Primer design and PCR conditions W

Primer design and PCR conditions

WRI1 primers were designed based on sequence information of the E. guineensis cDNA libraries from Bourgis
et al.10 and Tranbarger et al.11. The WRI1 gene was amplified by PCR using primer pair of WRIF1 5 ATGACTCTC

ATGAAGAACTCT 3 and WRIR1 5 CTAGGCACCTTTGCTTGCA 3. PCR reactions were performed in a total
volume of 25 μL, containing 3 μL of cDNA product (end process of SMARTer PCR cDNA Synthesis Kit produced
100 μL cDNA product), 10 × PCR buffer, 1 mM MgCl2, 0.2 mM dNTPs, 5 pmol each primer and 1 unit DNA
polymerase. The amplification by using the designed primer was conducted with two PCR kits, which were Kapa
HiFi PCR kit (Kapa Biosystems) and Phire Plant Direct PCR kit (Thermo Scientific). The reactions were incubated
in thermocyler (Applied Biosystems, PCR System 9700). DNA amplification conditions were at 95 oC for 5 min
followed by 35 cycles of 30 s at 95 oC, 30 s at 55 oC and 30 s at 72 oC. Amplification concluded with a 10 min
extension step at 72 oC before cooling to 4 oC. The PCR products were analyzed by electrophoresis on a 1.5 %

agarose gel, visualized by UV light and measurement of DNA concentration by NanoDrop (Thermo Scientific).

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

ออกแบบพื้นและเงื่อนไข PCR ไพรเมอร์ WRI1 ถูกออกแบบตามลำดับข้อมูลของห้องสมุด cDNA E. แสดงออกจาก Bourgis ร้อยเอ็ด al.10 และ Tranbarger et al.11 ยีน WRI1 ถูกขยาย โดย PCR โดยใช้รองพื้นคู่ WRIF1 5 ATGACTCTC ATGAAGAACTCT 3 และ WRIR1 5 CTAGGCACCTTTGCTTGCA 3 ปฏิกิริยา PCR ได้ดำเนินการทั้งหมด ปริมาณของ μL 25, μL 3 ของ cDNA (สิ้นสุดขั้นตอนการผลิตชุดสังเคราะห์ cDNA PCR ฉลาดประกอบด้วย 100 μL cDNA ผลิตภัณฑ์), 10 บัฟเฟอร์การ PCR, 1 มม. MgCl2, dNTPs 0.2 mM รองพื้น 5 pmol และดีเอ็นเอ 1 หน่วย พอลิเมอเรส วิธีการขยาย โดยใช้รองพื้นมา ด้วยสอง PCR ชุด ซึ่ง Kapa ชุด HiFi PCR (Kapa Biosystems) และชุด Phire โรงงาน PCR โดยตรง (ทางวิทยาศาสตร์เทอร์โม) ปฏิกิริยาที่ถูก incubated ใน thermocyler (Biosystems ใช้ 9700 ระบบ PCR) เงื่อนไขการขยายดีเอ็นเอได้ที่ 95 องศาเซลเซียสสำหรับ 5 นาที ตามรอบ 35 30 s ที่ 95 องศาเซลเซียส 30 s ที่ 55 องศาเซลเซียสและ 30 s ที่ 72 oC. ขยายสรุปกับ 10 นาที ขั้นตอนการขยายที่ 72 องศาเซลเซียสก่อนที่จะระบายความร้อน 4 oC. ผลิตภัณฑ์ PCR ถูกวิเคราะห์ โดย electrophoresis ใน 1.5% agarose เจล visualized โดยแสง UV และการวัดความเข้มข้นของดีเอ็นเอโดย NanoDrop (เทอร์โมวิทยาศาสตร์)

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

การออกแบบประถมศึกษาและเงื่อนไข PCR ไพร WRI1 ได้รับการออกแบบบนพื้นฐานของข้อมูลลำดับของห้องสมุด cDNA อี guineensis จาก Bourgis และ al.10 และ Tranbarger และ al.11 ยีน WRI1 ถูกขยายโดยวิธี PCR ใช้คู่ไพรเมอร์ของ WRIF1 5 ATGACTCTC ATGAAGAACTCT ที่ 3 และ 5 WRIR1 CTAGGCACCTTTGCTTGCA 3. ปฏิกิริยา PCR ได้ดำเนินการในจำนวนปริมาณ 25 ไมโครลิตรมี 3 ไมโครลิตรของผลิตภัณฑ์ยีน (จุดสิ้นสุดของกระบวนการอย่างชาญฉลาด PCR ยีนสังเคราะห์ชุดผลิต100 ไมโครลิตรสินค้า cDNA), 10 ×บัฟเฟอร์ PCR, 1 มิลลิ MgCl2, 0.2 มิลลิ dNTPs 5 pmol แต่ละไพรเมอร์และ 1 หน่วยดีเอ็นเอโพลิเมอร์ เครื่องขยายเสียงโดยใช้ไพรเมอร์ได้รับการออกแบบที่ได้รับการดำเนินการมีสองชุดทดสอบ PCR ซึ่งเป็น Kapa ชุด PCR ไฮไฟ (Kapa Biosystems) และ Phire พืชชุด PCR ตรง (เทอร์โมวิทยาศาสตร์) ปฏิกิริยาที่ถูกบ่มใน thermocyler (Applied Biosystems, PCR ระบบ 9700) เงื่อนไขดีเอ็นเออยู่ที่ 95 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 5 นาทีตามด้วย 35 รอบ 30 วินาทีที่ 95 องศา 30 วินาทีที่ 55 องศาเซลเซียสและ 30 วินาทีที่ 72 องศาเซลเซียส ขยายสรุปกับ 10 นาทีขั้นตอนการขยายที่ 72 องศาเซลเซียสก่อนที่จะระบายความร้อนถึง 4 องศาเซลเซียส ผลิตภัณฑ์พีซีอาร์ได้รับการวิเคราะห์โดยกระแสไฟฟ้า 1.5% agarose เจล, มองเห็นโดยแสงยูวีและการวัดความเข้มข้นของดีเอ็นเอโดย NanoDrop (เทอร์โมวิทยาศาสตร์)

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

แนวทางการออกแบบและเทคนิคเงื่อนไข

wri1 ไพรเมอร์ที่ออกแบบตามลําดับข้อมูลใน e - ห้องสมุด cDNA จาก bourgis
และ al.10 tranbarger ET และ al.11 . การ wri1 ยีนที่ถูกขยายโดยวิธี PCR โดยใช้ไพรเมอร์คู่ wrif1 5 atgactctc

atgaagaactct 3 และ wrir1 5 ctaggcacctttgcttgca 3 ปฏิกิริยา PCR ได้ในปริมาณรวม 25 μ
Lประกอบด้วย 3 μลิตรของผลิตภัณฑ์ยีน ( จบกระบวนการของ cDNA ที่สังเคราะห์ขึ้นจากชุด
100 μ L ยีนผลิตภัณฑ์ ) , 10 × PCR buffer , MgCl2 1 มม. , 0.2 มม. dntps 5 pmol แต่ละไพรเมอร์และการดีเอ็นเอ
1 หน่วย การเพิ่มปริมาณโดยออกแบบไพรเมอร์จำนวน 2 ชุดตรวจ ซึ่งจังหวัด
ไฮไฟ PCR Kit ( จังหวัด Biosystems ) และ phire ชุด PCR โดยพืช ( เทอร์โมวิทยาศาสตร์ )ปฏิกิริยาที่ถูกบ่ม
ใน thermocyler ( Applied Biosystems ระบบ PCR 9700 ) เงื่อนไขการขยาย DNA อยู่ที่ 95 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 5 นาที
ตามด้วย 35 รอบ 30 s 95 องศาเซลเซียส 30 วินาทีที่ 55 องศาเซลเซียส และ 30 s 72 องศาเซลเซียส แบบสรุปกับ 10 นาที
ส่วนขยายขั้นตอนที่ 72 องศาเซลเซียสก่อนเย็น 4 องศาเซลเซียส การตรวจวิเคราะห์ผลิตภัณฑ์โดยวิธีอิเล็กโทรโฟรีซีสบน 1.5 %

กาโรสเจลการมองเห็นด้วยแสงยูวี และการวัดความเข้มข้นของดีเอ็นเอโดย nanodrop ( เทอร์โมวิทยาศาสตร์ )