2. Materials and methods2.1. Biolog

2. Materials and methods
2.1. Biological sample
To maximize the diversity of transcriptional units sampled, a total
of 10 healthy individuals of A. japonicus (body weight: 9.3–10.1 g)
were collected from Guanglu Island, Dalian, China. The body walls,
intestines and respiratory trees were removed and frozen immediately
with liquid nitrogen and then stored at−80 °C for RNA extraction
and cDNA library construction.
2.2. Construction and characterization of cDNA libraries
For each tissue, total RNA was extracted from a pool of equal
proportion of materials from all ten individuals using Takara RNAiso
Reagent (Takara). mRNA was isolated using oligotex-dT30 and mRNA
purification kit (Takara). cDNA synthesis was conducted using 100 ng
of mRNA with Creator SMART cDNA library construction kit
(Clontech). The double-stranded cDNA was ligated into pDNR-LIB
vector in a sense direction (Sfi IA/Sfi IB) and was electro-transformed
into the Escherichia coli strain DH10B. Insert size was determined by
PCR with the vector primer pair T3/T7. The following cycling
conditions were used: 94 °C for 1 min 20 s; 35 cycles at 94 °C for
1 min, 50 °C for 1 min , 72 °C for 1 min 30 s; followed by a final
incubation step of 5 min at 72 °C. The PCR products were separated on
1.0% agarose gels, stained with ethidium bromide and visualized
under UV light.
2.3. Plasmid preparation and DNA sequencing
Individual colonies were randomly picked from the cDNA libraries
and were grown in 96-well plates at 37 °C for 18 h. Bacterial plasmids
were extracted by conventional method and stored at−20 °C prior to
sequencing. Single-pass nucleotide sequence at the 5′-end of each
cDNA was obtained using a T7 universal primer and a 3730XL DNA
analyzer (Applied Biosystems).
2.4. Sequence analysis, contig assembly, and functional categorization
Quality control of sequenced ESTs was performed using the Phred
program with a cut-off of 20 for trimming low quality regions, and
Cross-Match for vector trimming (Ewing et al., 1998; Ewing and
Green, 1998). High-quality ESTs (N100 bp) were then assembled and
clustered into contiguous sequences (contigs) using the Phrap
program set to the default parameters (Gordon et al., 2001). Unigenes
including contigs and singletons were subjected to the NCBI
nonredundant (nr) protein databases for annotation by performing
BLASTX with a cut-off E value of the best hit of ≤10−5. Sequences
without a reliable match (N10−5) were subsequently compared to the
NCBI nt database by performing BLASTN for complementary annotation.
Gene Ontology (GO) information was obtained according to its
UniGene accession number or symbol in the GO Consortium (available
at http://www.geneontology.org/) (Ashburner et al., 2000).

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

2. วัสดุและวิธีการ2.1 การตัวอย่างที่ชีวภาพเพื่อเพิ่มความหลากหลายของหน่วย transcriptional ความ รวมบุคคลที่มีสุขภาพดี 10 ของ A. japonicus (ร่างกายน้ำหนัก: 9.3 – 10.1 g)ถูกรวบรวมไว้จากเกาะ Guanglu ต้าเหลียน จีน ผนังร่างกายลำไส้และระบบทางเดินหายใจต้นไม้ถูกเอาออก และแช่แข็งทันทีมีไนโตรเจนเหลวแล้ว เก็บไว้ at−80 ° C สำหรับสกัดอาร์เอ็นเอและก่อสร้างห้องสมุด cDNA2.2 การก่อสร้างและสมบัติของ cDNA ไลบรารีในแต่ละเนื้อเยื่อ อาร์เอ็นเอรวมถูกแยกจากกลุ่มของเท่ากับสัดส่วนการผลิตจาก 10 ผู้เข้าใช้ Takara RNAisoรีเอเจนต์ (Takara) mRNA ถูกแยกโดยใช้ oligotex dT30 และ mRNAชุดฟอก (Takara) วิธีการสังเคราะห์ cDNA ใช้ 100 ngของ mRNA กับชุดก่อสร้างห้องสมุด cDNA สร้างสมาร์ท(Clontech) CDNA ควั่นคู่ถูกควบเข้า pDNR LIBเวกเตอร์ในทิศทางความรู้สึก (Sfi IA/Sfi IB) และถูกแปลงจี้ใน Escherichia coli สายพันธุ์ DH10B ขนาดแทรกถูกกำหนดโดยPCR กับเวกเตอร์พื้นคู่ T3/T7 การขี่จักรยานต่อไปนี้ใช้เงื่อนไข: 94 ° C สำหรับ 1 นาที 20 s รอบ 35 ที่ 94 ° C สำหรับ1 นาที 50 องศาเซลเซียสใน 1 นาที 72 ° C สำหรับ 1 นาที 30 s ตาม ด้วยคำสุดท้ายขั้นตอนการบ่ม 5 นาทีที่ 72 องศาเซลเซียส ผลิตภัณฑ์ PCR ถูกแยกจากกันใน1.0% agarose เจ สีกับโบรไมด์ ethidium และ visualizedภายใต้แสง UV2.3. plasmid เตรียมการและจัดลำดับของดีเอ็นเออาณานิคมแต่ละได้รับจากห้องสมุด cDNAและมีการเติบโตในดี 96 แผ่นที่ 37 ° C สำหรับ plasmids แบคทีเรีย 18 h.ถูกสกัด โดยวิธีปกติและเก็บ at−20 ° C ก่อนจัดลำดับ เดี่ยวผ่านลำดับนิวคลีโอไทด์ที่ปลาย 5′ ของแต่ละใช้รองพื้นแบบสากล T7 และ 3730XL DNA cDNA กล่าววิเคราะห์ (Biosystems ใช้)2.4 การจัดลำดับวิเคราะห์ แอสเซมบลี contig และประเภทงานทำการควบคุมคุณภาพของ ESTs ตามลำดับโดยใช้การ Phredโปรแกรมตัด 20 สำหรับตัดแต่งคุณภาพต่ำภูมิภาค และตรงกันข้ามสำหรับเวกเตอร์ตัดแต่ง (Ewing et al., 1998 Ewing และสีเขียว 1998) คุณภาพ ESTs (N100 bp) ที่ประกอบแล้ว และคลัสเตอร์ไปติดกันลำดับ (contigs) โดยใช้การ Phrapโปรแกรมตั้งค่าพารามิเตอร์เริ่มต้น (Gordon และ al., 2001) Unigenesรวมทั้ง contigs และ singletons ถูกต้อง NCBIฐานข้อมูลของโปรตีน nonredundant (nr) สำหรับคำอธิบายโดยดำเนินการBLASTX กับค่า E ตัดตีดีที่สุดของ ≤10−5 ลำดับไม่ตรงกันน่าเชื่อถือ (N10−5) ได้มาเปรียบเทียบกับการฐานข้อมูล nt NCBI โดยทำ BLASTN สำหรับคำอธิบายเพิ่มเติมข้อมูลยีนภววิทยา (GO) ได้รับตามความเลขทะเบียน UniGene หรือสัญลักษณ์ใน Consortium ไป (ว่างที่ การ http://www.geneontology.org/) (Ashburner และ al., 2000)

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

2 . วัสดุและวิธีการ
2.1 . ตัวอย่างทางชีวภาพ
เพื่อเพิ่มความหลากหลายของ particle หน่วยตัวอย่าง รวม
10 บุคคลที่มีสุขภาพดี . japonicus ( น้ำหนัก : 9.3 – 10.1 กรัม )
เก็บจาก guanglu เกาะ , Dalian , จีน ผนังลำไส้และร่างกาย
ต้นไม้ทางเดินหายใจถูกถอดออกและแช่แข็งด้วยไนโตรเจนเหลว และจากนั้นทันที
อุณหภูมิ− 80 ° C
การสกัดอาร์เอ็นเอและการสร้างห้องสมุด cDNA .
2.2 . การก่อสร้างและการศึกษาคุณลักษณะของยีนห้องสมุด
แต่ละเนื้อเยื่อ อาร์เอ็นเอทั้งหมดถูกสกัดจากสระว่ายน้ำของสัดส่วนที่เท่ากัน
วัสดุจากทั้งหมดสิบบุคคลที่ใช้ทาการะ rnaiso
Reagent ( ทาการะ ) แยก oligotex-dt30 และชุดของการฟอก mRNA
( ทาการะ ) การสังเคราะห์ cDNA จำนวน 100 ng
ของยีนกับผู้สร้างสมาร์ท cDNA ห้องสมุดชุดการก่อสร้าง
( clontech ) คู่ยีนถูกผูกติดเป็นเวกเตอร์ห้องสมุด
pdnr ในแง่ทิศทาง ( SFI IA IB / SFI ) และโรงแปลง
ใน Escherichia coli dh10b เมื่อย ใส่ขนาดถูกกำหนดโดยวิธี PCR ด้วย primer คู่เวกเตอร์
T3 / * * 3 . ต่อไปนี้จักรยาน
เงื่อนไขที่ใช้ : 94 ° C เป็นเวลา 1 นาที 20 s ; 35 รอบที่ 94 ° C
1 นาที50 ° C เป็นเวลา 1 นาที 72 ° C เป็นเวลา 1 นาที 30 วินาที ตามด้วยขั้นตอนการบ่มสุดท้าย
5 นาทีที่ 72 องศา ผลิตภัณฑ์ทั้งหมดจะถูกแยกออกจากกันใน
1.0 % เจล ( ย้อมด้วยทิเดียมโบรไมด์และมองเห็นแสงยูวี
.
2.3 การเตรียมดีเอ็นเอพลาสมิดและอาณานิคมแต่ละลำดับ
สุ่มเลือกจากห้องสมุด cDNA
และโตในจานที่ 37 ° C 96 ดี 18 H .
) แบคทีเรีย