RAPD amplificationPrior to PCR, DNA

RAPD amplification
Prior to PCR, DNA concentrations were adjusted to 50 ng/muL. PCR reactions were performed in a final volume of 25 muL, containing 25 pmol RAPD primer, 50 ng template DNA and a standard quantity 'Ready To Go' RAPD analysis mixture (Pharmacia Biotech). Amplifications were performed with the Hybaid Omn-E thermocycler (Hybaid Ltd, Teddington, Middlesex, UK). PCR conditions were: 5 min at 95°C followed by 45 cycles, each of 1 min at 95°C, 1 min at 36°C and 2 min at 72°C. After the last cycle, a final step of 5 min at 72°C was added to allow complete extension of all amplified fragments. Amplification products (10 muL) were separated for 90 min at 120 V on 0.8% agarose TBE gels (1.78 mm Tris; 1.78 mm Boric Acid; 0.4 mm EDTA). These were stained with 10 muL ethidium bromide added to the gel and 0.25 muL ethidium bromide/mL TBE buffer to the TBE running buffer. Gels were photographed under UV light.
Forty random, decamer primers were screened (Kits H and G of Operon Technologies), two of which, OPH-12 (5§-ACGCGCATGT-3§) and OPG-08 (5§-TCACGTCCAC-3§) were retained for further analysis. RAPD bands were scored as present/absent (p/a=1/0) and only well-resolved profiles were considered. The reproducibility of RAPD profiles was tested for each primer, by reanalysing 20 individuals and comparing both profiles.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

ขยายอาร์เอพีดีก่อน PCR ความเข้มข้นของดีเอ็นเอถูกปรับให้มูล 50 ng ปฏิกิริยา PCR ได้ดำเนินในปริมาตรสุดท้ายของมูล 25 รองพื้น 25 pmol อาร์เอพีดี ดีเอ็นเอแม่ ng 50 และปริมาณมาตรฐานผสมวิเคราะห์ 'ส่งไปยัง' การอาร์เอพีดี (Pharmacia ไบโอเทค) Amplifications ได้ดำเนินการกับ thermocycler Hybaid Omn-E (Hybaid Ltd, Teddington, Middlesex, UK) เงื่อนไข PCR ได้: 5 นาทีที่ 95° C ตามรอบ 45, 1 นาทีที่ 95° C, 1 นาที ที่ 36° C และ 2 นาทีที่ 72 องศาเซลเซียสแต่ละ หลังจากรอบสุดท้าย มีเพิ่มขั้นตอนสุดท้ายของ 5 นาทีที่ 72° C ให้ขยายบางส่วนของเอาต์ทั้งหมดเสร็จสมบูรณ์ ขยายผลิตภัณฑ์ (มูล 10) ถูกแยกสำหรับ 90 นาทีที่ 120 V บน 0.8% agarose TBE เจ (1.78 มม.ตรี กรด Boric 1.78 มม. 0.4 mm EDTA) เหล่านี้มีสีกับโบรไมด์ ethidium มูล 10 เพิ่มเจและ 0.25 มูล ethidium โบรไมด์/mL TBE บัฟเฟอร์ TBE บัฟเฟอร์การทำงาน เจได้ถ่ายภาพภายใต้แสง UVสี่สิบสุ่ม decamer ไพรเมอร์ได้ฉาย (ชุด H และ G เทคโนโลยี Operon), 2 ชั้น OPH-12 (5§ ACGCGCATGT 3§) และ OPG-08 (5§ TCACGTCCAC 3§) ถูกเก็บไว้สำหรับการวิเคราะห์เพิ่มเติม วงอาร์เอพีดีได้คะแนน เป็นปัจจุบัน/ขาด (p / ตัว = 1/0) และเฉพาะห้องแก้ไขส่วนกำหนดค่าที่ได้ถือ Reproducibility ของอาร์เอพีดีโพรไฟล์ถูกทดสอบในแต่ละพื้น reanalysing 20 บุคคล และเปรียบเทียบค่าทั้งสอง

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

ขยาย RAPD
ก่อนที่จะ PCR ความเข้มข้นของดีเอ็นเอมีการปรับถึง 50 นาโนกรัม / มัล ปฏิกิริยา PCR ได้ดำเนินการในเล่มสุดท้ายของมัล 25 ที่มี 25 pmol ไพรเมอร์อาร์เอพี 50 นาโนกรัมดีเอ็นเอแม่แบบและปริมาณมาตรฐานพร้อมที่จะไป 'RAPD ส่วนผสมวิเคราะห์ (Pharmacia ไบโอเทค) เครื่องขยายเสียงได้ดำเนินการกับ Hybaid OMN-E thermocycler (Hybaid จำกัด Teddington มิดเดิลสหราชอาณาจักร) เงื่อนไข PCR ได้: 5 นาทีที่ 95 ° C ตามด้วย 45 รอบละ 1 นาทีที่ 95 องศาเซลเซียส 1 นาทีที่ 36 องศาเซลเซียสและ 2 นาทีที่ 72 องศาเซลเซียส หลังจากรอบที่ผ่านมาเป็นขั้นตอนสุดท้ายของ 5 นาทีที่ 72 องศาเซลเซียสถูกเพิ่มเข้ามาเพื่อให้การขยายสมบูรณ์ของชิ้นส่วนขยายทั้งหมด ผลิตภัณฑ์เครื่องขยายเสียง (10 มัล) ได้รับการแยกออกจากกันเป็นเวลา 90 นาทีที่ 120 V บน 0.8% agarose เจล TBE (1.78 มมทริส; 1.78 มมบอริกกรด; 0.4 มม EDTA) เหล่านี้ถูกย้อมด้วยสี 10 มัลโบรไมด์ ethidium เพิ่มไปยังเจลและ 0.25 มัล ethidium bromide / บัฟเฟอร์มิลลิลิตร TBE กับ TBE ทำงานบัฟเฟอร์ เจลถูกถ่ายภาพภายใต้แสงยูวี.
สี่สุ่ม decamer ไพรเมอร์ได้รับการคัดกรอง (ชุด H และ G ของ operon เทคโนโลยี) สองซึ่ง OPH-12 (5§-ACGCGCATGT-3§) และ OPG-08 (5§-TCACGTCCAC- 3§) ถูกเก็บไว้สำหรับการวิเคราะห์ต่อ วงดนตรีที่ RAPD ถูกยิงเป็นปัจจุบัน / ขาด (P / a = 1/0) และมีเพียงรูปแบบที่ดีได้รับการพิจารณาการแก้ไข การทำสำเนาของโปรไฟล์ดีเอ็นเอได้รับการทดสอบสำหรับแต่ละไพรเมอร์โดย reanalysing 20 บุคคลและเปรียบเทียบทั้งสองรูปแบบ

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

โดย (
ก่อนตรวจ DNA ความเข้มข้นปรับ 50 นาโนกรัม / มิล . ปฏิกิริยา PCR ได้ในเล่มสุดท้าย 25 มิล ที่มี 25 pmol RAPD primer , 50 ของแม่แบบดีเอ็นเอ และปริมาณมาตรฐานของการวิเคราะห์ RAPD ผสมพร้อมที่จะไป ' ( มุ่งมั่น Biotech ) amplifications แสดงกับ omn-e hybaid เทอร์มอไซเคล ์ ( hybaid เท็ดดิงตัน จำกัด , , Middlesex , สหราชอาณาจักร ) เงื่อนไขทั้งหมดจะถูก :5 นาทีที่ 95 องศา C ตามด้วย 45 รอบละ 1 นาทีที่ 95 องศา C , 1 นาทีที่ 36 ° C และ 2 นาทีที่ 72 องศา หลังรอบสุดท้าย เป็นขั้นตอนสุดท้ายของ 5 นาทีที่ 72 ° C ก็เพิ่มเพื่อให้ส่วนขยายเสร็จสมบูรณ์ทุกชิ้นส่วนของ . ผลิตภัณฑ์ขยาย ( 10 มิล ) แยก 90 นาทีที่ 120 V ใน 0.8% ( ทีบีเจล ( 1.78 มิลลิเมตรหรือ 1.78 มิลลิเมตร ; กรด ; 0.4 mM EDTA )เหล่านี้ถูกย้อมด้วย 10 มิลทิเดียมโบรไมด์เพิ่มเจลและ 0.25 มิลทิเดียมโบรไมด์ / ml ทีบีบัฟเฟอร์ไปยังทีบีวิ่งบัฟเฟอร์ เจลได้ถ่ายภาพภายใต้แสง UV .
สี่สิบสุ่ม decamer โดยฉาย ( ชุด h และ g เทคโนโลยี โอเปอรอน ) , สองที่ oph-12 ( 5 § - acgcgcatgt-3 § ) และ opg-08 ( 5 § - tcacgtccac-3 § ) ถูกเก็บไว้สำหรับการวิเคราะห์ต่อไปโดยมีคะแนนเป็นวงปัจจุบันขาด ( P / A = 1 / 0 ) เท่านั้น และก็แก้ไขโปรไฟล์ถูกพิจารณา กระชับโปรไฟล์โดยการทดสอบแต่ละคู่ โดย reanalysing 20 บุคคล และการเปรียบเทียบทั้งโปรไฟล์