2.7. In situ hybridizationThe in si

2.7. In situ hybridization
The in situ hybridization was carried out to localize the GR1, GR2
and MR transcripts in the gill, kidney and intestine of tilapia at day
1. The tissues were fixed in 4% paraformaldehyde in phosphatebuffered
saline (PBS) at 4 C overnight and embedded in paraffin.
The paraffin sections (5 lm) were collected on TESPA-treated
slides (3-aminopropyltriethoxysilane; Sigma). For the probe synthesis,
we used the pGEM-T Easy vector containing the GR1 730-
bp insert (corresponding to nucleotides 2436–3245), GR2 592-bp
insert (corresponding to 1698–2302) or MR 621-bp insert (corresponding
to 2465–3118) and the primers shown in Table 2. Sense
and antisense probes of GR1, GR2 and MR were prepared in tilapia
using T7 and Sp6 promoters by PCR amplification, with the cDNAs
inserted in the plasmids as templates for the PCR. The obtained PCR
products were purified by a kit (Bio 101), and the quantity of the
PCR amplification product was checked by spectrophotometry at
260 nm. Then 1 lg of the DNA templates was incubated for 3 h
at 37 C in a thermocycler machine in a solution containing transcription
buffer (5), 0.1 M dithiothreitol (DTT), DIG-rNTP mix
(10), RNAse inhibitor (40 U/ll) and a T7 or Sp6 RNA polymerase
(20 U/ll), which was adjusted to 20 ll with sterile DEPC H2O. The
templates were digested with 2 ll of DNAse I (10 U/ll) at 37 C for
30 min. The preparation of RNA probes by PCR amplification was
described previously

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

2.7. situ ใน hybridizationHybridization ใน situ ได้ดำเนินการแปล GR1, GR2และใบแสดงผลนายเหงือก โรคไต และลำไส้ของปลานิลวัน1. เนื้อเยื่อที่มีถาวรใน paraformaldehyde 4% ใน phosphatebufferedน้ำเกลือ (PBS) ที่ C 4 ฝังในพาราฟิน และค้างคืนส่วนพาราฟิน (5 lm) ถูกรวบรวมไว้ในการรักษา TESPAภาพนิ่ง (3-aminopropyltriethoxysilane ซิกมา) การสังเคราะห์โพรบเราใช้เวกเตอร์กลาย pGEM T ประกอบด้วย 730 คะแนน GR1-แทรก bp (ที่สอดคล้องกับนิวคลีโอไทด์ 2436-3245) GR2 592-bpแทรก (ที่สอดคล้องกับ 1698-2302) หรือนาย 621-bp แทรก (ที่สอดคล้องถึง 2465-3118) และไพรเมอร์ที่แสดงในตารางที่ 2 ความรู้สึกและคลิปปากตะเข้ antisense GR1, GR2 และนายถูกเตรียมในปลานิลใช้ T7 และ Sp6 ก่อขยาย PCR กับ cDNAsแทรกใน plasmids ที่เป็นแม่แบบสำหรับ PCR PCR ได้รับผลิตภัณฑ์ที่บริสุทธิ์ โดยชุด (ไบโอ 101), และปริมาณของการมีการตรวจสอบผลิตภัณฑ์ขยาย PCR โดย spectrophotometry ที่260 nm แล้ว lg 1 ดีเอ็นเอแม่แบบถูก incubated สำหรับ 3 hที่ 37 C ในเครื่อง thermocycler ในโซลูชันที่ประกอบด้วย transcriptionบัฟเฟอร์ (5), 0.1 M dithiothreitol (DTT), ผสม DIG rNTP(10), ผล RNAse (40 U/จะ) และพอลิเมอเรส T7 หรืออาร์เอ็นเอ Sp6(20 U/จะ), ซึ่งถูกปรับ 20 จะ มี H2O DEPC กอซ ที่แม่แบบถูกต้อง 2 ของ DNAse จะฉัน (10 U/จะ) ที่ 37 C สำหรับ30 นาที เตรียมของอาร์เอ็นเอคลิปปากตะเข้โดยขยาย PCR ได้อธิบายไว้ก่อนหน้านี้

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

2.7 ในแหล่งกำเนิดพันธุ์
ในแหล่งกำเนิดพันธุ์ได้ดำเนินการเพื่อ จำกัด GR1, GR2
และนายจิตบำบัดในเหงือกไตและลำไส้ของปลานิลในวันที่
1 เนื้อเยื่อที่ได้รับการแก้ไขใน paraformaldehyde 4% ใน phosphatebuffered
น้ำเกลือ (พีบีเอส) ที่ C 4 คืนและฝังตัวอยู่ในพาราฟิน.
ส่วนพาราฟิน (5 LM) ได้รับการรวบรวมไว้ใน TESPA รับการรักษา
ภาพนิ่ง (3 aminopropyltriethoxysilane; ซิกม่า) สำหรับการสังเคราะห์สอบสวนที่
เราใช้ pGEM-T เวกเตอร์ง่ายมี GR1 730-
แทรก bp (ตรงกับนิวคลีโอ 2436-3245), GR2-592 bp
แทรก (ตรงกับ 1698-2302) หรือ MR-แทรก 621 bp (ตรง
ไป 2465-3118) และไพรเมอร์ที่แสดงในตารางที่ 2 ความรู้สึก
และฟิวส์ antisense ของ GR1, GR2 และนายได้จัดทำปลานิล
โดยใช้ T7 และส่งเสริม SP6 โดยขยาย PCR กับ cDNAs
แทรกอยู่ในพลาสมิดเป็นแม่แบบสำหรับ PCR PCR ได้รับ
ผลิตภัณฑ์ที่ถูกทำให้บริสุทธิ์โดยชุด (Bio 101) และปริมาณของ
สินค้าที่ได้รับการขยาย PCR ตรวจสอบโดย spectrophotometry ที่
260 นาโนเมตร จากนั้น 1 LG ดีเอ็นเอแม่แบบที่ถูกบ่มเป็นเวลา 3 ชั่วโมง
ที่ 37 C ในเครื่อง thermocycler ในการแก้ปัญหาที่มีการถอดความ
บัฟเฟอร์ (5), 0.1 M dithiothreitol (DTT) ผสม DIG-rNTP
(10), ยับยั้ง RNase (40 U / LL) และ T7 หรือ SP6 rna โพลิเมอร์
(20 U / LL) ซึ่งได้รับการปรับให้ 20 LL กับ DEPC หมัน H2O
แม่ถูกย่อยด้วย 2 LL DNase ของฉัน (10 U / LL) ที่ 37 องศาเซลเซียสเป็นเวลา
30 นาที เตรียมความพร้อมของยานสำรวจ RNA โดยขยาย PCR ถูก
อธิบายไว้ก่อนหน้า

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

2.7 . ใน situ hybridization
ใน situ hybridization มีวัตถุประสงค์เพื่อ จำกัด การ gr1 gr2
, และนาย transcripts ในเหงือก ไต และลำไส้ของปลานิลที่วัน
1 เนื้อเยื่อถูกกำหนดในพาราฟอร์มาลดิไฮด์ 4% ใน phosphatebuffered
น้ำเกลือ ( PBS ) ที่อุณหภูมิ 4 C ค้างคืนและฝังในพาราฟิน พาราฟินส่วน (
5 กล. ) ครั้งนี้ tespa ปฏิบัติ
สไลด์ ( 3-aminopropyltriethoxysilane ; Sigma )การตรวจสอบการสังเคราะห์
เราใช้ pgem-t ง่ายเวกเตอร์ที่มี gr1 730 -
BP แทรก ( ตรงกับพ.ศ. 2436 ) นิวคลีโอไทด์ 3245 ) gr2 592 BP
แทรก ( ตรงกับ 1540 ( 1566 ) หรือนาย 621 BP แทรก ( เทียบเท่ากับ 0
– 820 ) และไพรเมอร์ที่แสดงในตารางที่ 2 และวัดความรู้สึก
gr1 gr2 antisense ของ , และนายเตรียมในปลานิล
* * 3 sp6 ผู้สนับสนุนโดยวิธี PCR และการขยายกับ cdnas
แทรกอยู่ในพลาสมิดเป็นแม่แบบสำหรับ PCR นำ PCR
ผลิตภัณฑ์มีความบริสุทธิ์โดย Kit ( ไบโอ 101 ) และปริมาณของผลิตภัณฑ์ PCR (

ตรวจสอบโดยวิธีที่ 260 นาโนเมตร แล้ว 1 LG ของดีเอ็นเอแม่แบบถูกบ่ม 3 H
ที่ 37 องศาเซลเซียส ในเครื่องเทอร์มอไซเคล ์ในสารละลายบัฟเฟอร์ที่มี transcription
( 5 ) , 0.1 M บัตรแข็ง ( DTT )ขุดขุดขุดขุดขุดขุดขุด
ผสม rntp ( 10 ) , เลสเตอร์ ( 40 U / ll ) และ * * 3 หรือ sp6 อาร์เอ็นเอพอลิเมอเรส
( 20 U / ll ) ซึ่งปรับ 20 จะหยิ่งผยอง depc h2o
แม่แบบที่ถูกย่อยด้วย 2 จะตรวจหา ADNase ผม ( 10 U / ll ) ที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส เป็นเวลา
30 นาที การเตรียมการของ RNA probes ( โดยวิธี PCR คือ
อธิบายก่อนหน้านี้