5.6.3. Sample preparation for detec

5.6.3. Sample preparation for detecting phosphorylation of RIPK1/3
The cells are seeded as described in Section 5.2.1. The cells are
stimulated with the relevant trigger in the presence or absence
of Necrostatin-1. The cells are harvested in function of time (e.g.
15, 30, 60, 90, 120, 240 and 480 min after stimulation). After centrifuging
the cells for 5 min at 250g and removing the PBS, the cells
are lysed in NP-40 lysis buffer (1% NP-40, 10 mM Tris–HCl, pH 7.4,
150 mM NaCl, 10% glycerol, phosphatase inhibitors and protease
inhibitors). Then 0.2 volume of 5 Laemmli buffer is added, and
the samples are boiled for 5–10 min. Equal volumes are loaded
on 8% SDS–polyacrylamide gels for detection of RIP1 phosphorylation
and 8% or 10% SDS–polyacrylamide gels for RIP3. After separation,
the proteins are transferred to a nitrocellulose membrane and
detected by the appropriate antibodies for RIPK1 (BD Biosciences)
or RIPK3 (ProSci Incorporated). The signal is revealed with, e.g.
Chemiluminescence Reagent Plus (PerkinElmer Life Sciences, Boston,
USA).

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

5.6.3 ตัวอย่างการเตรียมการสำหรับการตรวจ phosphorylation ของ RIPK1/3เซลล์มี seeded ตามที่อธิบายไว้ในหัวข้อ 5.2.1 เซลล์อยู่ถูกกระตุ้น ด้วยทริกเกอร์ที่เกี่ยวข้องในสถานะการขาดงานของ Necrostatin-1 เซลล์เก็บเกี่ยวในฟังก์ชันของเวลา (เช่น15, 30, 60, 90, 120, 240 และ 480 นาทีหลังกระตุ้น) หลังจาก centrifugingเซลล์สำหรับ 5 นาที 250g และเอา PBS เซลล์lysed ในบัฟเฟอร์ lysis NP-40 (1% NP-40 ตรี – HCl ค่า pH 7.4, 10 มม.NaCl, 10% กลีเซอร inhibitors ฟอสฟาเตส และรติเอส 150 มม.inhibitors) แล้วเพิ่มปริมาณ 0.2 บัฟเฟอร์ Laemmli 5 และตัวอย่างคือต้มสำหรับโหลดปริมาณเท่ากับ 5 – 10 นาทีบน SDS – polyacrylamide 8% ตรวจ RIP1 phosphorylationและ 8% หรือ 10% SDS – polyacrylamide gels สำหรับ RIP3 หลังจากแยกโปรตีนที่จะถูกโอนไปเยื่อ nitrocellulose และตรวจพบ โดยแอนตี้ที่เหมาะสมสำหรับ RIPK1 (เวลาออก BD)หรือ RIPK3 (ProSci รวม) สัญญาณจะเปิดเผย ด้วย เช่นรีเอเจนต์ chemiluminescence บวก (PerkinElmer ชีวิตวิทยาศาสตร์ บอสตันสหรัฐอเมริกา)

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

5.6.3 . การเตรียมตัวอย่างสำหรับการตรวจหาปฏิกิริยาฟอสโฟรีเลชันของ ripk1 / 3
เซลล์เมล็ดตามที่อธิบายไว้ในส่วน 5.2.1 . เซลล์ที่ถูกกระตุ้นด้วย
ทริกเกอร์ที่เกี่ยวข้องในการแสดงตนหรือขาด
ของ necrostatin-1 . เซลล์ที่เก็บเกี่ยวในฟังก์ชันของเวลา ( เช่น
15 , 30 , 60 , 90 , 120 , 240 และ 480 นาทีหลังจากการกระตุ้น ) หลังจากสาร
เซลล์เป็นเวลา 5 นาที 250 และลบพีบีเอสเซลล์
เป็น lysed ใน np-40 การสลายบัฟเฟอร์ ( 1% np-40 10 มม. นอกจากนี้ – HCl , pH 7.4
150 mM NaCl 10 % กลีเซอรอลและสารยับยั้งเอนไซม์โปรตีเอสอินฮิบิเตอร์ phosphatase
) แล้วเล่ม 5  0.2 laemmli บัฟเพิ่มและ
ตัวอย่างต้ม 5 – 10 นาทีเท่ากับปริมาณโหลด
8 % SDS polyacrylamide เจลเพื่อตรวจหา rip1 ฟอสโฟริเลชัน
8 % หรือ 10 % SDS - polyacrylamide เจล rip3 .หลังจากการแยกโปรตีนจะถูกโอนไปยัง

แผ่นไนโตรและตรวจพบโดยแอนติบอดีที่เหมาะสมสำหรับ ripk1 ( BD BIOSCIENCES )
หรือ ripk3 ( prosci Incorporated ) สัญญาณจะถูกเปิดเผยด้วย เช่น
เคมีลูมิเนสเซนต์รีเอเจนต์พลัส ( วิทยาศาสตร์ , Perkinelmer
ชีวิต Boston , USA )