลส Filtrates ปราศจากเซลล์ถูกใช้เป็นการเตรียมเอนไซม์ดิบเพื่อ assay กิจกรรมอะไมเลส อะไมเลสกิจกรรมถูกกำหนด โดยวิธีการอธิบายไว้ โดย Zambere (2011) ประกอบด้วยส่วนผสมของปฏิกิริยา 1.25ml 1% ละลายแป้ง 0.25 มิลลิลิตร 0.1M acetate บัฟเฟอร์ (PH 5.0), 0.25ml ของน้ำกลั่น และสารสกัดจากเอนไซม์ดิบ 0.25ml หลังจาก 10 นาทีบ่มที่ 50oc เสรีลดน้ำตาล (กลูโคสที่เทียบเท่า) ที่ถูกประเมิน โดยวิธี dinitrosalicylic (DNS) ของ Zambere (2011) ว่างอยู่ 0.5ml ของ 0.1M acetate บัฟเฟอร์ (PH 5.0), 1.25 มล.ของสารละลาย 1% แป้ง และ 0.25ml ของน้ำกลั่น กำหนดความเข้มของสีที่ 540nm ใช้สเปค หนึ่งหน่วยสากล (IU) ของอัลฟาอะไมเลสถูกกำหนดเป็นปริมาณของเอนไซม์ที่ออกหนึ่งมิลลิกรัมลดน้ำตาล (กลูโคสที่เทียบเท่า) ต่อนาทีภายใต้สภาวะทดสอบมาตรฐาน โปรตีนเอนไซม์สูงสุดถูกเลือกสำหรับการศึกษาต่อไปย่อยสลายของแป้งโดย Bacillus cereus ย่อยสลายแป้งโดย Bacillus cereus ดำเนินการในการสืบสวนที่จมอยู่ใต้น้ำเพาะปลูก สื่อเพาะปลูกอยู่ใน g/l แบคทีเรีย Peptone 6, MgSO4L7H2O KCI 0.5, 0.5 แป้งละลาย 1 กรัมและค่า pH เริ่มต้นปรับเป็น 6.5 5 มิลลิลิตร (5ml) ของแบคทีเรียวัฒนธรรมที่เทียบเท่ากับ 1.0 McFarland (3.0x106 CFU/ml) inoculated เป็น 250ml ของสื่อ และปลูก โดยการเขย่าขวดที่ 200 rpm, 7 วันที่ 37 oC Supernatants ของน้ำซุปหมักได้รวบรวมทุกวัน ผลิตภัณฑ์ที่ 5000 rpm ในเครื่องหมุนเหวี่ยงที่ระบายความร้อน 15 นาที และกำหนดลดน้ำตาลเพิ่มประสิทธิภาพของเงื่อนไขสำหรับการย่อยสลายแป้ง เวลาบ่ม ผลของเวลาการบ่มแป้งดำเนินการกำหนดเวลาบ่มที่เหมาะสมสำหรับการย่อยสลาย ย่อยสลายได้ดำเนินการ 7 วันที่ 37oC และค่า pH 6.5 ตัวอย่างที่ถูกรวบรวมไว้ทุกวัน และวิเคราะห์กิจกรรมอะไมเลส pH ผลของ pH ในการผลิตอะไมเลสและย่อยสลายแป้งถูกกำหนด โดยนำไปเลี้ยงแบคทีเรียที่ต่าง ๆ pH 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0, 8.5 และ 9 ในปฏิกิริยาย่อยสลายเพื่อขอรับค่า pH ที่เหมาะสม ตัวอย่างถูกเก็บหลังจาก 24 ชั่วโมงสำหรับการกำหนดกิจกรรมอะไมเลส อุณหภูมิ อุณหภูมิมีบทบาทสำคัญในการผลิตของอะไมเลส เป็นศึกษาผลของอุณหภูมิ โดย incubating สื่อวัฒนธรรมเวลาต่าง ๆ อุณหภูมิ 30, 35, 40, 45, 50 oC เพื่อให้ได้อุณหภูมิที่เหมาะสมสำหรับการผลิตอะไมเลสผลและการอภิปราย สายพันธุ์บาซิลลัสจะถือว่าเป็นแหล่งสำคัญสุดของอัลฟ่าอะไมเลส และมีการใช้ผลิตเอนไซม์ (Pandey et al. 2000) ทางวัฒนธรรม และทางสรีรวิทยาคุณสมบัติของ spp บาซิลลัสที่แยกได้จากดินเปิดเผยว่า ทั้งหมดที่แยกมีอาณานิคมที่ถูกในรูปร่าง อาณานิคมถูกยกขึ้น ขนาดใหญ่ แบน หยาบ แห้ง และสีชมพูสีของไข่แดงตะกอนในวุ้น MYP โซน การแยกก็ก้านรูปทรง แบคทีเรียแกรมบวกและสปอร์ที่ระบุว่า พวกเขาอยู่ในสกุล Bacillus ดังแสดงในตารางที่ 1 การขึ้นรูป

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

อะไมเลสทดสอบ
มือถือฟรีกรองวัฒนธรรมถูกนำมาใช้เพื่อเป็นการเตรียมเอนไซม์เพื่อ assay กิจกรรมอะไมเลส กิจกรรมอะไมเลสถูกกำหนดโดยวิธีการอธิบายโดย Zambere (2011) ผสมปฏิกิริยาประกอบด้วย 1.25ml 1% 0.25ml แป้งที่ละลายน้ำ 0.1M บัฟเฟอร์อะซิเตท (PH 5.0) 0.25ml น้ำกลั่นและ 0.25ml ของสารสกัดจากเอนไซม์ หลังจาก 10 นาทีบ่มที่ 50 องศาเซลเซียส, น้ำตาลลดการปลดปล่อย (กลูโคสเทียบเท่า) ได้รับการประเมินโดย dinitrosalicylic (DNS) วิธีการ Zambere (2011) 0.5ml มีที่ว่างของ 0.1M บัฟเฟอร์อะซิเตท (PH 5.0) 1.25ml ของการแก้ปัญหาแป้ง 1% และ 0.25ml น้ำกลั่น ความเข้มของสีที่ถูกกำหนด 540Nm ใช้สเปก หนึ่งระหว่าง Unit (IU) ของอัลฟาอะไมเลสถูกกำหนดเป็นปริมาณของเอนไซม์ที่ออกหนึ่งมิลลิกรัมของการลดน้ำตาล (กลูโคสเทียบเท่า) ต่อนาทีภายใต้เงื่อนไขการทดสอบมาตรฐาน เชื้อกับกิจกรรมของเอนไซม์สูงสุดได้รับเลือกสำหรับการศึกษาต่อไป.

ไฮโดรไลซิแป้งโดยเชื้อ Bacillus cereus
การสืบสวนของการย่อยสลายแป้งโดยเชื้อ Bacillus cereus ได้ดำเนินการในจมอยู่ใต้น้ำ
การเพาะปลูก สื่อการเพาะปลูกที่มีอยู่ใน g / l, แบคทีเรีย Peptone 6 MgSO4L7
H2O 0.5, KCI 0.5, 1G แป้งที่ละลายน้ำได้และปรับ pH เริ่มต้น 6.5 ห้ามิลลิลิตร (5ml) ของวัฒนธรรมแบคทีเรียที่เท่ากับ 1.0 McFarland (3.0x106 CFU / ml) ได้รับเชื้อเข้าสู่ 250ml ของกลางและได้รับการปลูกฝังด้วยการเขย่าขวดที่ 200 รอบต่อนาทีเป็นเวลา 7 วันที่ 37 องศาเซลเซียส supernatants ของน้ำซุปหมักที่ถูกเก็บรวบรวมรายวัน, หมุนเหวี่ยงที่ 5000 รอบต่อนาทีเป็นเวลา 15 นาทีในการหมุนเหวี่ยงระบายความร้อนและน้ำตาลลดการถูกกำหนด.

การเพิ่มประสิทธิภาพของเงื่อนไขสำหรับแป้งจองจำ
เวลาบ่มเพาะผลของเวลาฟักตัวบนแป้งได้ดำเนินการเพื่อตรวจสอบ เวลาการบ่มที่เหมาะสมสำหรับการย่อยสลาย การย่อยได้ดำเนินการเป็นเวลา 7 วันที่ 37oC และค่า pH 6.5 เก็บตัวอย่างในชีวิตประจำวันและวิเคราะห์กิจกรรมอะไมเลส พีเอช, ผลกระทบของค่า pH ในการผลิตอะไมเลสและแป้งจองจำถูกกำหนดโดยการเพาะเลี้ยงแบคทีเรียที่ pH 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0, 8.5 และ 9 ต่างๆในปฏิกิริยาการย่อยสลายที่จะได้รับค่า pH ที่เหมาะสม เก็บตัวอย่างหลังจาก 24 ชั่วโมงสำหรับการกำหนดกิจกรรมอะไมเลส อุณหภูมิ, อุณหภูมิมีบทบาทสำคัญในการผลิตอะไมเลส ผลของอุณหภูมิได้รับการศึกษาโดยการบ่มเพาะเลี้ยงที่อุณหภูมิต่างๆ 30, 35, 40, 45, และ 50 องศาเซลเซียสเพื่อให้ได้อุณหภูมิที่เหมาะสมสำหรับการผลิตอะไมเลส.

และอภิปรายผล
Bacillus สายพันธุ์ที่ได้รับการพิจารณาให้เป็นแหล่งที่สำคัญที่สุดของ อัลฟาอะไมเลสและได้รับการใช้สำหรับการผลิตเอนไซม์ (Pandey et al., 2000) คุณสมบัติทางวัฒนธรรมและทางสรีรวิทยาของ Bacillus spp ที่แยกจากดินพบว่าสายพันธุ์ทั้งหมดที่มีโคโลนีที่อยู่รอบในรูปร่าง อาณานิคมถูกยกขนาดใหญ่, แบน, หยาบแห้งและสีชมพูในสีที่มีโซนของไข่แดงตะกอนใน MYP วุ้น สายพันธุ์ก็มีรูปแท่ง, แกรมบวกและสร้างสปอร์ระบุว่าพวกเขาอยู่ในสกุล Bacillus ตามที่ปรากฏในตารางที่ 1

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

จากการทดสอบฟรีเซลล์วัฒนธรรม สารละลายที่ใช้ในการเตรียมการทดสอบกิจกรรมเอนไซม์อะไมเลส . กิจกรรมเอนไซม์อะไมเลสถูกหาโดยวิธีบรรยายโดย zambere ( 2011 ) ปฏิกิริยาของส่วนผสม ได้แก่ 1.25ml 1 % ละลายแป้ง 0.25ml ของ 0.1m อะซิเตทบัฟเฟอร์ pH 5.0 ) , 0.25ml ของน้ำกลั่นและ 0.25ml ของเอนไซม์สกัดเข้มข้น หลังจาก 10 นาที บ่มที่ 50oc , อิสระลดน้ำตาล ( กลูโคส ) ( เทียบเท่า ) dinitrosalicylic ( DNS ) วิธี zambere ( 2011 ) ว่างอยู่ 0.5ml ของ 0.1m อะซิเตทบัฟเฟอร์ pH 5.0 ) , 1.25ml ของสารละลายแป้ง 1 % และ 0.25ml ของน้ำกลั่น ความเข้มสีถูกกำหนดที่ 540nm โดยใช้วัสดุ หนึ่งหน่วยสากล ( IU ) ของอัลฟาอะไมเลส คือ กำหนดปริมาณของเอนไซม์ที่ปล่อยหนึ่งมิลลิกรัม ช่วยลดน้ำตาล ( เทียบเท่ากลูโคส ) ต่อนาที ภายใต้เงื่อนไขการทดสอบมาตรฐาน แยกกับกิจกรรมของเอนไซม์สูงสุดถูกเลือกสำหรับการศึกษาต่อการย่อยแป้งด้วย Bacillus cereusการศึกษาการย่อยแป้งโดย Bacillus cereus ได้ดําเนินการในน้ำการเพาะปลูก การเพาะปลูกกลางที่มีอยู่ในกรัมต่อลิตร ตามลำดับ mgso4l7 แบคทีเรีย 6H2O 0.5 , KCI 0.5 , 1 และแป้งที่ละลายน้ำได้เริ่มต้นปรับ pH 6.5 . 5 มิลลิลิตร ( 5ml ) ของแบคทีเรียที่เท่ากับ 1.0 แมคฟาร์แลนด์ ( 3.0x106 CFU / ml ) เป็นเชื้อ 250ml ของขนาดกลางและปลูกโดยขวดเขย่าที่ 200 รอบต่อนาทีที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 7 วัน supernatants ของน้ำหมักเก็บรายวัน ระดับ 5000 รอบต่อนาที 15 นาทีในเครื่องทำความเย็นและลดน้ำตาลได้กำหนดไว้การเพิ่มประสิทธิภาพของภาพสำหรับการย่อยแป้งเวลาในการบ่มผลของเวลาในการบ่มในแป้งมันสำปะหลังมีวัตถุประสงค์เพื่อกำหนดเวลาในการบ่มที่เหมาะสมสำหรับการย่อยสลาย . พบว่าเอนไซม์ที่ 37oc พีเอช 6.5 และ 7 วัน ทำการเก็บตัวอย่างและวิเคราะห์กิจกรรมของเอนไซม์อะไมเลสทุกวัน . ด่าง , ผลของ pH ต่อการผลิตเอนไซม์อะไมเลสย่อยแป้งและถูกกำหนดโดยการเพาะเลี้ยงแบคทีเรียต่างๆ ที่ pH 6.0 , 6.5 , 7.0 , 7.5 , 8.0 , 8.5 และ 9 ในการปฏิกิริยาที่จะได้รับที่เหมาะสม . ตัวอย่างหลังจาก 24 ชั่วโมงสำหรับเลสกิจกรรมการตัดสินใจ อุณหภูมิ อุณหภูมิมีบทบาทสำคัญในการผลิตเอนไซม์อะไมเลส . ผลของอุณหภูมิที่ศึกษาโดยการแช่วัฒนธรรมสื่อที่อุณหภูมิต่างๆ 30 , 35 , 40 , 45 และ 50 องศาเซลเซียส เพื่อให้ได้อุณหภูมิที่เหมาะสมสำหรับการผลิตเอนไซม์อะไมเลส .ผลและการอภิปรายBacillus สายพันธุ์ที่ถือว่าเป็นแหล่งที่สำคัญที่สุดของอัลฟาอะไมเลส และมีการใช้สำหรับการผลิตเอนไซม์ ( เดย์ et al . , 2000 ) สมบัติทางวัฒนธรรมและทางสรีรวิทยาของจุลินทรีย์ที่แยกได้จากดิน และพบว่า ทุกสายพันธุ์มีอาณานิคมที่ถูกปัดเศษในรูปร่าง อาณานิคมขึ้น ขนาดใหญ่ เรียบ หยาบแห้ง และสีชมพูกับโซนของตะกอนไข่แดงที่ myp วุ้น แยกได้เป็นรูปแท่งแกรมบวกและสร้างสปอร์ซึ่งเป็นของสกุลบาซิลลัส ดังตารางที่ 1