2.4.2. Indirect ELISA and immunoblo

2.4.2. Indirect ELISA and immunoblotting assays
Maxisorp microtitration plates (Nalge Nunc, USA) were
coated overnight at 5 C with 100 mL of a 10 mg/mL solution
of H. lunatus, T. serrulatus, A. australis or C. sculpturatus
whole venom in carbonate buffer pH 9.6. After blocking (3%
powdered milk in PBS) and washing (0.05% Tween-saline),
sera from pre-immune and immune rabbit were added in
different dilutions and incubated for 1 h at 37 C. Plates
were washed and incubated with anti-rabbit IgG conjugated
with peroxidase diluted 1:4000, for 1 h at 37 C. After
washing, 100 mL of o-phenylenediamine (0.33 mg/mL in
citrate buffer, pH 5.2, in the presence of 0.04% hydrogen
peroxide) was added to the wells. The reactionwas stopped
after 20 min by the addition of 20 mL of a 1:20 sulfuric acid
solution. Absorbance values were determined at 490 nm
using an ELISA plate reader (BIO-RAD, 680 models).
Duplicate readings were taken for all samples and the
means were calculated.
For the immunoblotting, an SDS-PAGE gel using H.
lunatus venom was run according to the method of
Laemmli (1970) using 12.5% gels and transferred onto
nitrocellulose membrane (Towbin et al., 1979). The
membrane was blocked with PBS-Tween 0.3% for 1 h. After
washing three times for 5 min with PBS-Tween 0.05%, the
membranewas incubated with anti-H. lunatus rabbit serum
(1:1500) for 1 h and 30 min. The membrane was washed

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

2.4.2 วิธี ELISA ทางอ้อมและการตรวจ immunoblotting
Maxisorp แผ่น microtitration (Nalge ตอนนี้สหรัฐอเมริกา) ถูก
เคลือบค้างคืนที่ 5? C 100 มิลลิลิตร 10 mg / มิลลิลิตรวิธีการแก้ปัญหา
ของเอช lunatus ต serrulatus, Australis A. หรือ C. sculpturatus
พิษทั้งใน ค่า pH บัฟเฟอร์คาร์บอเนต 9.6 หลังจากที่ปิดกั้น (3%
นมผงในพีบีเอส) และซักผ้า (0.05% Tween-น้ำเกลือ),
ซีรั่มจากกระต่ายก่อนภูมิคุ้มกันและภูมิคุ้มกันที่ถูกเพิ่มเข้ามาใน
การเจือจางที่แตกต่างกันและบ่มเป็นเวลา 1 ชั่วโมงที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส แผ่น
ถูกล้างและบ่มด้วย IgG ต่อต้านกระต่ายผัน
กับ peroxidase เจือจาง 1: 4000, เวลา 1 ชั่วโมงที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส หลังจาก
ซักผ้า 100 มล o-Phenylenediamine (0.33 mg / ml ใน
บัฟเฟอร์ซิเตรต, ค่า pH 5.2 ในการปรากฏตัวของไฮโดรเจน 0.04%
เปอร์ออกไซด์) ถูกบันทึกอยู่ในหลุม reactionwas หยุด
หลังจาก 20 นาทีโดยนอกเหนือจาก 20 มล 01:20 กรดกำมะถัน
แก้ปัญหา ค่าการดูดกลืนแสงได้รับการพิจารณาที่ 490 นาโนเมตร
โดยใช้เครื่องอ่านแผ่นวิธี ELISA (BIO-RAD, 680 รุ่น).
การอ่านซ้ำถูกนำตัวอย่างและ
วิธีการนี้จะถูกคำนวณ.
สำหรับ immunoblotting, เจล SDS-PAGE ใช้เอช
พิษ lunatus กำลังวิ่ง ตามวิธีการของ
Laemmli (1970) โดย 12.5% ​​เจลและโอนไปยัง
เมมเบรน nitrocellulose (Towbin et al., 1979)
เมมเบรนถูกบล็อกกับพีบีเอส-Tween 0.3% เป็นเวลา 1 ชั่วโมง หลังจาก
ล้างสามครั้งเป็นเวลา 5 นาทีกับพีบีเอส Tween-0.05%,
membranewas บ่มกับการป้องกัน-H ซีรั่มกระต่าย lunatus
(1: 1500) เป็นเวลา 1 ชั่วโมงและ 30 นาที เมมเบรนถูกล้าง

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

2.4.2 . วิธี indirect ELISA Lines )
maxisorp microtitration แผ่น ( nalge ขณะนี้ สหรัฐอเมริกา )
เคลือบค้างคืนที่ 5  C 100 ml ของ 10 mg / ml สารละลาย
. สีเงิน ต. serrulatus . Australis หรือ C sculpturatus
ทั้งพิษในคาร์บอเนตบัฟเฟอร์ pH 9.6 . หลังจากบล็อก ( 3 %
นมผงใน PBS ) และซักผ้า ( Tween 0.05 % เกลือ ) ,
( Pre ภูมิคุ้มกันและภูมิต้านทานเพิ่มใน
กระต่ายวิธีการที่แตกต่างกันและบ่มที่ 37 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 1 ชั่วโมง  แผ่น
ถูกล้างและแยก IgG conjugated
peroxidase เจือจางป้องกันกระต่ายกับ 1:4000 สำหรับ 1 ชั่วโมง 37  C หลังจาก
ซัก 100 มิลลิลิตรของ o-phenylenediamine ( 0.33 มิลลิกรัม / มิลลิลิตรใน
ซิเตรตบัฟเฟอร์ pH 5.2 ต่อหน้า 0.04 % ไฮโดรเจน
เปอร์ออกไซด์ ) ถูกเพิ่มลงในบ่อน้ำ และพบว่าหยุด
หลังจาก 20 นาที โดยการเพิ่มของ 20 ml ของ 120 กรดซัลฟูริก
โซลูชั่น การดูดกลืนแสงเท่ากับที่กำหนด 490 nm
ใช้อ่านแผ่น ELISA ( Bio-rad 680 รุ่น ) .
อ่านซ้ำได้สำหรับทุกตัวอย่างและวิธีการคำนวณ
.
สำหรับ ) , เอนไซม์เจลใช้ H .
สีเงินพิษก็วิ่งตามวิธีการของ
laemmli ( 1970 ) ใช้ 12.5 % เจลและโอนไปยัง
ไนโตรเซลลูโลสเมมเบรน ( towbin et al . , 1979 )
เมมเบรนอุดตันกับ PBS น 0.3% เป็นเวลา 1 ชั่วโมงหลังจาก
ซักสามครั้งเป็นเวลา 5 นาทีกับ PBS Tween 0.05 %
membranewas บ่มด้วย anti-h. สีเงินกระต่ายเซรั่ม
( 1:1500 ) เป็นเวลา 1 ชั่วโมง 30 นาทีและล้างเมมเบรน