Materials and MethodsSpecimens Samp

Materials and Methods
Specimens Sampling
The Animal Use Ethics Committee of the Kunming Institute of
Zoology, the Chinese Academy of Sciences approved the study.
Argusianus argus, Crossoptilon crossoptilon and Ithaginis cruentus were
used for mt genome sequencing. A total of 23 species were used for
nuclear gene sequencing (Table S1 File S1). Feather samples of
Argusianus argus were provided by Beijing Zoo and the Museum of
the Kunming Institute of Zoology provided muscle tissue for all
other samples. Additional complete mt genomes and nuclear
segments were obtained from GenBank (Table S1 in File S1).
DNA Extraction, PCR Amplification, and Sequencing
Total genomic DNA was extracted using standard 3-step
phenol/chloroform extraction methods [21]. For mitochondrial
genomes, primers were described in our previous study [19]. For
seven nuclear segments (BDNF, CMOS, FIB4, NGFB, NTF3,
OVOG, and ZENK), primers were described in Table S2 in File S1.
PCR amplifications were conducted in a 50 ml volume containing
5 ml of 106reaction buffer, 0.2 mM dNTPs, 0.2 mM each primer,
1.5 U Taq DNA polymerase (TaKaRa Biosystems), and approximately
2 ng total DNA. PCR amplifications were carried out
using the following parameters: 95uC 4 min, 20 cycles of
denaturation at 94uC for 1 min, annealing at 60–50uC (1 min;
0.5uC/cycle), extension at 72uC for 1 min, and finally 15 cycles of
94uC 1 min, 50uC 1 min, 72uC 1 min. PCR products were cleaned using Watson RCR Purification Kits (Watson BioTechnologies,
Shanghai). PCR products were sequenced at least three
times in both directions on an ABI 3730 Sequencer (Applied
Biosystems, Foster, CA, USA) using the ABI PRISM BigDye
Terminator v3.0 sequencing kit. DNA sequences were edited using
DNAstar Seqman software (DNASTAR Inc., Madison, WI, USA).
The newly determined sequences were deposited in GenBank
(GenBank accession numbers: JQ713766–JQ713768; JQ713656–
JQ713765).
Phylogenetic Reconstruction
The nucleotide sequence data sets were initially aligned using
ClustalX 1.81 [22] with default parameters. The combined and
individual 13 mitochondrial protein coding genes, and the
combined data of seven nuclear segments were analyzed
separately using maximum likelihood (ML) implemented in
PAUP* 4.0b10 [23]. Modeltest 3.7 [24] was used to select the
preferred models of evolution under the Akaike Information
Criterion. ML heuristic searches used TBR branch swapping
executed in 100 replicates with the selected models. Because
heuristic searches in PAUP* were very slow, we used two
additional fast ML-based inference packages using 1,000 replicates
each: RAxML [25] and PHYML [26]. Because their topologies
were identical, and only a few bootstrap values slightly differed, we
only presented trees with bootstrap values from PAUP*. Bayesian
inference (BI) was performed using MrBayes 3.1.2 [27]. The
analyses used models estimated with Modeltest 3.7 under AICTwo separate runs were performed with four Markov chains. Each
run was conducted with 36106 generations and sampled every 100
generations. When the log-likelihood scores were found to
stabilize, a consensus tree was calculated after omitting the first
25% trees as burn-in. In all these topology reconstruction, Alectura
lathami was set as the outgroup according a previous study [19].

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

วัสดุและวิธีการไว้เป็นตัวอย่างการสุ่มตัวอย่างกรรมการจรรยาบรรณการใช้สัตว์ของ สถาบันคุนหมิงสัตววิทยา สถาบันวิทยาศาสตร์จีนอนุมัติการศึกษาอา Argusianus, Crossoptilon crossoptilon และ Ithaginis cruentusใช้สำหรับ mt จีโนมลำดับ จำนวน 23 ชนิดใช้สำหรับลำดับยีนนิวเคลียร์ (ตาราง S1 แฟ้ม S1) ตัวอย่างการขนของอา Argusianus ได้ตามสวนสัตว์ปักกิ่งและพิพิธภัณฑ์ของสถาบันสัตววิทยาคุนหมิงให้กล้ามเนื้อทั้งหมดตัวอย่างอื่น ๆ Genomes mt เพิ่มเติมให้สมบูรณ์ และนิวเคลียร์เซ็กเมนต์ที่ได้รับจาก GenBank (ตาราง S1 ใน S1 แฟ้ม)สกัดดีเอ็นเอ PCR ขยาย และจัดลำดับรวม genomic DNA ถูกสกัดโดยใช้มาตรฐาน 3 ขั้นตอนวิธีการสกัดวาง/คลอโรฟอร์ม [21] สำหรับ mitochondrialgenomes ไพรเมอร์ได้อธิบายไว้ในการศึกษาของเราก่อนหน้านี้ [19] สำหรับส่วนนิวเคลียร์ 7 (BDNF, CMOS, FIB4, NGFB, NTF3OVOG และ ZENK), ไพรเมอร์ได้อธิบายไว้ในตาราง S2 ใน S1 แฟ้มPCR amplifications ได้ดำเนินการในที่ประกอบด้วยปริมาตร 50 ml5 ml ของ 106reaction บัฟเฟอร์ dNTPs มม. 0.2, 0.2 มม.แต่ละพื้น1.5 U Taq DNA พอลิเมอเรส (TaKaRa Biosystems), และประมาณ2 ng รวมดีเอ็นเอ PCR amplifications ได้ดำเนินการโดยใช้พารามิเตอร์ต่อไปนี้: 4 นาที 20 รอบของ 95uCdenaturation ที่ 94uC ใน 1 นาที การอบเหนียวที่ 60-50uC (1 นาที0.5uC / รอบ), 72uC ใน 1 นาที และรอบสุดท้าย 15 ของ94uC 1 นาที 1 นาที 1 นาที PCR 72uC 50uC ผลิตภัณฑ์มีความสะอาดโดยใช้ชุดฟอก RCR วัตสัน (Watson BioTechnologiesเซี่ยงไฮ้) ผลิตภัณฑ์ PCR ได้เรียงลำดับที่สามในทั้งสองทิศทางบน Sequencer ที่ 3730 ABI (ประยุกต์Biosystems ฟอสเตอร์ CA, USA) ใช้ BigDye ปริซึม ABIเทอร์มิเนเตอร์ v3.0 ลำดับชุด ลำดับดีเอ็นเอถูกแก้ไขโดยใช้ซอฟต์แวร์ DNAstar Seqman (DNASTAR Inc. เมดิสัน WI สหรัฐอเมริกา)ลำดับที่กำหนดใหม่ได้ฝากใน GenBank(เลขทะเบียน GenBank: JQ713766 – JQ713768 JQ713656 –JQ713765)ฟื้นฟู phylogeneticชุดข้อมูลลำดับของนิวคลีโอไทด์ถูกจัดใช้ครั้งแรกClustalX [22] 1.81 กับพารามิเตอร์เริ่มต้น การรวม และละ 13 โปรตีน mitochondrial รหัสยีน และมีวิเคราะห์ข้อมูลรวมของเซ็กเมนต์นิวเคลียร์ 7โดยสูงสุดโอกาส (ML) นำมาใช้ในPAUP * 4.0b10 [23] Modeltest 3.7 [24] ถูกใช้เพื่อเลือกการรุ่นที่ต้องการของวิวัฒนาการภายใต้ข้อมูล Akaikeเกณฑ์การ ค้นหาแล้ว ML ใช้เปลี่ยนสาขา TBRดำเนินการใน 100 เหมือนกับกับรุ่นที่เลือก เนื่องจากแล้วค้นหาใน PAUP ได้ช้ามาก เราใช้สองแพคเกจเร็ว ML ตามข้อเพิ่มเติมที่ใช้เหมือนกับ 1000ละ: RAxML [25] และ PHYML [26] เนื่องจากโทของพวกเขาได้เหมือนกัน และเพียงไม่กี่เริ่มต้นระบบค่าเล็กน้อยแตก ต่าง เราเพียง แสดงต้นไม้ มีค่าเริ่มต้นระบบจาก PAUP ทฤษฎีข้อ (BI) ที่ดำเนินการโดยใช้ MrBayes 3.1.2 [27] ที่วิเคราะห์ใช้แบบจำลองประเมินกับ 3.7 Modeltest ภายใต้ AICTwo แยกดำเนินทำกับสี่ Markov chains แต่ละrun was conducted with 36106 generations and sampled every 100generations. When the log-likelihood scores were found tostabilize, a consensus tree was calculated after omitting the first25% trees as burn-in. In all these topology reconstruction, Alecturalathami was set as the outgroup according a previous study [19].

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

วัสดุและวิธีการตัวอย่างการสุ่มตัวอย่างคณะกรรมการจริยธรรมการใช้สัตว์ของคุนหมิสถาบันสัตววิทยาจีนAcademy of Sciences ได้รับการอนุมัติการศึกษา. Argusianus argus, crossoptilon Crossoptilon และ Ithaginis cruentus ถูกใช้สำหรับการเมาลำดับจีโนม ทั้งหมด 23 สายพันธุ์ที่ถูกใช้สำหรับการจัดลำดับของยีนนิวเคลียร์(ตารางที่ S1 ไฟล์ S1) ตัวอย่างขนของArgusianus argus มีให้โดยสวนสัตว์ปักกิ่งและพิพิธภัณฑ์ของสถาบันคุนหมิสัตววิทยาให้เนื้อเยื่อของกล้ามเนื้อสำหรับทุกตัวอย่างอื่นๆ จีโนมที่สมบูรณ์เพิ่มเติมตันและนิวเคลียร์ส่วนที่ได้รับจาก GenBank (ตารางที่ S1 ในไฟล์ S1). การสกัดดีเอ็นเอ PCR Amplification และลำดับรวมดีเอ็นเอถูกสกัดโดยใช้มาตรฐาน3 ขั้นตอนฟีนอล/ วิธีการสกัดคลอโรฟอร์ม [21] สำหรับยลจีโนมของไพรเมอร์ได้รับการอธิบายไว้ในการศึกษาก่อนหน้านี้ [19] สำหรับเจ็ดส่วนนิวเคลียร์ (BDNF, CMOS, FIB4, NGFB, NTF3, OVOG และ Zenk) ไพรเมอร์ได้รับการอธิบายไว้ในตาราง S2 ในไฟล์ S1. เครื่องขยายเสียง PCR ได้ดำเนินการในปริมาณ 50 มล. ที่มี5 มิลลิลิตร 106reaction บัฟเฟอร์ 0.2 มิลลิ dNTPs 0.2 มิลลิแต่ละไพรเมอร์, 1.5 U Taq ดีเอ็นเอโพลิเมอร์ (Takara Biosystems) และประมาณ2 ng ดีเอ็นเอรวม เครื่องขยายเสียง PCR ได้ดำเนินการโดยใช้พารามิเตอร์ต่อไปนี้: 95uC 4 นาที, 20 รอบของการสูญเสียสภาพธรรมชาติที่94uC เวลา 1 นาที, หลอมที่ 60-50uC (1 นาที; 0.5uC / รอบ) ส่วนขยายที่ 72uC เวลา 1 นาทีและในที่สุดก็ 15 รอบ ของ94uC 1 นาที, 50uC 1 นาที, 72uC 1 นาที ผลิตภัณฑ์พีซีอาร์ได้รับการทำความสะอาดโดยใช้วัตสัน RCR บริสุทธิ์ชุด (วัตสันวิทยาการ, Shanghai) ผลิตภัณฑ์ PCR มีลำดับขั้นตอนอย่างน้อยสามครั้งในทั้งสองทิศทางในซีเควนABI 3730 (Applied Biosystems, ฟอสเตอร์, CA, USA) โดยใช้ ABI PRISM BigDye Terminator ชุดลำดับ v3.0 ลำดับดีเอ็นเอถูกแก้ไขโดยใช้ซอฟแวร์ DNAstar Seqman (DNASTAR อิงค์แมดิสัน, WI, USA). ลำดับที่กำหนดขึ้นใหม่ถูกฝากไว้ใน GenBank (GenBank หมายเลขภาคยานุวัติ: JQ713766-JQ713768; JQ713656- JQ713765). Phylogenetic ฟื้นฟูข้อมูลลำดับเบสเป็นชุดชิดครั้งแรกโดยใช้ClustalX 1.81 [22] กับค่าเริ่มต้น รวมและแต่ละ 13 ยีนเข้ารหัสโปรตีนยลและข้อมูลรวมของเจ็ดส่วนนิวเคลียร์ถูกนำมาวิเคราะห์แยกโดยใช้ความน่าจะเป็นสูงสุด(ML) ดำเนินการในPAUP * 4.0b10 [23] Modeltest 3.7 [24] ถูกใช้ในการเลือกรูปแบบที่ต้องการของวิวัฒนาการภายใต้Akaike ข้อมูลเกณฑ์ ค้นหา ML ใช้แก้ปัญหาการแลกเปลี่ยนสาขา TBR ดำเนินการใน 100 ซ้ำกับรุ่นที่เลือก เพราะการค้นหาแก้ปัญหาใน PAUP * ได้ช้ามากเราใช้สองเพิ่มเติมได้อย่างรวดเร็วML-ตามแพคเกจ 1,000 อนุมานใช้ซ้ำแต่ละRAxML [25] และ PHYML [26] เพราะโครงสร้างของพวกเขาเหมือนกันและมีเพียงไม่กี่บูตค่าแตกต่างกันเล็กน้อยเราเพียงแต่นำเสนอต้นไม้ที่มีค่าบูตจาก PAUP * คชกรรมอนุมาน (BI) ได้รับการดำเนินการโดยใช้ MrBayes 3.1.2 [27] การวิเคราะห์รูปแบบการใช้งานที่มีประมาณ 3.7 Modeltest ภายใต้การทำงานที่แยกจากกัน AICTwo ได้ดำเนินการกับสี่โซ่มาร์คอฟ แต่ละคนทำงานได้ดำเนินการกับ 36,106 ตัวอย่างรุ่นและทุก ๆ 100 รุ่น เมื่อเข้าสู่ระบบคะแนนความน่าจะพบว่ามีเสถียรภาพต้นไม้มติที่คำนวณได้หลังจากใส่ครั้งแรกต้น25% ในขณะที่การเผาไหม้ใน ในทุกการฟื้นฟูโครงสร้างเหล่านี้ Alectura lathami ได้รับการกำหนดให้เป็น outgroup ตามการศึกษาก่อนหน้า [19]