Crude proteases from P. fluorescens

Crude proteases from P. fluorescens isolates 65 and 117 were highly active in the casein and SMP assays; however, crude protease from P. fragi isolate 102 produced a significant response (P < 0.05) with SMP as substrate only when the 3-M buffer at pH 7.0 was used. For the other two isolates, the highest degree of protease action was observed with the 100-mM pH 7.0 buffer for both casein and SMP substrates, with casein being preferred over SMP (P < 0.05) (Table 1). In the SMP assays, the action of protease was considerably lower (P < 0.05) in the 3-M buffer, which was required to achieve an assay pH of 8.0. The clear preference for casein as substrate was expected as proteases from psychrotrophic pseudomonads show a distinct preference for casein as substrate over whey proteins (Mitchell and Ewings 1985). In the present study, the protein concentration was the same in both casein and skim milk assay mixtures, but the casein assay mixture contained a higher concentration of preferred proteins. Synthetic substrates such as azocasein and FITCcasein are typically used in protease assays with short incubation times. Therefore, optimization of the assay mixture composition and assay conditions was required to make them suitable for longer incubations, necessary to detect very low levels of protease. The azocasein assay is a simple and straightforward colorimetric protease assay. The results of the present study indicate that azocasein could be a suitable substrate for detection of low protease levels in UHT milk. There was only a negligible decomposition of the azo dye over the 24-h incubation period of the assay. The addition of crude protease to the UHT milk samples resulted in quantifiable proteolysis for each concentration of each crude enzyme preparation (Table 2). Furthermore, with P. fluorescens isolates 65 and 117, an increase in the concentration of added crude protease resulted in an increase in release of the dye from the substrate (P < 0.05). Assays based on fluorogenic substrates are generally regarded as more sensitive than those based on chromogenic substrates, and this was true for FITC-casein compared to azocasein (Table 2). An increase in the concentration of added crude protease resulted in an increase in fluorescence intensity for P. fluorescens isolates 65 and 117. In addition, there was no substrate decomposition over the long incubation time employed.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

Proteases ดิบจาก P. fluorescens แยก 65 และ 117 ถูกใช้งานมากในเคซีนและ SMP assays อย่างไรก็ตาม รติเอสดิบจาก P. fragi แยก 102 ผลิตการตอบสนองอย่างมีนัยสำคัญ (P < 0.05) กับ SMP เป็นพื้นผิวเมื่อมีใช้บัฟเฟอร์ที่ pH 7.0 3 M สำหรับอื่น ๆ สองแยก ระดับสูงสุดของการดำเนินการรติเอสถูกสังเกต ด้วยบัฟเฟอร์ 100 มม.ค่า pH 7.0 ทั้งเคซีนและพื้นผิว SMP กับเคซีนที่จะต้องผ่าน SMP (P < 0.05) (ตารางที่ 1) ใน SMP assays การดำเนินการของรติเอสถูกมากต่ำกว่า (P < 0.05) ในบัฟเฟอร์ 3 M ซึ่งเป็นสิ่งจำเป็นเพื่อให้การทดสอบ pH 8.0 การกำหนดลักษณะที่ชัดเจนสำหรับเคซีนเป็นพื้นผิวคาดหวังเป็น proteases จาก psychrotrophic pseudomonads เอียงหมดเคซีนเป็นพื้นผิวมากกว่าเวย์โปรตีน (Mitchell และ Ewings 1985) ในปัจจุบันศึกษา ความเข้มข้นของโปรตีนเหมือนกันในทั้งเคซีนและน้ำยาผสมทดสอบ skim นม แต่ทดสอบผสมเคซีนประกอบด้วยความเข้มข้นสูงของโปรตีนที่ต้องการ วัสดุสังเคราะห์เช่น azocasein และ FITCcasein มักจะใช้ใน assays รติเอสที่เวลาการฟักตัวสั้น ดังนั้น เพิ่มประสิทธิภาพของการวิเคราะห์องค์ประกอบส่วนผสมและทดสอบเงื่อนไขถูกต้องให้เหมาะสมอีกต่อไป incubations จำเป็นต้องตรวจหาระดับต่ำมากรติเอส ทดสอบ azocasein ทดสอบง่าย และตรงไปตรงมารติเอสเทียบเคียงได้ ผลของการศึกษาในปัจจุบันบ่งชี้ azocasein ที่เป็นพื้นผิวที่เหมาะสมสำหรับการตรวจหาระดับรติเอสต่ำในนมยูเอชที มีเฉพาะที่ระยะแยกส่วนประกอบของสีย้อม azo ระยะฟักตัว 24-h ของการทดสอบ นอกจากนี้รติเอสดิบเพื่อตัวอย่างนมยูเอชทีให้ proteolysis วัดปริมาณได้สำหรับแต่ละความเข้มข้นของแต่ละเตรียมเอนไซม์ดิบ (ตารางที่ 2) นอกจากนี้ กับ P. fluorescens ล 65 และ 117 การเพิ่มความเข้มข้นของรติเอสดิบเพิ่มผลเพิ่มในรุ่นของสีย้อมจากพื้นผิว (P < 0.05) โดยทั่วไปถือตามพื้นผิว fluorogenic assays เป็นสำคัญยิ่งกว่าอยู่บนพื้นผิว chromogenic และนี้คือความจริงสำหรับ FITC-เคซีนเมื่อเทียบกับ azocasein (ตารางที่ 2) การเพิ่มความเข้มข้นของรติเอสดิบเพิ่มผลในการเพิ่มความเข้ม fluorescence สำหรับ P. fluorescens แยก 65 และ 117 นอกจากนี้ มีไม่แยกส่วนประกอบพื้นผิวเวลาฟักตัวนานจ้าง

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

โปรตีเอหยาบจาก P. fluorescens สายพันธุ์ 65 และ 117 ถูกใช้งานอย่างมากในการตรวจและเคซีน SMP; แต่โปรติเอสสกัดจาก P. fragi แยก 102 ผลิตการตอบสนองอย่างมีนัยสำคัญ (P <0.05) กับ SMP เป็นสารตั้งต้นเฉพาะเมื่อ 3-M บัฟเฟอร์ที่ pH 7.0 ที่ใช้ สำหรับอีกสองสายพันธุ์ที่ระดับสูงสุดของการกระทำโปรตีเอสเป็นข้อสังเกตที่มีค่า pH 100 มิลลิ 7.0 บัฟเฟอร์สำหรับทั้งเคซีนและพื้นผิว SMP กับเคซีนเป็นที่ต้องการมากกว่า SMP (p <0.05) (ตารางที่ 1) ในการตรวจ SMP, การกระทำของโปรติเอสเป็นอย่างมากต่ำ (P <0.05) ในบัฟเฟอร์ 3-M ซึ่งเป็นที่จำเป็นเพื่อให้บรรลุความเป็นกรดด่างของการทดสอบ 8.0 การตั้งค่าที่ชัดเจนสำหรับเคซีนเป็นสารตั้งต้นที่คาดว่าเป็นโปรตีเอสจาก pseudomonads psychrotrophic แสดงความชอบแตกต่างกันสำหรับเคซีนเป็นสารตั้งต้นมากกว่าโปรตีนเวย์ (มิตเชลล์และ Ewings 1985) ในการศึกษาความเข้มข้นของโปรตีนได้เหมือนกันทั้งในเคซีนและหางนมผสมทดสอบ แต่ส่วนผสมทดสอบเคซีนที่มีความเข้มข้นสูงกว่าของโปรตีนที่ต้องการ พื้นผิวสังเคราะห์เช่น azocasein FITCcasein และมักจะใช้ในการตรวจโปรติเอสกับเวลาฟักตัวสั้น ดังนั้นการเพิ่มประสิทธิภาพขององค์ประกอบส่วนผสมทดสอบและเงื่อนไขการทดสอบที่ถูกต้องจะทำให้พวกเขาเหมาะสำหรับการฟักตัวของเชื้ออีกต่อไปจำเป็นที่จะต้องตรวจสอบในระดับที่ต่ำมากของโปรติเอส ทดสอบ azocasein เป็นโปรติเอสสีที่เรียบง่ายและตรงไปตรงมาทดสอบ ผลที่ได้จากการศึกษาครั้งนี้แสดงให้เห็นว่า azocasein อาจจะเป็นพื้นผิวที่เหมาะสมสำหรับการตรวจหาระดับต่ำโปรตีเอสในนมยูเอชที มีเพียงเล็กน้อยจากการสลายตัวของสีย้อม azo ในช่วงระยะเวลาการบ่ม 24 ชั่วโมงของการทดสอบ นอกเหนือจากโปรติเอสน้ำมันดิบเพื่อเก็บตัวอย่างนมยูเอชทีมีผลในเชิงปริมาณ proteolysis สำหรับแต่ละความเข้มข้นของการเตรียมเอนไซม์แต่ละน้ำมันดิบ (ตารางที่ 2) นอกจากนี้ยังมี P. fluorescens สายพันธุ์ 65 และ 117, การเพิ่มขึ้นของความเข้มข้นของเอนไซม์โปรติเอน้ำมันดิบเพิ่มผลในการเพิ่มขึ้นในการเปิดตัวของสีย้อมจากพื้นผิว (P <0.05) การตรวจขึ้นอยู่กับพื้นผิว fluorogenic ได้รับการยกย่องโดยทั่วไปเป็นความสำคัญมากขึ้นกว่าผู้ที่อยู่บนพื้นฐานของพื้นผิว chromogenic และนี่คือความจริงสำหรับ FITC-เคซีนเมื่อเทียบกับ azocasein (ตารางที่ 2) การเพิ่มขึ้นของความเข้มข้นของเอนไซม์โปรติเอน้ำมันดิบเพิ่มผลในการเพิ่มความเข้มการเรืองแสงสำหรับ P. fluorescens สายพันธุ์ 65 และ 117 นอกจากนี้ยังมีการสลายตัวของสารตั้งต้นที่ไม่มีช่วงเวลาบ่มนานลูกจ้าง

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

ดิบ proteases จากหน้าี่แยก 65 และ 117 มีการใช้งานสูงในเคซีนและ SMP ) ; อย่างไรก็ตาม , ดิบโปรตีนจากหน้าีนแยก 102 ผลิตการตอบสนองอย่างมีนัยสำคัญทางสถิติ ( P < 0.05 ) กับ SMP เป็นสับสเตรทเมื่อบัฟเฟอร์ 3-m ที่ pH 7.0 . สำหรับอีกสองสายพันธุ์ระดับสูงสุดของโปรติเอสจากการกระทํากับ 100 มม. pH 70 กันชนทั้งเคซีนและ SMP พื้นผิวกับเคซีนเป็นที่ต้องการมากกว่า SMP ( P < 0.05 ) ( ตารางที่ 1 ) ใน SMP ) , การกระทำของเอนไซม์โปรตีเอสถูกมากต่ำกว่า ( P < 0.05 ) ในบัฟเฟอร์ 3-m ซึ่งเป็นเพื่อให้บรรลุการใช้ pH 8.0 .ล้างการตั้งค่าสำหรับเคซีนเป็นสับสเตรทที่คาดว่าเป็นทางจากไซโครโทรป pseudomonads แสดงที่แตกต่างกันการตั้งค่าสำหรับเคซีนเป็นโปรตีนเวย์ ( มิเชล และพื้นผิวกว่ายูอิงส์ 1985 ) ในการศึกษาความเข้มข้นของโปรตีนเคซีนและอ่านเหมือนกันทั้งในวิธีผสมนม แต่ส่วนผสมมีความเข้มข้นสูงขึ้น ( เคซีนโปรตีนที่ต้องการพื้นผิวสังเคราะห์ เช่น azocasein fitccasein และมักจะใช้ในโปร ) กับเวลาระยะเวลาสั้น ดังนั้น การเพิ่มประสิทธิภาพของการทดสอบการผสมองค์ประกอบและเงื่อนไขการทดสอบ คือต้องทำให้พวกเขาเหมาะสำหรับ incubations อีกต่อไป จำเป็นต้องตรวจหาต่ำมากระดับของโปรติเอส การ azocasein assay เป็นง่ายและตรงไปตรงมา 7.4 โปรตีน ตามลำดับผลของการศึกษาพบว่า azocasein สามารถพื้นผิว เหมาะสำหรับการตรวจหาระดับโปรตีนต่ำในนม ยูเอชที มีเพียงเล็กน้อย การเน่าเปื่อยของสีย้อม azo กว่า 24-h ฟักตัวของแบคทีเรีย นอกจากนี้ของดิบโปรกับนมกล่องตัวอย่าง ( quantifiable โปรตีโ ลซิสสำหรับแต่ละความเข้มข้นของแต่ละเอนไซม์ที่เตรียม ( ตารางที่ 2 )นอกจากนี้ กับ P . fluorescens สายพันธุ์ 65 และ 117 , การเพิ่มขึ้นของความเข้มข้นของ crude protease เพิ่ม มีผลทำให้มีการเพิ่มรุ่นของสีย้อมจากพื้นผิว ( P < 0.05 ) ตรวจยึด fluorogenic พื้นผิวโดยทั่วไปจะถือว่าเป็นละเอียดอ่อนกว่านั้นขึ้นอยู่กับการสนทนาผ่านข้อความโต้ตอบแบบทันที ) , และนี้เป็นจริงสำหรับ fitc เคซีนเมื่อเทียบกับ azocasein ( ตารางที่ 2 )การเพิ่มความเข้มข้นของ crude protease เพิ่มให้เพิ่มความเข้มในการแยกและ P . fluorescens 65 117 นอกจากนี้ ไม่มีสารสลายตัวไป ยาว ระยะเวลาที่ใช้