Viruses target specific host cell m

Viruses target specific host cell molecules that would otherwise restrict viral propagation. The HIV-1 and other lentiviral genomes encode different sets of accessory proteins directed at eluding host adaptive and innate immune mechanisms to promote viral replication in specific cell environments (1, 2). The Vpx and Vpr accessory proteins have been linked mostly to infection of myeloid lineage cells by HIVs (3). The Vpx accessory protein is found exclusively in HIV-2 and some simian immunodeficiency viruses, and Vpr is found in HIV-1 and HIV-2. Vpx targets a restriction factor that prohibits viral DNA synthesis in monocytic cells (4–6). Recently, the protein encoded by the SAMHD1 gene was identified as the HIV-1 restriction factor in cells of the myeloid lineage (7, 8). SAMHD1 is thought to inhibit an early step in the viral life cycle by interfering with efficient synthesis of viral DNA, but the mechanism is not known.

SAMHD1 was identified as an interferon-induced protein in human macrophages and dendritic cells (9–12), suggesting a function in the innate immune response. Mutations in SAMHD1 cause the severe neurodegenerative disorder Aicardi-Goutières syndrome (13), a genetic encephalopathy that closely mimics congenital viral infection and is characterized by inappropriate immune activation and aberrant interferon-α secretion (14–16). Likewise, mutations in the TREX1 exonuclease gene and in the three genes encoding the RNase H2 endonuclease cause Aicardi-Goutières syndrome, linking nucleic acid metabolism with this autoimmune disorder (17–19). TREX1 is the major 3′-exonuclease that degrades cellular single- and double-stranded DNA (20–26). In HIV-1-infected cells, TREX1 degrades nonproductive transcripts to clear excess viral cDNA, preventing innate immune activation (27, 28). The RNase H2 recognizes and cleaves ribonucleotides present in RNA/DNA duplexes (29, 30), and silencing RNASEH2A impairs HIV replication (31). This suggests a role in HIV infection. Thus, SAMHD1, TREX1, and RNase H2 participate in a cellular nucleic acid metabolic pathway that overlaps the interferon-mediated innate antiviral and inflammatory responses.

The catalytic activity of SAMHD1 is identified in this study. The SAMHD1 contains an N-terminal putative protein-protein interaction sterile α motif (SAM)4 domain and a C-terminal predicted phosphohydrolase HD (His···His-Asp···Asp) domain. The SAMHD1 was cloned, and bacterially expressed recombinant enzyme was generated in sufficient quantities and purity to perform biochemical studies. The enzymatic properties indicate that the SAMHD1 HIV-1 restriction factor is a dGTP-regulated deoxynucleotide triphosphohydrolase.

Go to:
EXPERIMENTAL PROCEDURES
Materials
The nucleotides were from Sigma, and calf intestinal phosphatase was from Promega. The human and mouse SAMHD1 cDNAs (Invitrogen) were recovered by PCR and cloned into the pCDFDuet-1 (Novagen) plasmid. The HD domain constructs were prepared by PCR, and final constructs were verified by DNA sequencing.

Enzyme Preparation
In expression studies, a His6 tag was cloned at the N or C terminus of the complete human and mouse SAMHD1 cDNAs, and maximal yields of soluble enzymes were recovered using the mouse N-terminal His6 tag SAMHD1 constructs (data not shown). Mouse SAMHD1 plasmid constructs were transformed into Escherichia coli BL21 (DE3) Rosetta 2 cells (Novagen), grown to an A600 = 0.5 at 37 °C, and quickly cooled on ice to 17 °C. After induction with 1 mm isopropyl-β-d-thiogalactopyranoside, the cells were allowed to grow for 18 h at 17 °C. The SAMHD1 enzymes in cell extracts were bound to a nickel-nitrilotriacetic acid resin (Qiagen), washed, eluted, and purified to homogeneity using Mono S chromatography (supplemental Fig. S1). TREX1 and RNase H2 were purified as described (22, 30). Protein concentrations were determined by A280 using the molar extinction coefficient for complete mouse SAMHD1 ϵ = 63,800 m−1 cm−1 and for SAMHD1 HD domain (amino acids 117–627) ϵ = 58,050 m−1 cm−1.

Phosphohydrolase Assays
Reactions (100 μl) were performed at 25 °C in 96-well microplates initiated by enzyme addition, and activity was monitored continuously at A410 using a Tecan Safire2TM. Phosphatase reactions contained 50 mm HEPES (pH 7.0), 4 mm p-nitrophenyl phosphate, 5 mm of the indicated divalent metal ion, and 500 nm SAMHD1. Phosphodiesterase reactions (100 μl) contained 50 mm Tricine (pH 8.5), 4 mm bis-p-nitrophenyl phosphate or p-nitrophenyl 5′-thymidine monophosphate, 5 mm of the indicated divalent metal ion, and 500 nm SAMHD1 (32).

Nucleotide Phosphohydrolase Assays
The nucleotide phosphohydrolase reactions contained 20 mm Tris-HCl (pH 7.5), 2 mm dithiothreitol, 1 μm EDTA, 5 mm MgCl2, the indicated nucleotides, and SAMHD1 enzyme. Reactions were incubated for the indicated times at 25 °C and stopped by the addition of EDTA to 5 mm final concentration. Protein was removed using 10,000 molecular weight cut-off concentrators (Millipore), and samples (10 μl) of the filtered solution were analyzed by ion pair reverse-phase chromatography (33, 34) using a CAPCELL PAK C18 column (Shiseido Fine Chemicals) on a Waters HPLC system. The column was equilibrated with buffer (20 mm sodium phosphate (pH 7.0), 5 mm tetra n-butylammonium phosphate, and 5% methanol) and eluted with a linear gradient of methanol from 5 to 60%. Products and reactants were quantified by measuring the A254. Quantification of the absorbance peaks was performed using the Empower software (Waters).

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

ไวรัสเป้าหมายโมเลกุลเซลล์โฮสต์บางที่จะจำกัดการแพร่กระจายไวรัส เอชไอวี-1 และอื่น ๆ genomes lentiviral เข้ารหัสชุดเสริมโปรตีนโดยตรงที่ eluding ข้อสอบ และปรับกลไกภูมิคุ้มกันโฮสต์ไวรัสจำลองแบบในสภาพแวดล้อมเฉพาะ (1, 2) ส่งเสริม โปรตีนเสริม Vpx และ Vpr มีการเชื่อมโยงส่วนใหญ่การติดเชื้อของเซลล์ลินเนจชนิดไมอิลอยด์ โดย HIVs (3) โปรตีนเสริม Vpx พบเฉพาะในเอชไอวี-2 และบางไวรัสเอชไอวีสิมิลัน และ Vpr พบเชื้อเอชไอวี-1 และเอชไอวี-2 Vpx เป้าหมายปัจจัยข้อจำกัดที่ห้ามทำการสังเคราะห์ดีเอ็นเอไวรัสในเซลล์ monocytic (4-6) ล่าสุด โปรตีนที่เข้ารหัส โดยยีน SAMHD1 ที่ระบุเป็นตัวจำกัดการเอชไอวี 1 ในเซลล์ของคนเชื้อสายชนิดไมอิลอยด์ (7, 8) SAMHD1 เป็นความคิดยับยั้งขั้นตอนการเริ่มต้นวงจรชีวิตของไวรัส โดยการรบกวนการสังเคราะห์ดีเอ็นเอไวรัสมีประสิทธิภาพ แต่ไม่ทราบกลไกSAMHD1 ที่ระบุเป็นโปรตีนเกิดอินเตอร์ฟีรอนมนุษย์บังเอิญและเซลล์ dendritic (9-12), การแนะนำฟังก์ชั่นในการตอบสนองภูมิคุ้มกันโดยธรรมชาติ กลายพันธุ์ใน SAMHD1 ทำให้เกิดการรุนแรง neurodegenerative โรค Aicardi Goutières กลุ่มอาการ (13), encephalopathy พันธุที่เลียนแบบการติดเชื้อไวรัสแต่กำเนิดอย่างใกล้ชิด และโดยการเปิดใช้งานภูมิคุ้มกันที่ไม่เหมาะสมและด้วยกองทัพอินเตอร์ฟีรอน aberrant หลั่ง (14-16) ในทำนองเดียวกัน กลายพันธุ์ ในยีน exonuclease TREX1 และยีนสามรหัส endonuclease RNase H2 ทำให้เกิดกลุ่มอาการ Aicardi Goutières เชื่อมโยงเมแทบอลิซึมของกรดนิวคลีอิก มีโรคผิดปกตินี้ (17-19) TREX1 เป็นการใหญ่ 3′-exonuclease ที่เสื่อมเซลเดียว - และสองควั่น DNA (20-26) เอชไอวี-1-ติดเชื้อเซลล์ TREX1 เสื่อมรวบใบแสดงผลการล้างส่วนเกิน cDNA ไวรัส ป้องกันการเรียกใช้ภูมิคุ้มกันโดยธรรมชาติ (27, 28) RNase H2 รู้จัก และแยกออก ribonucleotides ใน duplexes/ดี เอ็นเออาร์เอ็นเอ (29, 30), และ silencing RNASEH2A แตกจำลองเอชไอวี (31) นี้แนะนำในการติดเชื้อเอชไอวี ดังนั้น SAMHD1, TREX1 และ RNase H2 เข้าร่วมในการเป็นโทรศัพท์มือถือกรดนิวคลีอิกเมแทบอลิซึมที่ทับซ้อน mediated อินเตอร์ฟีรอนข้อสอบยาต้านไวรัส และอักเสบตอบสนองมีระบุกิจกรรมของ SAMHD1 ตัวเร่งปฏิกิริยาในการศึกษานี้ SAMHD1 ประกอบด้วยการเทอร์มินัล N โปรตีนโปรตีน putative โต้ตอบด้วยกองทัพกอซแปลน (สาม) 4 โดเมนและ C-สถานีคาดว่า HD phosphohydrolase (His··· พระ Asp··· โดเมน asp) SAMHD1 ถูกโคลน และมีสร้างเอนไซม์ bacterially แสดง recombinant ในปริมาณเพียงพอและความบริสุทธิ์การศึกษาชีวเคมี คุณสมบัติของเอนไซม์ในระบบการบ่งชี้ว่า ปัจจัยจำกัด SAMHD1 เอชไอวี-1 triphosphohydrolase deoxynucleotide ควบคุม dGTPลุยเลย:ขั้นตอนการทดลองวัสดุนิวคลีโอไทด์ได้จากซิก และฟอสฟาเตสลำไส้ของลูกได้จาก Promega มนุษย์ และเมาส์ SAMHD1 cDNAs (Invitrogen) ได้กู้ โดย PCR โคลนเป็น plasmid pCDFDuet-1 (Novagen) มีเตรียมโครงสร้างโดเมน HD โดย PCR และโครงสร้างสุดท้ายถูกตรวจสอบ โดยลำดับดีเอ็นเอเตรียมเอนไซม์ในการศึกษานิพจน์ แท็ก His6 ถูกโคลนที่นัส N หรือ C ของมนุษย์สมบูรณ์และเมาส์ SAMHD1 cDNAs กอัตราผลตอบแทนสูงสุดละลายเอนไซม์ถูกกู้คืนโดยใช้โครงสร้างแท็ก SAMHD1 การ His6 N-เทอร์มินัลเมาส์ (ข้อมูลไม่แสดง) โครงสร้าง SAMHD1 เมาส์ plasmid ถูกเปลี่ยนเป็น Escherichia coli BL21 (DE3) เซต 2 เซลล์ (Novagen), การเติบโตขึ้นมี A600 = 0.5 ที่ 37 ° C และระบายความร้อนด้วยออถึง 17 องศาเซลเซียสได้อย่างรวดเร็ว หลังจากการเหนี่ยวนำกับ 1 มม. isopropyl-β-d-thiogalactopyranoside เซลล์ได้รับอนุญาตให้ปลูกสำหรับ h 18 ที่ 17 องศาเซลเซียส เอนไซม์ในเซลล์สารสกัดจาก SAMHD1 กับแบบนิกเกิล-nitrilotriacetic กรดเรซิน (Qiagen), ล้าง eluted และบริสุทธิ์เพื่อ homogeneity โดยใช้โมโน S chromatography (ฟิกเพิ่มเติม S1) TREX1 และ RNase H2 ได้บริสุทธิ์ดังที่ (22, 30) มีกำหนดความเข้มข้นของโปรตีน โดย A280 ใช้สัมประสิทธิ์สูญพันธุ์สบϵสมบูรณ์เมาส์ SAMHD1 = 63,800 m−1 cm−1 และสำหรับϵ SAMHD1 HD โดเมน (กรดอะมิโน 117 – 627) = 58,050 m−1 cm−1Phosphohydrolase Assaysดำเนินที่ 25 ° C 96 ดี microplates เริ่มต้น ด้วยการเพิ่มเอนไซม์ในปฏิกิริยา (100 μl) และมีการตรวจสอบกิจกรรมอย่างต่อเนื่องที่ A410 ใช้ Tecan Safire2TM ปฏิกิริยาฟอสฟาเตสอยู่ 50 มม. HEPES (pH 7.0), ฟอสเฟต p nitrophenyl 4 mm, 5 mm ของไอออนโลหะ divalent ระบุ และ 500 nm SAMHD1 ปฏิกิริยา Phosphodiesterase (100 μl) มีอยู่ 50 มม. Tricine (pH 8.5), 4 mm bis-p-nitrophenyl ฟอสเฟตหรือ p nitrophenyl 5′ thymidine monophosphate, 5 mm ของไอออนโลหะ divalent ระบุ และ 500 nm SAMHD1 (32)นิวคลีโอไทด์ Phosphohydrolase Assaysปฏิกิริยา phosphohydrolase นิวคลีโอไทด์มีอยู่ 20 มม.ตรี-HCl (pH 7.5), dithiothreitol มม. 2, EDTA 1 μm, 5 มม. MgCl2 นิวคลีโอไทด์ที่ระบุ และเอนไซม์ SAMHD1 ปฏิกิริยาถูก incubated สำหรับการระบุเวลาที่ 25 ° C และหยุดทำงาน โดยการเพิ่ม EDTA ความเข้มข้นสุดท้าย 5 mm โปรตีนถูกเอาออกโดยใช้น้ำหนักโมเลกุล 10000 ตัด concentrators (มาก), และตัวอย่าง (10 μl) ของโซลูชันการกรองถูกวิเคราะห์ โดยไอออนคู่กลับเฟส chromatography (33, 34) ใช้คอลัมน์ C18 ปาก CAPCELL (อาชิเซโด้ดีเคมี) ในระบบ HPLC น้ำ คอลัมน์ถูก equilibrated กับบัฟเฟอร์ (20 มม.โซเดียมฟอสเฟต (pH 7.0), 5 mm tetra n butylammonium ฟอสเฟต และเมทานอล 5%) และ eluted ด้วยการไล่ระดับสีแบบเส้นตรงของเมทานอลจาก 5 ถึง 60% ผลิตภัณฑ์และ reactants ถูก quantified โดยวัด A254 นับยอด absorbance ที่ดำเนินการโดยใช้ซอฟต์แวร์ Empower (น้ำ)

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

ไวรัสเป้าหมายโมเลกุลเซลล์โฮสต์เฉพาะที่อาจจะ จำกัด การแพร่กระจายของเชื้อไวรัส เอชไอวี -1 และจีโนม lentiviral อื่น ๆ เข้ารหัสชุดที่แตกต่างของโปรตีนเสริมผู้กำกับที่ข้ออ้างของการปรับตัวเป็นเจ้าภาพและกลไกภูมิคุ้มกันโดยธรรมชาติเพื่อส่งเสริมการจำลองแบบของไวรัสในสภาพแวดล้อมที่เซลล์เฉพาะ (1, 2) VPX และ Vpr โปรตีนเสริมได้รับการเชื่อมโยงส่วนใหญ่จะติดเชื้อของเซลล์เม็ดเลือดขาวชนิดเชื้อสายโดย HIVs (3) โปรตีนเสริม VPX พบเฉพาะในเอชไอวี 2 และบางไวรัสภูมิคุ้มกันบกพร่องเหมือนลิงและ Vpr ที่พบในการติดเชื้อ HIV-1 และเอชไอวี 2 VPX เป้าหมายเป็นปัจจัยข้อ จำกัด ที่ห้ามการสังเคราะห์ดีเอ็นเอของไวรัสในเซลล์ monocytic (4-6) เมื่อเร็ว ๆ นี้โปรตีนเข้ารหัสโดยยีน SAMHD1 ถูกระบุว่าเป็นปัจจัยข้อ จำกัด HIV-1 ในเซลล์ของเม็ดเลือดขาวชนิดเชื้อสาย (7, 8) SAMHD1 เป็นความคิดในการยับยั้งขั้นตอนในช่วงต้นวงจรชีวิตของเชื้อไวรัสโดยรบกวนการสังเคราะห์ที่มีประสิทธิภาพของดีเอ็นเอของเชื้อไวรัส แต่กลไกที่ไม่เป็นที่รู้จัก. SAMHD1 ถูกระบุว่าเป็นโปรตีน interferon ที่เกิดขึ้นในขนาดใหญ่ของมนุษย์และ dendritic เซลล์ (9-12) แนะนำฟังก์ชั่นในการตอบสนองของระบบภูมิคุ้มกันโดยธรรมชาติ การกลายพันธุ์ใน SAMHD1 ทำให้เกิดความผิดปกติของระบบประสาทรุนแรงโรค Aicardi-Goutières (13) ซึ่งเป็น encephalopathy อย่างใกล้ชิดทางพันธุกรรมที่เลียนแบบการติดเชื้อไวรัส แต่กำเนิดและโดดเด่นด้วยการกระตุ้นภูมิคุ้มกันที่ไม่เหมาะสมและการหลั่ง interferon-αผิดปกติ (14-16) ในทำนองเดียวกันการกลายพันธุ์ในยีน TREX1 exonuclease และในช่วงสามยีนเข้ารหัส RNase H2 endonuclease สาเหตุโรค Aicardi-Goutièresเชื่อมโยงการเผาผลาญกรดนิวคลีอิกที่มีโรคภูมิต้านทานผิดปกตินี้ (17-19) TREX1 เป็นสำคัญ 3'-exonuclease ที่เสื่อมเดียวและดีเอ็นเอเกลียวคู่โทรศัพท์มือถือ (20-26) ในเซลล์ที่ติดเชื้อ HIV-1-ติดเชื้อ TREX1 ลดยีนที่สร้างสรรค์เพื่อล้างยีนไวรัสส่วนเกินการป้องกันการกระตุ้นภูมิคุ้มกันโดยธรรมชาติ (27, 28) RNase H2 ตระหนักและปัจจุบันแข็งกระด้าง ribonucleotides ในอาร์เอ็นเอ / แฝดดีเอ็นเอ (29, 30) และห้ามไม่ให้พูด RNASEH2A บั่นทอนการจำลองแบบเอชไอวี (31) นี้แสดงให้เห็นบทบาทในการติดเชื้อเอชไอวี ดังนั้น SAMHD1, TREX1 และ RNase H2 มีส่วนร่วมในกรดนิวคลีโทรศัพท์มือถือเดินการเผาผลาญที่คาบเกี่ยว interferon-พึ่งการตอบสนองการอักเสบและต้านไวรัสโดยธรรมชาติ. กิจกรรมเร่งปฏิกิริยาของ SAMHD1 มีการระบุในการศึกษานี้ SAMHD1 มี n- ขั้วปฏิสัมพันธ์โปรตีนสมมุติบรรทัดฐานαหมัน (SAM) 4 โดเมนและ C-ขั้วคาดการณ์ phosphohydrolase แบบ HD (ของเขาเขา······-งูเห่างูเห่า) โดเมน SAMHD1 เป็นโคลนและแสดงแบคทีเรียเอนไซม์ recombinant ถูกสร้างขึ้นในปริมาณที่เพียงพอและความบริสุทธิ์ในการดำเนินการศึกษาทางชีวเคมี คุณสมบัติของเอนไซม์ระบุว่าปัจจัยข้อ จำกัด SAMHD1 HIV-1 เป็น deoxynucleotide dGTP ควบคุม triphosphohydrolase. ไปที่: ขั้นตอนการทดลองวัสดุนิวคลีโอมีจากซิกม่าและน่องphosphatase ลำไส้จาก Promega มนุษย์และเมาส์ SAMHD1 cDNAs (Invitrogen) ได้รับการกู้คืนโดยวิธี PCR และโคลนเข้าไปใน pCDFDuet-1 (Novagen) พลาสมิด เป็นผู้ก่อสร้างโดเมน HD เตรียมโดยวิธี PCR และโครงสร้างสุดท้ายได้รับการตรวจสอบโดยลำดับดีเอ็นเอ. เอนไซม์เตรียมการในการศึกษาการแสดงออกของแท็ก His6 เป็นโคลนที่ N หรือสถานี C ของมนุษย์ที่สมบูรณ์และเมาส์ SAMHD1 cDNAs และอัตราผลตอบแทนสูงสุดของเอนไซม์ที่ละลายน้ำได้ ได้รับการกู้คืนโดยใช้ His6 n- ขั้วเมาส์แท็กสร้าง SAMHD1 (ที่ไม่ได้แสดงข้อมูล) เมาส์ SAMHD1 สร้างพลาสมิดถูกเปลี่ยนเป็นอีโค BL21 (DE3) Rosetta 2 เซลล์ (Novagen) เติบโตขึ้นไปยัง A600 = 0.5 ที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียสและระบายความร้อนได้อย่างรวดเร็วบนน้ำแข็งถึง 17 ° C หลังจากการเหนี่ยวนำ 1 มมไอโซโพรพิ-β-D-thiogalactopyranoside เซลล์ได้รับอนุญาตให้เติบโต 18 ชั่วโมงที่ 17 องศาเซลเซียส เอนไซม์ SAMHD1 ในสารสกัดจากเซลล์ที่ถูกผูกไว้กับเรซินกรดนิกเกิล nitrilotriacetic (Qiagen) ล้างชะและบริสุทธิ์จะเป็นเนื้อเดียวกันโดยใช้โคโมโน S (เสริมรูป. S1) TREX1 และ RNase H2 ถูกทำให้บริสุทธิ์ตามที่อธิบายไว้ (22, 30) ความเข้มข้นของโปรตีนที่ถูกกำหนดโดย A280 โดยใช้ค่าสัมประสิทธิ์การสูญเสียฟันกรามเมาส์สมบูรณ์ SAMHD1 ε = 63,800 เมตร-1-1 ซม. และสำหรับโดเมน SAMHD1 แบบ HD (กรดอะมิโน 117-627) ε = 58,050 เมตร-1-1 ซม. Phosphohydrolase ตรวจปฏิกิริยา ( 100 ไมโครลิตร) ได้ดำเนินการที่ 25 ° C ใน 96 หลุม microplates ริเริ่มโดยนอกจากเอนไซม์และกิจกรรมที่ได้รับการตรวจสอบอย่างต่อเนื่องที่ A410 ใช้ Tecan Safire2TM ปฏิกิริยา phosphatase มี 50 มม HEPES (pH 7.0) 4 มมฟอสเฟตพี Nitrophenyl 5 มมของโลหะไอออน divalent ระบุและ 500 นาโนเมตร SAMHD1 ปฏิกิริยา phosphodiesterase (100 ไมโครลิตร) ที่มีขนาด 50 มม Tricine (pH 8.5) 4 มมทวิ-P-Nitrophenyl ฟอสเฟตหรือพี Nitrophenyl โมโน 5'-thymidine 5 มมของโลหะไอออน divalent ระบุและ 500 นาโนเมตร SAMHD1 (32) เบื่อหน่าย Phosphohydrolase ตรวจเบื่อหน่ายที่มีปฏิกิริยาphosphohydrolase 20 มิลลิเมตร Tris-HCl (pH 7.5) 2 มม dithiothreitol 1 ไมโครเมตร EDTA, 5 มม MgCl2, นิวคลีโอที่ระบุและเอนไซม์ SAMHD1 ปฏิกิริยาถูกบ่มสำหรับเวลาที่ระบุไว้ที่ 25 ° C และหยุดโดยการเติม EDTA ถึง 5 มมเข้มข้นสุดท้าย โปรตีนจะถูกลบออกโดยใช้ 10,000 น้ำหนักโมเลกุลตัด concentrators (ค) และกลุ่มตัวอย่าง (10 ไมโครลิตร) ของการแก้ปัญหาที่ผ่านการกรองมาวิเคราะห์โดยคู่ไอออนโคเฟสย้อนกลับ (33, 34) โดยใช้ CAPCELL PAK คอลัมน์ C18 (ชิเซโด้ Fine Chemicals) ในระบบน้ำ HPLC คอลัมน์ถูก equilibrated กับบัฟเฟอร์ (20 มิลลิเมตรโซเดียมฟอสเฟต (pH 7.0) 5 มมเตตร้า n-butylammonium ฟอสเฟตและเมทานอล 5%) และมีชะลาดเชิงเส้นของเมทานอลตั้งแต่ 5 ถึง 60% ผลิตภัณฑ์และสารตั้งต้นที่ถูกวัดโดยการวัด A254 ปริมาณการดูดกลืนแสงของยอดเขาที่ถูกดำเนินการโดยใช้ซอฟแวร์ให้อำนาจนี้ (น้ำ)

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

ไวรัสเป้าหมายเฉพาะโฮสต์เซลล์ โมเลกุลที่มิฉะนั้นจะยับยั้งไวรัส ขยายพันธุ์โดยการเพาะเมล็ด หา lentiviral อื่น ๆและการไม่เข้ารหัสชุดที่แตกต่างกันของอุปกรณ์เสริมโปรตีนกำกับที่หลบหนีเป็นเจ้าภาพและการปรับตัวโดยธรรมชาติของกลไกเพื่อส่งเสริมการจำลองแบบของไวรัสในสภาพแวดล้อมที่เซลล์ที่เฉพาะเจาะจง ( 1 , 2 )การ vpx vpr โปรตีนเสริมและมีการเชื่อมโยงส่วนใหญ่จะติดเชื้อเอชไอวี 10 สายเลือดเซลล์ ( 3 ) การ vpx เสริมโปรตีนที่พบเฉพาะใน hiv-2 และบางไวรัสภูมิคุ้มกันบกพร่องในลิงและ vpr พบ 1 และ hiv-2 . vpx เป้าหมายจำกัดปัจจัยซึ่งห้ามการสังเคราะห์ดีเอ็นเอไวรัสในเซลล์ monocytic ( 4 – 6 ) เมื่อเร็วๆ นี้โปรตีนที่ได้จาก samhd1 ยีนที่ถูกระบุว่าเป็นปัจจัยข้อ จำกัด ในเซลล์ของวงศ์ตระกูล 10 ( 7 , 8 ) samhd1 เป็นความคิดที่จะขัดขวางขั้นตอนแรกในวงจรชีวิตของไวรัสโดยรบกวนการสังเคราะห์ที่มีประสิทธิภาพของไวรัสดีเอ็นเอ แต่กลไกที่ไม่เป็นที่รู้จัก

samhd1 ถูกระบุว่าเป็นการทำลายโปรตีนในมนุษย์และกระตุ้น macrophages เซลล์ ( 9 – 12 )แนะนำฟังก์ชั่นในการตอบสนองทางภูมิคุ้มกันโดยกำเนิด การกลายพันธุ์ใน samhd1 Neurodegenerative โรคให้รุนแรง aicardi gouti è res ซินโดรม ( 13 ) , ทางพันธุกรรมที่อย่างใกล้ชิดเลียนแบบจากการติดเชื้อไวรัส แต่กำเนิดและมีลักษณะที่ไม่เหมาะสมและกระตุ้นภูมิคุ้มกันผิดปกติ interferon - αหลั่ง ( 14 - 16 ) อนึ่งการกลายพันธุ์ในยีน trex1 เอกโซนิวคลีเอส และใน 3 ยีนส์เลส H2 เอนโดนิวคลีเอสเพราะ aicardi gouti è res ซินโดรมเชื่อมกรดนิวคลีอิกการเข้ารหัสการเผาผลาญโรค autoimmune ( 17 – 19 ) trex1 เป็นหลัก 3 ’ - เอกโซนิวคลีเอสที่บั่นทอนเซลล์เดี่ยวและคู่เกลียวดีเอ็นเอ ( 20 - 26 ) ใน hiv-1-infected เซลล์ trex1 บั่นทอน nonproductive ใบล้างเชื้อไวรัส ส่วนเกินการป้องกันการกระตุ้นภูมิคุ้มกันโดยกำเนิด ( 27 , 28 ) ส่วนเลส H2 ตระหนักและคลีฟส์ไรโบนิวคลีโอไทด์มีอยู่ใน DNA / RNA แฝด ( 29 , 30 ) และสามารถ rnaseh2a impairs เอชไอวีซ้ำ ( 31 ) นี้แสดงให้เห็นบทบาทในการติดเชื้อเอชไอวี ดังนั้น samhd1 trex1 , ,เลส H2 และเข้าร่วมในมือถือกรดนิวคลีอิกเมตาโบลิกพาทเวย์ที่ทับซ้อนที่ทำให้รอน ( innate และการตอบสนองการอักเสบ

กิจกรรมการ samhd1 ระบุในการศึกษานี้ การ samhd1 ประกอบด้วยกรดอะมิโนกรดอะมิโนโปรตีนโปรตีนปฏิสัมพันธ์เป็นหมันαแม่ลาย ( แซม ) 4 โดเมน ซึ่งคาดการณ์ phosphohydrolase HD ( ของเขา···ของเขา··· ASP ASP ) โดเมนการ samhd1 ถูกโคลนและ bacterially แสดงแนนท์เอนไซม์ถูกสร้างขึ้นในปริมาณที่เพียงพอและความบริสุทธิ์แสดงชีวเคมี . คุณสมบัติของเอนไซม์พบว่าเชื้อ samhd1 จำกัดปัจจัยเป็น dgtp ระเบียบ ขอขมาลาโทษ triphosphohydrolase

ไป :


ขนาดทดลองกระบวนการวัสดุจาก ซิกม่าและน่องลำไส้เปลี่ยนแปลงจาก promega . การ cdnas samhd1 มนุษย์และเมาส์ ( Invitrogen ) ถูกพบโดยวิธี PCR และโคลนเข้าไปใน pcdfduet-1 ( novagen ) พลาสมิด HD โดเมนโครงสร้างเตรียมโดยวิธี PCR และสุดท้ายโครงสร้างได้ถูกตรวจสอบโดยการจัดลำดับดีเอ็นเอ


ในการแสดงออกของเอนไซม์เตรียมศึกษาเป็นแท็กที่ his6 ถูกโคลนหรือ C ปลายทางของมนุษย์ที่สมบูรณ์ และ cdnas samhd1 เมาส์ และผลผลิตของเอนไซม์สูงสุดที่กู้คืนโดยใช้เมาส์ถูก his6 แท็ก samhd1 โครงสร้าง ( ข้อมูลไม่แสดง ) เมาส์ samhd1 พลาสโครงสร้างถูกเปลี่ยนใน Escherichia coli BL21 ( DE3 ) Rosetta 2 เซลล์ ( novagen ) โตเป็น a600 = 0.5 ที่อุณหภูมิ 37 องศา C ได้อย่างรวดเร็วและเย็นบนน้ำแข็ง - 17 องศาหลังการ 1 มม. isopropyl - บีตา - d-thiogalactopyranoside เซลล์ได้รับอนุญาตให้เติบโต 18 H ที่ 17 ° C samhd1 เอนไซม์ในเซลล์สารสกัดถูกผูกไว้กับนิเกิลไนตริโลไตรแอซีติกกรดเรซิน ( เพิ่ม ) , ล้าง , ตัวอย่าง และวิธีการของการแยกโมโนโครม ( เพิ่มเติมรูปที่ S1 ) trex1 เลส H2 มีความบริสุทธิ์และตามที่ระบุไว้ ( 22 : 30 )ความเข้มข้นของโปรตีนถูกกำหนดโดย a280 โดยใช้ค่าสัมประสิทธิ์การสูญพันธุ์ระหว่างเมาส์ samhd1 สมบูรณ์ϵ = 63800 m − 1 cm − 1 สำหรับ samhd1 HD โดเมน ( กรดอะมิโน 117 ( 627 ) ϵ = 58050 m − 1 cm − 1 )


phosphohydrolase ปฏิกิริยา ( 100 μ L ) จำนวน 25 ° C ใน 96 ดี microplates ริเริ่มโดยเติมเอนไซม์และกิจกรรมที่ถูกตรวจสอบอย่างต่อเนื่อง a410 ใช้ TECAN safire2tm . ปฏิกิริยาการเปลี่ยนแปลงที่มีอยู่ 50 มิลฮีเปส ( pH 7.0 ) , ฟอสเฟต p-nitrophenyl 4 มม. 5 มม. ) ขนาดของโลหะไอออน และ 500 nm samhd1 . ปฏิกิริยา phosphodiesterase ( 100 μ L ) ที่มีอยู่ 50 mm ไตรซีน ( pH 8.5 ) , 4 มม. bis-p-nitrophenyl ฟอสเฟตหรือ p-nitrophenyl 5 ’ - โมโนฟอสเฟตเพียง ,ระบุขนาด 5 มม. ของโลหะไอออน และ 500 nm samhd1 ( 32 ) phosphohydrolase

เบสใช้เบส phosphohydrolase ปฏิกิริยาที่มีอยู่ 20 มม. โดย HCl ( pH 7.5 ) , 2 มม. บัตรแข็ง , 1 μ M EDTA , MgCl2 5 มิลลิเมตร ระบุขนาด และเอนไซม์ samhd1 . ปฏิกิริยา ) เพื่อระบุครั้งที่ 25 ° C และแวะเติม EDTA ความเข้มข้นสุดท้าย 5 mm .โปรตีนถูกใช้ 10 , 000 โมเลกุลตัด concentrators ( มิลลิ ) และตัวอย่าง ( 10 μ L ) ของกรองสารละลาย โดยใช้คู่ไอออนโทษ ( 33 , 34 ) โดยใช้ capcell ปากคอลัมน์ C18 สารเคมีบำรุงดี ) ในระบบสูงน้ำ คอลัมน์ คือ equilibrated กับบัฟเฟอร์ ( 20 มิลลิเมตรโซเดียมฟอสเฟต ( pH 7.0 ) , 5 mm สี่ n-butylammonium ฟอสเฟตและ 5 % เมทานอล ) และตัวอย่างที่มีความลาดชันเชิงเส้นของเมทานอลจาก 5 ถึง 60 % ผลิตภัณฑ์และสารตั้งต้นเป็นวัด โดยวัด a254 . ปริมาณของการดูดกลืนแสงยอดการใช้ช่วยให้ซอฟต์แวร์ ( น้ำ )