- ข้อความ
- ประวัติศาสตร์
Culture-dependentandculture-indepen
Culture-dependentandculture-independentmethodswerecombinedfortheinvestigationofaceticacidbacteria
(AAB) populations in traditionally produced vinegars and mother of vinegar samples obtained from apple and
grape. The culture-independent denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE) analysis, which targeted the
V7–V8 regions of the 16S rRNA gene, showed that Komagataeibacter hansenii and Komagataeibacter europaeus/
Komagataeibacter xylinus were the most dominant species in almost all of the samples analyzed directly. The
culture-independent GTG 5 -rep PCR fingerprinting was used in the preliminary characterization of AAB isolates
and species-level identification was carried out by sequencing of the 16S rRNA gene, 16S–23S rDNA internally
transcribedto thespacer(ITS)region and tufgene.Acetobacterokinawensiswasfrequentlyisolatedfromsamples
obtained from apple while K. europaeus was identified as the dominant species, followed by Acetobacter
indonesiensis in the samples originating from grape. In addition to common molecular techniques, real-time
PCR intercalating dye assays, including DNA melting temperature (Tm) and high resolution melting analysis
(HRM),wereappliedtoaceticacidbacterialisolatesforthefirsttime.ThetargetsequenceofITSregiongenerated
species-specific HRM profiles and Tm values allowed discrimination at species level.
1. Introduction
Vinegar is the product of a two-step fermentation process involving
the alcoholic fermentation of sugars into ethanol by yeasts, and, subse-
quently, the oxidation of ethanol into acetic acid by acetic acid bacteria
(AAB). Vinegar has been renowned as a food preservative since ancient
times andisstillusedtodayinthefood industryas ahighlysought-after
condimentand a multi-functionalproductutilized for pickling, preserv-
ing and flavor-balancing purposes (Sengun and Karapinar, 2004;
Steinkraus, 2002). All raw materials containing sugar or fruits can be
employedasstartingsubstancesforproducingvinegar.Severaldifferent
types of vinegars are produced around the world by using diverse
manufacturing techniques and raw materials native to specific areas.
In general, two well-defined methods, namely, slow surfaceculture fer-
mentation and fast submerged fermentation, are used in vinegar
manufacturing(Tesfayeetal.,2002). Theslow method is also called tra-
ditional vinegar production and the AAB grow on the surface of the liq-
uid during the fermentation process, which may take from several
weeks up to a few months (Nanda et al., 2001). A non-toxic film com-
posed of AAB and cellulose accumulates on the surface of the vinegar
throughout the oxidation process. This film, called “mother of vinegar”,
is used in the back-slopping practice as an indigenous starter culture to
trigger acetification in the production of traditional vinegar (Holzapfel,
2002; Hidalgo et al., 2010).
As a result of the two stage fermentation, several microbial species
show competitive activity in the vinegar throughout the production
process (Holzapfel, 2002). The microbial transformations give the
characteristic taste and fragrance to vinegar and the microbial metabo-
lites have beneficial health effects (Shimoji et al., 2002; Stasiak and
Blażejak, 2009). Acetic acid bacteria, which carry out the second trans-
formation,namely oxidative fermentation,are oneof themain microbi-
al populations in vinegar.
The three genera of acetic acid bacteria, Acetobacter (A.),
Gluconacetobacter (Ga.) and Komagataeibacter (K.) are mainly re-
sponsible for acetic fermentation in vinegar. The species of
Acetobacter aceti, Acetobacter malorum, Acetobacter pasteurianus,
Acetobacter pomorum, Komagataeibacter europaeus, Komagataeibacter
hansenii, Komagataeibacter intermedius, Komagataeibacter oboediens,
Komagataeibacter xylinus, Komagataeibacter medellinensis and
Komagataeibacter maltiaceti were previously detected in the vinegar
ecosystem (Sievers et al., 1992; Trcek et al., 1997; Sokollek et al.,
1998; Boesch et al., 1998; Trcek et al., 2000; De Vero et al., 2006;
Gullo et al., 2006; Yamada et al., 2012; Castro et al., 2013; Slapsak
etal.,2013).However,theprofilesofAABareunstableandshowpartic-
ular diversity in accordance with the raw material characteristics and
production process features (Gullo et al., 2009).
Identification of AAB based only on morphological, biochemical, and
physiological characteristics is not reliable and, therefore, is insufficient
International Journal of Food Microbiology 204 (2015) 9–16
⁎ Corresponding author. Tel.: +90 352 2076666/32729.
E-mail address: zkesmen@erciyes.edu.tr (Z. Kesmen).
http://dx.doi.org/10.1016/j.ijfoodmicro.2015.03.013
0168-1605/© 2015 Elsevier B.V. All rights reserved.
Contents lists available at ScienceDirect
International Journal of Food Microbiology
journal homepage: www.elsevier.com/locate/ijfoodmicro
because of the poor reproducibility and discriminatory power of these
phenotypic tests (Cleenwerck and De Vos, 2008; Papalexandratou
et al., 2009). For this reason, nucleic acid-based molecular methods
are now used to characterize and identify isolates of AAB from wine
andvinegarecosystems.ThesehaveincludedEnterobacterialRepetitive
Intergenic Consensus-PCR (ERIC-PCR) (Gonzalez et al., 2004; Gullo
et al., 2009; Nanda et al., 2001), Repetitive Extragenic Palindromic-
PCR (REP-PCR) (González et al., 2004), (GTG) 5 -rep-PCR fingerprinting
(De Vuyst et al., 2008) and RAPD-PCR (Trcek et al., 1997; Bartowsky
etal.,2003;Nandaetal.,2001).Areliabletaxonomicidentificationisob-
tainedwhenthesetechniquesarecombinedwiththesequencingof16S
rDNAgenes(Gonzalez,2005)andinternaltranscribedspacersequences
(ITS) of the 16S–23S rDNA genes (Gonzalez and Mas, 2011). Restriction
fragment length polymorphism (RFLP) analysis of the ribosomal genes
or their spacer regions has also been used for the identification of AAB
present in food-related ecosystems (Gullo et al., 2006; Ruiz et al.,
2000; Trcek and Teuber, 2002; Trcek, 2005; Vegas et al., 2010).
The combination of culture-independent methods with culture-
dependent methods in a polyphasic system is recommended as an ef-
fective approach to overcome the difficulties regarding the isolation
and cultivation of AAB strains (Cleenwerck and De Vos, 2008; Gullo
et al., 2009; Sengun and Karapinar, 2011). In the last decade, several
studies using the culture-independent DGGE and Temporal Tempera-
ture Gradient Gel Electrophoresis (TTGE) techniques were reported
for the characterization of the microbial community in vinegar and the
determination of population dynamics of AAB during fermentation
(De Vero et al., 2006; De Vero and Giudici, 2008; Ilabaca et al., 2008).
In addition, the real-time PCR technique has also been proposed for
culture-independent detection of different genera, or species, of AAB
(Andorra et al., 2008; Torija et al., 2010; Valera et al., 2013). Recently,
the intercalating dye-based real-time PCR analysis involved in specific
melting temperature (Tm) and high-resolution melting analysis were
applied asa highly promisingnew approach for confirmingtheidentifi-
cation and groupingof the culturable strains belonging to different bac-
terialspecies(Kaoetal.,2007;Juvonenetal.,2008;Kesmenetal.,2014),
but not yet to AAB. These new approaches provide a rapid and reliable
tool for the detection of small differences in the target DNA sequences
of closely related species.
The identification of indigenous AAB has critical importance to im-
prove the process control, overcome unpredictable fermentation prob-
lems and select the most suitable strains as the potential starter
culture. Therefore, in this study, we aimed to detect and compare AAB
populations in grape and apple vinegar and in mother of vinegar
samples obtained from different regions of Turkey. Thus the culture-
independent PCR-DGGE technique was combined with culture-
dependent molecular techniques, including (GTG) 5 -rep-PCR and
sequence analysis of the 16S rRNA gene, 16S–23S rRNA internal tran-
scribed sequences (ITS) region and tuf gene for identification and char-
acterization of AAB isolated from analyzed samples. Furthermore, real-
time PCR intercalating dye-based analysis was applied to AAB isolates
to obtain species-level discrimination.
2. Materials and methods
2.1. Vinegar and mother of vinegar samples
Vinegar and mother of vinegar samples produced by the spontane-
ous fermentation method were obtained from three different local pro-
ducers in Kayseri and Düzce, in Turkey. The samples, consisting of 2
grape vinegars (bg and eg) and their mothers (BG and EG), 2 apple vin-
egars (da and ha) and their mothers (DA and HA), were collected at the
end of the acetic fermentation from wood barrels in which traditional
surface fermentation is carried out. The acetic acid content of the vine-
gar samples were reported by producers as 3.96, 4.08, 4.28 and 4.37%
for the samples ha, da, bg and eg respectively. After the sampling
process, the vinegar and mother of vinegar samples were analyzed for
AAB using cultural and molecular methods.
2.2. Isolation of acetic acid bacteria (AAB)
10 ml of each of the 5 vinegar samples were diluted with 90 ml of
Maximum Recovery Diluent (Merck, GmbH, Darmstadt, Germany),
and homogenized for 2 min with a shaker (IKA, Germany). Serial deci-
mal dilutions were prepared with the same diluent and subjected to
the agar plate method for the isolation of AAB on GYC (5% D -glucose,
1% ethanol, 1% yeast extract, 1% CaCO 3 , 0.05% bromocresol purple, 2%
agar) and MYP (1% mannitol, 1% yeast extract, 0.3% peptone, 2% agar)
agar plates. To inhibit yeast growth, 100 ppm cycloheximide (Sigma)
was added to both agars. All plates were incubated at 30 °C for 5 days.
For each sample, 10–15 catalase-positive, oxidase-negative, and Gram-
negative colonies, showing different morphological characteristics
were purified by streak-plate technique and subjected to further char-
acterization. All isolates selected from samples were stored at −80 °C.
2.3. DNA extraction from pure cu
(AAB) populations in traditionally produced vinegars and mother of vinegar samples obtained from apple and
grape. The culture-independent denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE) analysis, which targeted the
V7–V8 regions of the 16S rRNA gene, showed that Komagataeibacter hansenii and Komagataeibacter europaeus/
Komagataeibacter xylinus were the most dominant species in almost all of the samples analyzed directly. The
culture-independent GTG 5 -rep PCR fingerprinting was used in the preliminary characterization of AAB isolates
and species-level identification was carried out by sequencing of the 16S rRNA gene, 16S–23S rDNA internally
transcribedto thespacer(ITS)region and tufgene.Acetobacterokinawensiswasfrequentlyisolatedfromsamples
obtained from apple while K. europaeus was identified as the dominant species, followed by Acetobacter
indonesiensis in the samples originating from grape. In addition to common molecular techniques, real-time
PCR intercalating dye assays, including DNA melting temperature (Tm) and high resolution melting analysis
(HRM),wereappliedtoaceticacidbacterialisolatesforthefirsttime.ThetargetsequenceofITSregiongenerated
species-specific HRM profiles and Tm values allowed discrimination at species level.
1. Introduction
Vinegar is the product of a two-step fermentation process involving
the alcoholic fermentation of sugars into ethanol by yeasts, and, subse-
quently, the oxidation of ethanol into acetic acid by acetic acid bacteria
(AAB). Vinegar has been renowned as a food preservative since ancient
times andisstillusedtodayinthefood industryas ahighlysought-after
condimentand a multi-functionalproductutilized for pickling, preserv-
ing and flavor-balancing purposes (Sengun and Karapinar, 2004;
Steinkraus, 2002). All raw materials containing sugar or fruits can be
employedasstartingsubstancesforproducingvinegar.Severaldifferent
types of vinegars are produced around the world by using diverse
manufacturing techniques and raw materials native to specific areas.
In general, two well-defined methods, namely, slow surfaceculture fer-
mentation and fast submerged fermentation, are used in vinegar
manufacturing(Tesfayeetal.,2002). Theslow method is also called tra-
ditional vinegar production and the AAB grow on the surface of the liq-
uid during the fermentation process, which may take from several
weeks up to a few months (Nanda et al., 2001). A non-toxic film com-
posed of AAB and cellulose accumulates on the surface of the vinegar
throughout the oxidation process. This film, called “mother of vinegar”,
is used in the back-slopping practice as an indigenous starter culture to
trigger acetification in the production of traditional vinegar (Holzapfel,
2002; Hidalgo et al., 2010).
As a result of the two stage fermentation, several microbial species
show competitive activity in the vinegar throughout the production
process (Holzapfel, 2002). The microbial transformations give the
characteristic taste and fragrance to vinegar and the microbial metabo-
lites have beneficial health effects (Shimoji et al., 2002; Stasiak and
Blażejak, 2009). Acetic acid bacteria, which carry out the second trans-
formation,namely oxidative fermentation,are oneof themain microbi-
al populations in vinegar.
The three genera of acetic acid bacteria, Acetobacter (A.),
Gluconacetobacter (Ga.) and Komagataeibacter (K.) are mainly re-
sponsible for acetic fermentation in vinegar. The species of
Acetobacter aceti, Acetobacter malorum, Acetobacter pasteurianus,
Acetobacter pomorum, Komagataeibacter europaeus, Komagataeibacter
hansenii, Komagataeibacter intermedius, Komagataeibacter oboediens,
Komagataeibacter xylinus, Komagataeibacter medellinensis and
Komagataeibacter maltiaceti were previously detected in the vinegar
ecosystem (Sievers et al., 1992; Trcek et al., 1997; Sokollek et al.,
1998; Boesch et al., 1998; Trcek et al., 2000; De Vero et al., 2006;
Gullo et al., 2006; Yamada et al., 2012; Castro et al., 2013; Slapsak
etal.,2013).However,theprofilesofAABareunstableandshowpartic-
ular diversity in accordance with the raw material characteristics and
production process features (Gullo et al., 2009).
Identification of AAB based only on morphological, biochemical, and
physiological characteristics is not reliable and, therefore, is insufficient
International Journal of Food Microbiology 204 (2015) 9–16
⁎ Corresponding author. Tel.: +90 352 2076666/32729.
E-mail address: zkesmen@erciyes.edu.tr (Z. Kesmen).
http://dx.doi.org/10.1016/j.ijfoodmicro.2015.03.013
0168-1605/© 2015 Elsevier B.V. All rights reserved.
Contents lists available at ScienceDirect
International Journal of Food Microbiology
journal homepage: www.elsevier.com/locate/ijfoodmicro
because of the poor reproducibility and discriminatory power of these
phenotypic tests (Cleenwerck and De Vos, 2008; Papalexandratou
et al., 2009). For this reason, nucleic acid-based molecular methods
are now used to characterize and identify isolates of AAB from wine
andvinegarecosystems.ThesehaveincludedEnterobacterialRepetitive
Intergenic Consensus-PCR (ERIC-PCR) (Gonzalez et al., 2004; Gullo
et al., 2009; Nanda et al., 2001), Repetitive Extragenic Palindromic-
PCR (REP-PCR) (González et al., 2004), (GTG) 5 -rep-PCR fingerprinting
(De Vuyst et al., 2008) and RAPD-PCR (Trcek et al., 1997; Bartowsky
etal.,2003;Nandaetal.,2001).Areliabletaxonomicidentificationisob-
tainedwhenthesetechniquesarecombinedwiththesequencingof16S
rDNAgenes(Gonzalez,2005)andinternaltranscribedspacersequences
(ITS) of the 16S–23S rDNA genes (Gonzalez and Mas, 2011). Restriction
fragment length polymorphism (RFLP) analysis of the ribosomal genes
or their spacer regions has also been used for the identification of AAB
present in food-related ecosystems (Gullo et al., 2006; Ruiz et al.,
2000; Trcek and Teuber, 2002; Trcek, 2005; Vegas et al., 2010).
The combination of culture-independent methods with culture-
dependent methods in a polyphasic system is recommended as an ef-
fective approach to overcome the difficulties regarding the isolation
and cultivation of AAB strains (Cleenwerck and De Vos, 2008; Gullo
et al., 2009; Sengun and Karapinar, 2011). In the last decade, several
studies using the culture-independent DGGE and Temporal Tempera-
ture Gradient Gel Electrophoresis (TTGE) techniques were reported
for the characterization of the microbial community in vinegar and the
determination of population dynamics of AAB during fermentation
(De Vero et al., 2006; De Vero and Giudici, 2008; Ilabaca et al., 2008).
In addition, the real-time PCR technique has also been proposed for
culture-independent detection of different genera, or species, of AAB
(Andorra et al., 2008; Torija et al., 2010; Valera et al., 2013). Recently,
the intercalating dye-based real-time PCR analysis involved in specific
melting temperature (Tm) and high-resolution melting analysis were
applied asa highly promisingnew approach for confirmingtheidentifi-
cation and groupingof the culturable strains belonging to different bac-
terialspecies(Kaoetal.,2007;Juvonenetal.,2008;Kesmenetal.,2014),
but not yet to AAB. These new approaches provide a rapid and reliable
tool for the detection of small differences in the target DNA sequences
of closely related species.
The identification of indigenous AAB has critical importance to im-
prove the process control, overcome unpredictable fermentation prob-
lems and select the most suitable strains as the potential starter
culture. Therefore, in this study, we aimed to detect and compare AAB
populations in grape and apple vinegar and in mother of vinegar
samples obtained from different regions of Turkey. Thus the culture-
independent PCR-DGGE technique was combined with culture-
dependent molecular techniques, including (GTG) 5 -rep-PCR and
sequence analysis of the 16S rRNA gene, 16S–23S rRNA internal tran-
scribed sequences (ITS) region and tuf gene for identification and char-
acterization of AAB isolated from analyzed samples. Furthermore, real-
time PCR intercalating dye-based analysis was applied to AAB isolates
to obtain species-level discrimination.
2. Materials and methods
2.1. Vinegar and mother of vinegar samples
Vinegar and mother of vinegar samples produced by the spontane-
ous fermentation method were obtained from three different local pro-
ducers in Kayseri and Düzce, in Turkey. The samples, consisting of 2
grape vinegars (bg and eg) and their mothers (BG and EG), 2 apple vin-
egars (da and ha) and their mothers (DA and HA), were collected at the
end of the acetic fermentation from wood barrels in which traditional
surface fermentation is carried out. The acetic acid content of the vine-
gar samples were reported by producers as 3.96, 4.08, 4.28 and 4.37%
for the samples ha, da, bg and eg respectively. After the sampling
process, the vinegar and mother of vinegar samples were analyzed for
AAB using cultural and molecular methods.
2.2. Isolation of acetic acid bacteria (AAB)
10 ml of each of the 5 vinegar samples were diluted with 90 ml of
Maximum Recovery Diluent (Merck, GmbH, Darmstadt, Germany),
and homogenized for 2 min with a shaker (IKA, Germany). Serial deci-
mal dilutions were prepared with the same diluent and subjected to
the agar plate method for the isolation of AAB on GYC (5% D -glucose,
1% ethanol, 1% yeast extract, 1% CaCO 3 , 0.05% bromocresol purple, 2%
agar) and MYP (1% mannitol, 1% yeast extract, 0.3% peptone, 2% agar)
agar plates. To inhibit yeast growth, 100 ppm cycloheximide (Sigma)
was added to both agars. All plates were incubated at 30 °C for 5 days.
For each sample, 10–15 catalase-positive, oxidase-negative, and Gram-
negative colonies, showing different morphological characteristics
were purified by streak-plate technique and subjected to further char-
acterization. All isolates selected from samples were stored at −80 °C.
2.3. DNA extraction from pure cu
0/5000
Culture-dependentandculture-independentmethodswerecombinedfortheinvestigationofaceticacidbacteria(AAB) populations in traditionally produced vinegars and mother of vinegar samples obtained from apple andgrape. The culture-independent denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE) analysis, which targeted theV7–V8 regions of the 16S rRNA gene, showed that Komagataeibacter hansenii and Komagataeibacter europaeus/Komagataeibacter xylinus were the most dominant species in almost all of the samples analyzed directly. Theculture-independent GTG 5 -rep PCR fingerprinting was used in the preliminary characterization of AAB isolatesand species-level identification was carried out by sequencing of the 16S rRNA gene, 16S–23S rDNA internallytranscribedto thespacer(ITS)region and tufgene.Acetobacterokinawensiswasfrequentlyisolatedfromsamplesobtained from apple while K. europaeus was identified as the dominant species, followed by Acetobacterindonesiensis in the samples originating from grape. In addition to common molecular techniques, real-timePCR intercalating dye assays, including DNA melting temperature (Tm) and high resolution melting analysis(HRM),wereappliedtoaceticacidbacterialisolatesforthefirsttime.ThetargetsequenceofITSregiongeneratedspecies-specific HRM profiles and Tm values allowed discrimination at species level.1. IntroductionVinegar is the product of a two-step fermentation process involvingthe alcoholic fermentation of sugars into ethanol by yeasts, and, subse-quently, the oxidation of ethanol into acetic acid by acetic acid bacteria(AAB). Vinegar has been renowned as a food preservative since ancienttimes andisstillusedtodayinthefood industryas ahighlysought-aftercondimentand a multi-functionalproductutilized for pickling, preserv-ing and flavor-balancing purposes (Sengun and Karapinar, 2004;Steinkraus, 2002). All raw materials containing sugar or fruits can beemployedasstartingsubstancesforproducingvinegar.Severaldifferenttypes of vinegars are produced around the world by using diversemanufacturing techniques and raw materials native to specific areas.In general, two well-defined methods, namely, slow surfaceculture fer-mentation and fast submerged fermentation, are used in vinegarmanufacturing(Tesfayeetal.,2002). Theslow method is also called tra-ditional vinegar production and the AAB grow on the surface of the liq-uid during the fermentation process, which may take from severalweeks up to a few months (Nanda et al., 2001). A non-toxic film com-posed of AAB and cellulose accumulates on the surface of the vinegarthroughout the oxidation process. This film, called “mother of vinegar”,is used in the back-slopping practice as an indigenous starter culture totrigger acetification in the production of traditional vinegar (Holzapfel,2002; Hidalgo et al., 2010).As a result of the two stage fermentation, several microbial speciesshow competitive activity in the vinegar throughout the productionprocess (Holzapfel, 2002). The microbial transformations give thecharacteristic taste and fragrance to vinegar and the microbial metabo-lites have beneficial health effects (Shimoji et al., 2002; Stasiak andBlażejak, 2009). Acetic acid bacteria, which carry out the second trans-formation,namely oxidative fermentation,are oneof themain microbi-al populations in vinegar.The three genera of acetic acid bacteria, Acetobacter (A.),Gluconacetobacter (Ga.) and Komagataeibacter (K.) are mainly re-sponsible for acetic fermentation in vinegar. The species ofAcetobacter aceti, Acetobacter malorum, Acetobacter pasteurianus,Acetobacter pomorum, Komagataeibacter europaeus, Komagataeibacterhansenii, Komagataeibacter intermedius, Komagataeibacter oboediens,Komagataeibacter xylinus, Komagataeibacter medellinensis andKomagataeibacter maltiaceti were previously detected in the vinegarecosystem (Sievers et al., 1992; Trcek et al., 1997; Sokollek et al.,1998; Boesch et al., 1998; Trcek et al., 2000; De Vero et al., 2006;Gullo et al., 2006; Yamada et al., 2012; Castro et al., 2013; Slapsaketal.,2013).However,theprofilesofAABareunstableandshowpartic-ular diversity in accordance with the raw material characteristics andproduction process features (Gullo et al., 2009).Identification of AAB based only on morphological, biochemical, andphysiological characteristics is not reliable and, therefore, is insufficientInternational Journal of Food Microbiology 204 (2015) 9–16⁎ Corresponding author. Tel.: +90 352 2076666/32729.E-mail address: zkesmen@erciyes.edu.tr (Z. Kesmen).http://dx.doi.org/10.1016/j.ijfoodmicro.2015.03.0130168-1605/© 2015 Elsevier B.V. All rights reserved.Contents lists available at ScienceDirectInternational Journal of Food Microbiologyjournal homepage: www.elsevier.com/locate/ijfoodmicrobecause of the poor reproducibility and discriminatory power of thesephenotypic tests (Cleenwerck and De Vos, 2008; Papalexandratouet al., 2009). For this reason, nucleic acid-based molecular methodsare now used to characterize and identify isolates of AAB from wineandvinegarecosystems.ThesehaveincludedEnterobacterialRepetitiveIntergenic Consensus-PCR (ERIC-PCR) (Gonzalez et al., 2004; Gulloet al., 2009; Nanda et al., 2001), Repetitive Extragenic Palindromic-PCR (REP-PCR) (González et al., 2004), (GTG) 5 -rep-PCR fingerprinting(De Vuyst et al., 2008) and RAPD-PCR (Trcek et al., 1997; Bartowskyetal.,2003;Nandaetal.,2001).Areliabletaxonomicidentificationisob-tainedwhenthesetechniquesarecombinedwiththesequencingof16SrDNAgenes(Gonzalez,2005)andinternaltranscribedspacersequences(ITS) of the 16S–23S rDNA genes (Gonzalez and Mas, 2011). Restrictionfragment length polymorphism (RFLP) analysis of the ribosomal genesor their spacer regions has also been used for the identification of AABpresent in food-related ecosystems (Gullo et al., 2006; Ruiz et al.,2000; Trcek and Teuber, 2002; Trcek, 2005; Vegas et al., 2010).The combination of culture-independent methods with culture-dependent methods in a polyphasic system is recommended as an ef-fective approach to overcome the difficulties regarding the isolationand cultivation of AAB strains (Cleenwerck and De Vos, 2008; Gulloet al., 2009; Sengun and Karapinar, 2011). In the last decade, severalstudies using the culture-independent DGGE and Temporal Tempera-ture Gradient Gel Electrophoresis (TTGE) techniques were reportedfor the characterization of the microbial community in vinegar and thedetermination of population dynamics of AAB during fermentation(De Vero et al., 2006; De Vero and Giudici, 2008; Ilabaca et al., 2008).In addition, the real-time PCR technique has also been proposed forculture-independent detection of different genera, or species, of AAB(Andorra et al., 2008; Torija et al., 2010; Valera et al., 2013). Recently,the intercalating dye-based real-time PCR analysis involved in specificmelting temperature (Tm) and high-resolution melting analysis wereapplied asa highly promisingnew approach for confirmingtheidentifi-cation and groupingof the culturable strains belonging to different bac-terialspecies(Kaoetal.,2007;Juvonenetal.,2008;Kesmenetal.,2014),but not yet to AAB. These new approaches provide a rapid and reliabletool for the detection of small differences in the target DNA sequencesof closely related species.
The identification of indigenous AAB has critical importance to im-
prove the process control, overcome unpredictable fermentation prob-
lems and select the most suitable strains as the potential starter
culture. Therefore, in this study, we aimed to detect and compare AAB
populations in grape and apple vinegar and in mother of vinegar
samples obtained from different regions of Turkey. Thus the culture-
independent PCR-DGGE technique was combined with culture-
dependent molecular techniques, including (GTG) 5 -rep-PCR and
sequence analysis of the 16S rRNA gene, 16S–23S rRNA internal tran-
scribed sequences (ITS) region and tuf gene for identification and char-
acterization of AAB isolated from analyzed samples. Furthermore, real-
time PCR intercalating dye-based analysis was applied to AAB isolates
to obtain species-level discrimination.
2. Materials and methods
2.1. Vinegar and mother of vinegar samples
Vinegar and mother of vinegar samples produced by the spontane-
ous fermentation method were obtained from three different local pro-
ducers in Kayseri and Düzce, in Turkey. The samples, consisting of 2
grape vinegars (bg and eg) and their mothers (BG and EG), 2 apple vin-
egars (da and ha) and their mothers (DA and HA), were collected at the
end of the acetic fermentation from wood barrels in which traditional
surface fermentation is carried out. The acetic acid content of the vine-
gar samples were reported by producers as 3.96, 4.08, 4.28 and 4.37%
for the samples ha, da, bg and eg respectively. After the sampling
process, the vinegar and mother of vinegar samples were analyzed for
AAB using cultural and molecular methods.
2.2. Isolation of acetic acid bacteria (AAB)
10 ml of each of the 5 vinegar samples were diluted with 90 ml of
Maximum Recovery Diluent (Merck, GmbH, Darmstadt, Germany),
and homogenized for 2 min with a shaker (IKA, Germany). Serial deci-
mal dilutions were prepared with the same diluent and subjected to
the agar plate method for the isolation of AAB on GYC (5% D -glucose,
1% ethanol, 1% yeast extract, 1% CaCO 3 , 0.05% bromocresol purple, 2%
agar) and MYP (1% mannitol, 1% yeast extract, 0.3% peptone, 2% agar)
agar plates. To inhibit yeast growth, 100 ppm cycloheximide (Sigma)
was added to both agars. All plates were incubated at 30 °C for 5 days.
For each sample, 10–15 catalase-positive, oxidase-negative, and Gram-
negative colonies, showing different morphological characteristics
were purified by streak-plate technique and subjected to further char-
acterization. All isolates selected from samples were stored at −80 °C.
2.3. DNA extraction from pure cu
The identification of indigenous AAB has critical importance to im-
prove the process control, overcome unpredictable fermentation prob-
lems and select the most suitable strains as the potential starter
culture. Therefore, in this study, we aimed to detect and compare AAB
populations in grape and apple vinegar and in mother of vinegar
samples obtained from different regions of Turkey. Thus the culture-
independent PCR-DGGE technique was combined with culture-
dependent molecular techniques, including (GTG) 5 -rep-PCR and
sequence analysis of the 16S rRNA gene, 16S–23S rRNA internal tran-
scribed sequences (ITS) region and tuf gene for identification and char-
acterization of AAB isolated from analyzed samples. Furthermore, real-
time PCR intercalating dye-based analysis was applied to AAB isolates
to obtain species-level discrimination.
2. Materials and methods
2.1. Vinegar and mother of vinegar samples
Vinegar and mother of vinegar samples produced by the spontane-
ous fermentation method were obtained from three different local pro-
ducers in Kayseri and Düzce, in Turkey. The samples, consisting of 2
grape vinegars (bg and eg) and their mothers (BG and EG), 2 apple vin-
egars (da and ha) and their mothers (DA and HA), were collected at the
end of the acetic fermentation from wood barrels in which traditional
surface fermentation is carried out. The acetic acid content of the vine-
gar samples were reported by producers as 3.96, 4.08, 4.28 and 4.37%
for the samples ha, da, bg and eg respectively. After the sampling
process, the vinegar and mother of vinegar samples were analyzed for
AAB using cultural and molecular methods.
2.2. Isolation of acetic acid bacteria (AAB)
10 ml of each of the 5 vinegar samples were diluted with 90 ml of
Maximum Recovery Diluent (Merck, GmbH, Darmstadt, Germany),
and homogenized for 2 min with a shaker (IKA, Germany). Serial deci-
mal dilutions were prepared with the same diluent and subjected to
the agar plate method for the isolation of AAB on GYC (5% D -glucose,
1% ethanol, 1% yeast extract, 1% CaCO 3 , 0.05% bromocresol purple, 2%
agar) and MYP (1% mannitol, 1% yeast extract, 0.3% peptone, 2% agar)
agar plates. To inhibit yeast growth, 100 ppm cycloheximide (Sigma)
was added to both agars. All plates were incubated at 30 °C for 5 days.
For each sample, 10–15 catalase-positive, oxidase-negative, and Gram-
negative colonies, showing different morphological characteristics
were purified by streak-plate technique and subjected to further char-
acterization. All isolates selected from samples were stored at −80 °C.
2.3. DNA extraction from pure cu
การแปล กรุณารอสักครู่..
ประชากรใน vinegars
ผลิตแบบดั้งเดิมและแม่ของกลุ่มตัวอย่างที่ได้จากน้ำส้มสายชูแอปเปิ้ลและองุ่น denaturing วัฒนธรรมอิสระลาดข่าวคราว (DGGE)
การวิเคราะห์ซึ่งเป้าหมายภูมิภาคV7-V8 ของยีน 16S rRNA แสดงให้เห็นว่า hansenii Komagataeibacter และ Komagataeibacter ยูโร /
Komagataeibacter xylinus ถูกสายพันธุ์ที่โดดเด่นที่สุดในเกือบทุกกลุ่มตัวอย่างวิเคราะห์โดยตรง
GTG วัฒนธรรมอิสระ 5 -rep PCR พิมพ์ลายนิ้วมือถูกใช้ในลักษณะเบื้องต้นของ AAB
แยกและบัตรประจำตัวสายพันธุ์ระดับได้ดำเนินการโดยลำดับของยีน16S rRNA, 16S-23S rDNA ภายใน
transcribedto thespacer (ITS) และภูมิภาค tufgene.Acetobacterokinawensiswasfrequentlyisolatedfromsamples
ที่ได้จากแอปเปิ้ลในขณะที่เคยูโรถูกระบุว่าเป็นสายพันธุ์ที่โดดเด่นตามด้วย Acetobacter
indonesiensis ในกลุ่มตัวอย่างที่มาจากองุ่น นอกจากเทคนิคโมเลกุลร่วมกันในเวลาจริงการตรวจย้อม PCR intercalating รวมทั้งอุณหภูมิหลอมเหลวดีเอ็นเอ (TM) และละลายความละเอียดสูง โปรไฟล์ HRM และค่า Tm ได้รับอนุญาตการเลือกปฏิบัติในระดับสายพันธุ์. 1 บทนำน้ำส้มสายชูเป็นผลิตภัณฑ์ของกระบวนการหมักสองขั้นตอนที่เกี่ยวข้องกับการหมักแอลกอฮอล์ของน้ำตาลเอทานอลโดยยีสต์และsubse- quently, ออกซิเดชันของเอทานอลลงในกรดอะซิติกจากแบคทีเรียกรดอะซิติก(AAB) น้ำส้มสายชูได้รับชื่อเสียงเป็นสารกันบูดอาหารตั้งแต่โบราณครั้ง andisstillusedtodayinthefood industryas ahighlysought หลัง condimentand หลาย functionalproductutilized สำหรับดอง preserv- ไอเอ็นจีและวัตถุประสงค์รสชาติที่สมดุล (Sengun และ Karapinar 2004; Steinkraus, 2002) วัตถุดิบทั้งหมดที่มีน้ำตาลหรือผลไม้สามารถemployedasstartingsubstancesforproducingvinegar.Severaldifferent ประเภท vinegars มีการผลิตทั่วโลกที่มีความหลากหลายโดยใช้เทคนิคการผลิตและวัตถุดิบที่มีถิ่นกำเนิดในพื้นที่เฉพาะ. โดยทั่วไปสองวิธีที่ดีที่กำหนดคือช้า surfaceculture fer- mentation และ หมักจมอยู่ใต้น้ำได้อย่างรวดเร็วและถูกนำมาใช้ในน้ำส้มสายชูผลิต(Tesfayeetal., 2002) วิธี Theslow จะเรียกว่าลองพิจารณาการผลิตน้ำส้มสายชูditional และ AAB เติบโตบนพื้นผิวของของเหลวuid ในระหว่างขั้นตอนการหมักซึ่งอาจต้องใช้เวลาหลายสัปดาห์ที่ผ่านมาถึงไม่กี่เดือน(ดา et al., 2001) สั่งภาพยนตร์ที่ปลอดสารพิษที่เกิดจาก AAB และเซลลูโลสสะสมบนพื้นผิวของน้ำส้มสายชูที่ตลอดกระบวนการออกซิเดชัน ภาพยนตร์เรื่องนี้เรียกว่า "แม่ของน้ำส้มสายชู" ถูกนำมาใช้ในทางปฏิบัติกลับ slopping เป็นวัฒนธรรมเริ่มต้นชนพื้นเมืองที่เรียกacetification ในการผลิตน้ำส้มสายชูแบบดั้งเดิม (Holzapfel, 2002. อีดัลโก et al, 2010). ในฐานะที่เป็นผลมาจากการที่ การหมักขั้นตอนที่สองสายพันธุ์จุลินทรีย์หลายแสดงกิจกรรมการแข่งขันในน้ำส้มสายชูตลอดการผลิตกระบวนการ(Holzapfel, 2002) แปลงจุลินทรีย์ให้รสชาติและกลิ่นหอมลักษณะการน้ำส้มสายชูและจุลินทรีย์ metabo- lites มีผลกระทบต่อสุขภาพที่เป็นประโยชน์ (Shimoji, et al., 2002; Stasiak และBlażejak 2009) แบคทีเรียกรดอะซิติกซึ่งดำเนินการทรานส์สองรูปแบบคือการหมักออกซิเดชันเป็น themain oneof microbi- ประชากรในอัลน้ำส้มสายชู. สามจำพวกแบคทีเรียกรดอะซิติก Acetobacter (ก) Gluconacetobacter (Ga.) และ Komagataeibacter (K .) ส่วนใหญ่จะเป็นอีกsponsible สำหรับการหมักอะซิติกในน้ำส้มสายชู ชนิดของAcetobacter Aceti, Acetobacter Malorum, Acetobacter เชื้อที่, Acetobacter pomorum, Komagataeibacter ยูโร, Komagataeibacter hansenii, Komagataeibacter intermedius, Komagataeibacter oboediens, Komagataeibacter xylinus, Komagataeibacter medellinensis และKomagataeibacter maltiaceti ตรวจพบก่อนหน้านี้ในน้ำส้มสายชูระบบนิเวศ(Sievers et al, 1992. Trcek et al, 1997;. Sokollek, et al. 1998; Boesch et al, 1998;. Trcek et al, 2000;. เดเวโร et al, 2006;. Gullo et al, 2006;. ยามาดะ et al, 2012. คาสโตร, et al, 2013;. Slapsak. etal 2013) อย่างไรก็ตาม, theprofilesofAABareunstableandshowpartic- หลากหลาย ular สอดคล้องกับลักษณะของวัตถุดิบและ.. คุณสมบัติขั้นตอนการผลิต (Gullo et al, 2009) บัตรประจำตัวของ AAB ขึ้นอยู่เฉพาะในลักษณะทางสัณฐานวิทยาชีวเคมี และลักษณะทางสรีรวิทยาไม่น่าเชื่อถือและมีไม่เพียงพอวารสารนานาชาติจุลชีววิทยาอาหาร204 (2015) 9-16 ⁎ผู้เขียนที่สอดคล้องกัน Tel .: 90 352 2076666/32729. ที่อยู่ E-mail:. zkesmen@erciyes.edu.tr (ซี Kesmen) http://dx.doi.org/10.1016/j.ijfoodmicro.2015.03.013 0168-1605 / © 2015 Elsevier BV สงวนลิขสิทธิ์. รายการเนื้อหาที่มีอยู่ใน ScienceDirect วารสารนานาชาติจุลชีววิทยาอาหารหน้าแรกของวารสาร: www.elsevier.com/locate/ijfoodmicro เพราะการทำสำเนาที่ไม่ดีและพลังของการเลือกปฏิบัติเหล่านี้ทดสอบฟีโนไทป์ (Cleenwerck และ De Vos 2008 ; Papalexandratou et al, 2009). ด้วยเหตุนี้กรดนิวคลีอิกที่ใช้วิธีการโมเลกุลที่ใช้ตอนนี้จะอธิบายลักษณะและระบุสายพันธุ์ของ AAB จากไวน์ andvinegarecosystems.ThesehaveincludedEnterobacterialRepetitive intergenic ฉันทามติ-PCR (ERIC-PCR) (กอนซาเล et al, 2004;. Gullo et al, 2009;. ดา et al., 2001) ซ้ำ Extragenic Palindromic- PCR (REP-PCR) (González et al., 2004), (GTG) 5 พิมพ์ลายนิ้วมือ -rep-PCR (De Vuyst et al., 2008) และ RAPD-PCR (Trcek et al, 1997. ของ 16S-23S ยีน rDNA (กอนซาเลและ Mas 2011). ข้อ จำกัดแตกต่างมีความยาวส่วน (RFLP) การวิเคราะห์ยีนโซมอลหรือภูมิภาคspacer ของพวกเขายังถูกนำมาใช้เพื่อระบุตัวตนของ AAB อยู่ในระบบนิเวศที่เกี่ยวกับอาหาร (Gullo et al, ., 2006; รุยซ์, et al. 2000; Trcek และ Teuber 2002; Trcek 2005.. สเวกัส, et al, 2010) การรวมกันของวิธีการวัฒนธรรมอิสระที่มีวัฒนธรรมวิธีการขึ้นอยู่ในระบบ polyphasic แนะนำเป็น EF - วิธีการ fective ที่จะเอาชนะความยากลำบากเกี่ยวกับการแยกและการเพาะปลูกสายพันธุ์AAB (Cleenwerck และ De Vos, 2008; Gullo et al, 2009; Sengun และ Karapinar 2011.) ในทศวรรษที่ผ่านมาหลาย. การศึกษาโดยใช้วัฒนธรรมเป็นอิสระ DGGE และชั่วขณะอุณหภูมิture ไล่โทนสีเจล Electrophoresis (TTGE) เทคนิคที่ได้รับรายงานสำหรับลักษณะของชุมชนจุลินทรีย์ในน้ำส้มสายชูและที่ความมุ่งมั่นของการเปลี่ยนแปลงประชากรAAB ระหว่างการหมัก(เดอเวโร et al, 2006;. เดเวโรและ Giudici 2008; Ilabaca .. et al, 2008) นอกจากนี้ในเวลาจริงวิธี PCR ยังได้รับการเสนอให้การตรวจสอบวัฒนธรรมอิสระจำพวกที่แตกต่างกันหรือชนิดของAAB (อันดอร์รา et al, 2008. Torija et al, 2010. วาเลร่า et al., 2013) เมื่อเร็ว ๆ นี้intercalating ย้อมตามแบบ real-time PCR ที่เกี่ยวข้องกับการวิเคราะห์ในเฉพาะอุณหภูมิหลอมเหลว(TM) และความละเอียดสูงวิเคราะห์ละลายถูกนำไปใช้วิธีการที่เอเอสเอ promisingnew สูงสำหรับ confirmingtheidentifi- ไอออนบวกและ groupingof สายพันธุ์ culturable เป็นของที่แตกต่างกัน bac- terialspecies (Kaoetal 2007. Juvonenetal 2008; Kesmenetal 2014). แต่ยังไม่ถึง AAB เหล่านี้วิธีการใหม่ให้อย่างรวดเร็วและเชื่อถือได้เครื่องมือสำหรับการตรวจสอบความแตกต่างเล็ก ๆ ในลำดับดีเอ็นเอเป้าหมายของสายพันธุ์ที่เกี่ยวข้องอย่างใกล้ชิด. บัตรประจำตัวของ AAB พื้นเมืองที่มีความสำคัญสำคัญที่จะอิ่มพิสูจน์การควบคุมกระบวนการหมักเอาชนะกำหนดปัญหาที่คาดเดาไม่ได้LEMS และเลือก สายพันธุ์ที่เหมาะสมที่สุดในขณะที่เริ่มต้นที่มีศักยภาพวัฒนธรรม ดังนั้นในการศึกษาครั้งนี้เรามีวัตถุประสงค์เพื่อตรวจสอบและเปรียบเทียบ AAB ประชากรในน้ำส้มสายชูแอปเปิ้ลองุ่นและและแม่ของน้ำส้มสายชูตัวอย่างที่ได้รับจากภูมิภาคต่าง ๆ ของประเทศตุรกี ดังนั้นวัฒนธรรมเทคนิคอิสระ PCR-DGGE ได้ร่วมกับวัฒนธรรมเทคนิคโมเลกุลขึ้นรวมทั้ง(GTG) 5 -rep-PCR และการวิเคราะห์ลำดับของยีน16S rRNA, 16S-23S rRNA tran- ภายในscribed ลำดับ (ITS) และภูมิภาค ยีน TUF สำหรับการระบุและอักษรacterization ของ AAB ที่แยกได้จากตัวอย่างการวิเคราะห์ นอกจากนี้จริงเวลาวิเคราะห์ PCR intercalating สีย้อมที่ใช้ถูกนำไปใช้ AAB แยกที่จะได้รับการเลือกปฏิบัติสายพันธุ์ที่ระดับ. 2 วัสดุและวิธีการ2.1 น้ำส้มสายชูและแม่ของกลุ่มตัวอย่างน้ำส้มสายชูน้ำส้มสายชูและแม่ของกลุ่มตัวอย่างน้ำส้มสายชูที่ผลิตโดย spontane- วิธีการหมักภายใต้กฎระเบียบที่ได้รับจากที่แตกต่างกันสามโปรท้องถิ่นducers ใน Kayseri และDüzceในตุรกี กลุ่มตัวอย่างประกอบด้วย 2 vinegars องุ่น (BG และเช่น) และแม่ของพวกเขา (BG และ EG), แอปเปิ้ล 2 vin- egars (ดาและฮ่า) และแม่ของพวกเขา (DA และ HA) ที่ถูกเก็บรวบรวมในตอนท้ายของการหมักอะซิติกจากถังไม้แบบดั้งเดิมที่หมักพื้นผิวจะดำเนินการ เนื้อหากรดอะซิติกของ vine- ตัวอย่างการ์ได้รับรายงานจากผู้ผลิตเป็น 3.96, 4.08, 4.28 และ 4.37% สำหรับตัวอย่างฮ่า, ดาที่ bg และเช่นตามลำดับ หลังจากการสุ่มตัวอย่างกระบวนการน้ำส้มสายชูและแม่ของกลุ่มตัวอย่างน้ำส้มสายชูวิเคราะห์สำหรับAAB โดยใช้วิธีการทางวัฒนธรรมและโมเลกุล. 2.2 การแยกเชื้อแบคทีเรียกรดอะซิติก (AAB) 10 มล. ของแต่ละ 5 ตัวอย่างถูกน้ำส้มสายชูเจือจางด้วย 90 มลสูงสุดกู้คืนเจือจาง(เมอร์ค GmbH, ดาร์มสตัด, เยอรมนี) และปั่นเป็นเวลา 2 นาทีด้วยเครื่องปั่น (IKA, เยอรมนี) อนุกรมได้ตัดสินใจที่เจือจาง mal ได้จัดทำกับเจือจางเดียวกันและภายใต้วิธีการที่แผ่นวุ้นในการแยกของAAB ใน GYC (5% D -glucose, เอทานอล 1% สารสกัดจากยีสต์ 1%, 1% CaCO 3, 0.05% bromocresol สีม่วง , 2% วุ้น) และ MYP (แมนนิทอล 1% สารสกัดจากยีสต์ 1% 0.3% เปปโตน, วุ้น% 2) วุ้นแผ่น เพื่อยับยั้งการเจริญเติบโตของยีสต์ 100 ppm cycloheximide (ซิกม่า) ถูกบันทึกอยู่ในสาหร่ายทั้ง แผ่นทั้งหมดถูกบ่มที่อุณหภูมิ 30 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 5 วัน. สำหรับแต่ละตัวอย่าง 10-15 catalase บวก oxidase ลบและ Gram- อาณานิคมลบแสดงลักษณะทางสัณฐานวิทยาที่แตกต่างกันได้รับการทำให้บริสุทธิ์ด้วยเทคนิคแนวแผ่นและยัดเยียดให้อักษรต่อไปacterization ไอโซเลททั้งหมดเลือกจากตัวอย่างที่ถูกเก็บไว้ที่ -80 องศาเซลเซียส. 2.3 การสกัดดีเอ็นเอจากลูกบาศ์กบริสุทธิ์
การแปล กรุณารอสักครู่..
วัฒนธรรม dependentandculture independentmethodswerecombinedfortheinvestigationofaceticacidbacteria
( AAB ) ประชากรในผ้าที่ผลิตน้ำส้มสายชูและแม่ของตัวอย่างที่ได้จากแอปเปิ้ลและส้ม
องุ่น วัฒนธรรมไที่ลาด gel electrophoresis ( การทดลอง ) วิเคราะห์ ซึ่งเป้าหมาย
v7 V8 และภูมิภาคของเบส 16S rRNA ยีนและพบว่า komagataeibacter hansenii komagataeibacter europaeus /
komagataeibacter xylinus เป็นชนิดเด่นที่สุดในเกือบทั้งหมดของตัวอย่างวิเคราะห์โดยตรง
วัฒนธรรมอิสระ GTG 5 - ตัวแทนตรวจลายนิ้วมือถูกใช้ในลักษณะเบื้องต้นของ AAB ไอโซ
และชนิดระบุระดับกระทำโดยการจัดลำดับของยีน 16S rRNA ,( - 23s rDNA ภายใน
transcribedto thespacer ( ของมัน ) ภูมิภาค และ tufgene . acetobacterokinawensiswasfrequentlyisolatedfromsamples
ที่ได้จากแอปเปิ้ลในขณะที่คุณ europaeus ถูกระบุเป็นชนิดเด่น รองลงมาคือ Acetobacter
indonesiensis ในกลุ่มตัวอย่างที่มาจากองุ่น นอกจากเทคนิคโมเลกุลทั่วไป เวลาจริง
intercalating ย้อมตรวจ PCR ,รวมถึงดีเอ็นเออุณหภูมิหลอมเหลว ( TM ) และความละเอียดสูงจุดหลอมเหลวการวิเคราะห์
( HRM ) wereappliedtoaceticacidbacterialisolatesforthefirsttime . thetargetsequenceofitsregiongenerated
เผ่าพันธุ์ - เฉพาะหรือโปรไฟล์และค่าจำแนกชนิดและได้รับอนุญาตในระดับ .
1 ส้มแนะนำ
เป็นผลิตภัณฑ์ของกระบวนการหมัก 2 ขั้นตอนที่เกี่ยวข้องกับ
การหมักแอลกอฮอล์จากน้ำตาลเป็นเอทานอลโดยยีสต์ และ subse -
quently , ออกซิเดชันของเอทานอลในกรดอะซิติกโดยแบคทีเรียกรดน้ำส้ม
( AAB ) ส้มได้รับชื่อเสียงเป็นอาหารบูดตั้งแต่โบราณ
ครั้ง andisstillusedtodayinthefood industryas ahighlysought หลัง
condimentand หลาย functionalproductutilized สำหรับดอง preserv -
ไอเอ็นจีและรสชาติที่สมดุล ( และมี sengun karapinar , 2004 ;
steinkraus , 2002 ) ทั้งหมดวัตถุดิบผลไม้ที่มีน้ำตาล หรือจะ severaldifferent
employedasstartingsubstancesforproducingvinegar ชนิดของน้ำส้มสายชูที่ผลิตทั่วโลก โดยการใช้เทคนิคการผลิตและวัตถุดิบพื้นเมืองหลากหลาย
พื้นที่เฉพาะ โดยทั่วไปกำหนด 2 วิธี คือ
( AAB ) ประชากรในผ้าที่ผลิตน้ำส้มสายชูและแม่ของตัวอย่างที่ได้จากแอปเปิ้ลและส้ม
องุ่น วัฒนธรรมไที่ลาด gel electrophoresis ( การทดลอง ) วิเคราะห์ ซึ่งเป้าหมาย
v7 V8 และภูมิภาคของเบส 16S rRNA ยีนและพบว่า komagataeibacter hansenii komagataeibacter europaeus /
komagataeibacter xylinus เป็นชนิดเด่นที่สุดในเกือบทั้งหมดของตัวอย่างวิเคราะห์โดยตรง
วัฒนธรรมอิสระ GTG 5 - ตัวแทนตรวจลายนิ้วมือถูกใช้ในลักษณะเบื้องต้นของ AAB ไอโซ
และชนิดระบุระดับกระทำโดยการจัดลำดับของยีน 16S rRNA ,( - 23s rDNA ภายใน
transcribedto thespacer ( ของมัน ) ภูมิภาค และ tufgene . acetobacterokinawensiswasfrequentlyisolatedfromsamples
ที่ได้จากแอปเปิ้ลในขณะที่คุณ europaeus ถูกระบุเป็นชนิดเด่น รองลงมาคือ Acetobacter
indonesiensis ในกลุ่มตัวอย่างที่มาจากองุ่น นอกจากเทคนิคโมเลกุลทั่วไป เวลาจริง
intercalating ย้อมตรวจ PCR ,รวมถึงดีเอ็นเออุณหภูมิหลอมเหลว ( TM ) และความละเอียดสูงจุดหลอมเหลวการวิเคราะห์
( HRM ) wereappliedtoaceticacidbacterialisolatesforthefirsttime . thetargetsequenceofitsregiongenerated
เผ่าพันธุ์ - เฉพาะหรือโปรไฟล์และค่าจำแนกชนิดและได้รับอนุญาตในระดับ .
1 ส้มแนะนำ
เป็นผลิตภัณฑ์ของกระบวนการหมัก 2 ขั้นตอนที่เกี่ยวข้องกับ
การหมักแอลกอฮอล์จากน้ำตาลเป็นเอทานอลโดยยีสต์ และ subse -
quently , ออกซิเดชันของเอทานอลในกรดอะซิติกโดยแบคทีเรียกรดน้ำส้ม
( AAB ) ส้มได้รับชื่อเสียงเป็นอาหารบูดตั้งแต่โบราณ
ครั้ง andisstillusedtodayinthefood industryas ahighlysought หลัง
condimentand หลาย functionalproductutilized สำหรับดอง preserv -
ไอเอ็นจีและรสชาติที่สมดุล ( และมี sengun karapinar , 2004 ;
steinkraus , 2002 ) ทั้งหมดวัตถุดิบผลไม้ที่มีน้ำตาล หรือจะ severaldifferent
employedasstartingsubstancesforproducingvinegar ชนิดของน้ำส้มสายชูที่ผลิตทั่วโลก โดยการใช้เทคนิคการผลิตและวัตถุดิบพื้นเมืองหลากหลาย
พื้นที่เฉพาะ โดยทั่วไปกำหนด 2 วิธี คือ
การแปล กรุณารอสักครู่..
ภาษาอื่น ๆ
การสนับสนุนเครื่องมือแปลภาษา: กรีก, กันนาดา, กาลิเชียน, คลิงออน, คอร์สิกา, คาซัค, คาตาลัน, คินยารวันดา, คีร์กิซ, คุชราต, จอร์เจีย, จีน, จีนดั้งเดิม, ชวา, ชิเชวา, ซามัว, ซีบัวโน, ซุนดา, ซูลู, ญี่ปุ่น, ดัตช์, ตรวจหาภาษา, ตุรกี, ทมิฬ, ทาจิก, ทาทาร์, นอร์เวย์, บอสเนีย, บัลแกเรีย, บาสก์, ปัญจาป, ฝรั่งเศส, พาชตู, ฟริเชียน, ฟินแลนด์, ฟิลิปปินส์, ภาษาอินโดนีเซี, มองโกเลีย, มัลทีส, มาซีโดเนีย, มาราฐี, มาลากาซี, มาลายาลัม, มาเลย์, ม้ง, ยิดดิช, ยูเครน, รัสเซีย, ละติน, ลักเซมเบิร์ก, ลัตเวีย, ลาว, ลิทัวเนีย, สวาฮิลี, สวีเดน, สิงหล, สินธี, สเปน, สโลวัก, สโลวีเนีย, อังกฤษ, อัมฮาริก, อาร์เซอร์ไบจัน, อาร์เมเนีย, อาหรับ, อิกโบ, อิตาลี, อุยกูร์, อุสเบกิสถาน, อูรดู, ฮังการี, ฮัวซา, ฮาวาย, ฮินดี, ฮีบรู, เกลิกสกอต, เกาหลี, เขมร, เคิร์ด, เช็ก, เซอร์เบียน, เซโซโท, เดนมาร์ก, เตลูกู, เติร์กเมน, เนปาล, เบงกอล, เบลารุส, เปอร์เซีย, เมารี, เมียนมา (พม่า), เยอรมัน, เวลส์, เวียดนาม, เอสเปอแรนโต, เอสโทเนีย, เฮติครีโอล, แอฟริกา, แอลเบเนีย, โคซา, โครเอเชีย, โชนา, โซมาลี, โปรตุเกส, โปแลนด์, โยรูบา, โรมาเนีย, โอเดีย (โอริยา), ไทย, ไอซ์แลนด์, ไอร์แลนด์, การแปลภาษา.
- Just wondering, are you the breeder?Was
- ชาวแม่สะเรียง
- what happen
- I am very fond of China especially Chine
- 一个好的分数吗?
- ใส่หมูสับลงผัดให้สุกทั่ว
- The reason for the reset button, say BRN
- providing
- Take more
- results
- but I can see nipple
- ประวัติวัน ฮาโลวีนฮาโลวีน ภาษาอังกฤษ Hal
- Furthermore, waste frying oil, which is
- ฟัง
- เพิ่มความรู้ในด้านบัญชีเพิ่มมากขึ้น
- The reason for the reset button, say BRN
- เพิ่มความรู้ในด้านบัญชีเพิ่มมากขึ้น
- ความเป็นมาของโครงการแก้มลิง โครงการแก้
- แก้ไข
- จากนี้ไป
- ประวัติวัน ฮาโลวีนฮาโลวีน ภาษาอังกฤษ Hal
- Bell
- Just wondering, are you the breeder?Was
- Today we will induce evrebody go to trav
