Interactions of defensins with SP-D

Interactions of defensins with SP-D
We have previously reported that HNP-1 and HNP-2 bind to SP-D
and interfere with its neutralizing activity. As assessed by ELISA,
SP-D bound to HNP-3 as well but bound minimally to HD5,
HBD-1 or HBD-2 or RC1 or RC2 (Fig. 5). Binding of SP-D to
HNP-3 was less than binding to HNP-2. The ELISA had to be
performed by coating the plate surface with defensins because our
attempts to bind soluble defensins to SP-D-coated surfaces were
complicated by high background binding. There was no difference in
the amounts of RC1, RC2 or HNP-2 protein binding to the ELISA
plates (as measured by protein assays performed after the initial binding
step; data not shown).
We also tested the binding of solution-phase defensins to immobilized
SP-D by surface plasmon resonance (SPR). The results
of these studies are summarized in Table II and Figs. 6 and 7. SPR
experiments measure binding in real time and with high precision.
Table II shows that HNP-1–3 had almost identical affinity for
SP-D, with a Kd ranging from 40 to 65 nM. At a concentration of
1 g/ml (
300 nM),
2.5 molecules of HNP-1, HNP-2, or HNP-3
had bound each SP-D monomer. HD5 bound SP-D with similar
affinity to HNP 1–3, but evidently had fewer binding sites on a
SP-D molecule because its molar ratio was half that of the HNPs.
Two other human
-defensins, HNP-4 and HD6, failed to bind
SP-D appreciably. Overall, the ELISA and SPR results were concordant
for HNP-1, HNP-2, and HNP-3. Both assays also agreed
that HBDs bound minimally, if at all, to SP-D.
When it came to RCs, however, the ELISA and SPR results
diverged. Whereas the ELISA results indicated minimal binding of
SP-D by RC1 and none by RC2, our SPR assays showed extensive
FIGURE 6. Measuring the binding of defensins to SP-D by surface
plasmon resonance in resonance units (RU). SP-D (8292 RU) was immobilized
on a CM5 biosensor by amine coupling. Defensins were prepared
at 1 g/ml in HBS-EP buffer and flowed through the biosensor chamber at
50 l/min for 5 min. Plasmon resonance measurements were taken every
second. Note that the ordinates of the three data graphs all have different
scales.
FIGURE 7. Binding of low concentrations of HNP-2, RC2, and RC101
to SP-D. We used BiaEvaluation 4.1 software and nested binding isotherms
(curves) such as those shown to calculate the association (Ka) and dissociation
(Kd) rate constants and the equilibrium binding constant (Kd) shown
in Table I. The CM5 biosensor used in the illustrated experiments presented
8298 resonance units (RU) of SP-D. The reactant masses were:
42,117 for monomeric SP-D, 3371 for HNP-2, 2017.6 for RC2, and 1890.6
for RC101. A formula described in Materials and Methods can be used to
convert binding, in resonance units, to molar ratios, i.e., the number of
defensin molecules bound per molecule of SP-D.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

Interactions of defensins with SP-DWe have previously reported that HNP-1 and HNP-2 bind to SP-Dand interfere with its neutralizing activity. As assessed by ELISA,SP-D bound to HNP-3 as well but bound minimally to HD5,HBD-1 or HBD-2 or RC1 or RC2 (Fig. 5). Binding of SP-D toHNP-3 was less than binding to HNP-2. The ELISA had to beperformed by coating the plate surface with defensins because ourattempts to bind soluble defensins to SP-D-coated surfaces werecomplicated by high background binding. There was no difference inthe amounts of RC1, RC2 or HNP-2 protein binding to the ELISAplates (as measured by protein assays performed after the initial bindingstep; data not shown).We also tested the binding of solution-phase defensins to immobilizedSP-D by surface plasmon resonance (SPR). The resultsof these studies are summarized in Table II and Figs. 6 and 7. SPRexperiments measure binding in real time and with high precision.Table II shows that HNP-1–3 had almost identical affinity forSP-D, with a Kd ranging from 40 to 65 nM. At a concentration of1 g/ml (
300 nM),
2.5 molecules of HNP-1, HNP-2, or HNP-3had bound each SP-D monomer. HD5 bound SP-D with similaraffinity to HNP 1–3, but evidently had fewer binding sites on aSP-D molecule because its molar ratio was half that of the HNPs.Two other human
-defensins, HNP-4 and HD6, failed to bindSP-D appreciably. Overall, the ELISA and SPR results were concordantสำหรับ HNP-1, HNP-2 และ HNP 3 Assays ทั้งสองตกลงว่า HBDs กับผ่า ถ้าเลย SP D.เมื่อมันมาถึง RCs ไร ELISA และคอฟฟี่ช็อป/ผลลัพธ์diverged ในขณะที่ผล ELISA ระบุรวมน้อยที่สุดSP-D RC1 และ RC2 โดยไม่มี assays คอฟฟี่ช็อป/ของเราแสดงให้เห็นอย่างละเอียดรูปที่ 6 วัดรวมของ defensins กับ SP-D โดยพื้นผิวการสั่นพ้อง plasmon สั่นพ้องหน่วย (RU) SP-D (8292 RU) ถูกตรึงใน biosensor CM5 โดย amine คลัป Defensins ได้เตรียมที่ 1 g/ml ใน HBS EP บัฟเฟอร์ และไหลผ่านหอ biosensor ที่50 l/min สำหรับวัดการสั่นพ้อง Plasmon 5 นาทีที่ถ่ายทุกที่สอง หมายเหตุว่า จรรยาบรรณของกราฟข้อมูลสามทั้งหมดแตกต่างกันปรับขนาดรูปที่ 7 รวมของความเข้มข้นต่ำสุดของ HNP-2, RC2 และ RC101การ SP D. เราใช้ BiaEvaluation 4.1 ซอฟต์แวร์ และซ้อนผูก isothermsเช่นแสดงการคำนวณการเชื่อมโยง (Ka) และ dissociation (โค้ง)ค่าคงที่อัตรา (Kd) และสมดุลรวมค่าคง (Kd) แสดงในตารางผม Biosensor CM5 ที่ใช้ในการทดลองคู่มือที่นำเสนอ8298 สั่นพ้องหน่วย (RU) SP D. ฝูงตัวทำปฏิกิริยามี:สำหรับ monomeric ที่ SP-D, 3371 HNP-2, 2017.6 สำหรับ RC2, 42,117 และ 1890.6สำหรับ RC101 สามารถใช้สูตรในการผลิตและวิธีการแปลงการผูก การสั่นพ้องหน่วย อัตราส่วนสบ เช่น จำนวนผูก defensin โมเลกุลต่อโมเลกุลของ SP D.

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

ปฏิสัมพันธ์ของ defensins กับ SP-D
เรามีรายงานก่อนหน้านี้ว่า HNP-1 และ HNP-2 ผูกไว้กับ SP-D
และยุ่งเกี่ยวกับกิจกรรมของ neutralizing ขณะที่การประเมินโดยวิธี ELISA,
SP-D ผูกไว้กับ HNP-3 เช่นกัน แต่น้อยที่สุดที่จะผูกพัน HD5,
HBD-1 หรือ HBD-2 หรือ RC1 หรือ RC2 (รูปที่. 5) ผูกพันของ SP-D เพื่อ
HNP-3 น้อยกว่าผูกพันกับ HNP-2 วิธี ELISA
จะต้องมีการดำเนินการโดยการเคลือบผิวด้วยแผ่นdefensins
เพราะเราพยายามที่จะผูกdefensins ที่ละลายกับพื้นผิว
SP-D-เคลือบถูกซับซ้อนโดยพื้นหลังสูงที่มีผลผูกพัน มีความแตกต่างในการไม่ได้จำนวน RC1 ที่ RC2 หรือ HNP-2 โปรตีนที่มีผลผูกพันกับวิธี ELISA แผ่น (วัดจากการตรวจโปรตีนดำเนินการหลังจากที่มีผลผูกพันเริ่มต้นขั้นตอน; ไม่ได้แสดงข้อมูล). นอกจากนี้เรายังได้รับการทดสอบผูกพันของ defensins เฟสวิธีการแก้ ตรึงSP-D โดยพื้นผิวด้วยคลื่น plasmon (SPR) ผลการศึกษาเหล่านี้มีรายละเอียดในตารางที่สองและมะเดื่อ 6 และ 7 SPR ทดลองมาตรการที่มีผลผูกพันในเวลาจริงและมีความแม่นยำสูง. ตารางที่สองแสดงให้เห็นว่า HNP-1-3 มีความสัมพันธ์ที่เหมือนกันเกือบสำหรับSP-D ด้วย Kd ตั้งแต่ 40-65 นาโนเมตร ที่มีความเข้มข้นของ1 g / ml (? 300 นาโนเมตร)? 2.5 โมเลกุลของ HNP-1, HNP-2 หรือ HNP-3 ได้ผูกพันแต่ละโมโนเมอร์ SP-D HD5 ผูกพัน SP-D ที่คล้ายกันกับความสัมพันธ์ที่จะHNP 1-3 แต่เห็นได้ชัดว่ามีน้อยลงเว็บไซต์บนผูกพันโมเลกุลSP-D เพราะอัตราส่วนโดยโมลของมันคือครึ่งหนึ่งของ HNPs ได้. สองอื่น ๆ ของมนุษย์ -defensins? HNP-4 และ HD6, ล้มเหลวในการผูกSP-D ประเมิน โดยรวมแล้ววิธี ELISA และผล SPR อยู่พ้องสำหรับHNP-1, HNP-2 และ HNP-3 การตรวจทั้งสองยังตกลงที่ผูกพัน HBDs น้อยที่สุดถ้าที่ทั้งหมดเพื่อ SP-D. เมื่อมันมาถึง RCs แต่วิธี ELISA และผล SPR แยก ในขณะที่ผลการชี้ให้เห็นวิธี ELISA น้อยที่สุดที่มีผลผูกพันของSP-D โดย RC1 และไม่มีผู้ใดโดย RC2, การวิเคราะห์ของเราแสดงให้เห็น SPR กว้างขวางรูป6. วัดผูกพันของ defensins เพื่อ SP-D โดยพื้นผิวด้วยคลื่นplasmon ในหน่วยเสียงสะท้อน (RU) SP-D (8292 RU) ถูกตรึงบนไบโอเซนเซอร์CM5 โดยการมีเพศสัมพันธ์เอมีน defensins ได้จัดทำขึ้นณ วันที่ 1? g / ml ในบัฟเฟอร์ HBS-EP และไหลผ่านห้องไบโอเซนเซอร์ที่50 ลิตร / นาทีเป็นเวลา 5 นาที Plasmon วัดเสียงสะท้อนที่ถูกนำมาทุกครั้งที่สอง โปรดทราบว่าพิกัดของทั้งสามกราฟข้อมูลที่ทุกคนมีความแตกต่างกันเครื่องชั่งน้ำหนัก. รูปที่ 7. การผูกความเข้มข้นต่ำของ HNP-2, RC2 และ RC101 เพื่อ SP-D เราใช้ BiaEvaluation 4.1 ซอฟต์แวร์และซ้อนกันผูกพัน isotherms (โค้ง) เช่นผู้ที่แสดงให้เห็นในการคำนวณสมาคม (ลำลูกกา) และแยกออกจากกัน(Kd) คงอัตราและสมดุลผูกพันคงที่ (Kd) แสดงในตารางที่ครั้งที่หนึ่งCM5 ไบโอเซนเซอร์ที่ใช้ในการแสดง การทดลองที่นำเสนอ8,298 หน่วยเสียงสะท้อน (RU) ของ SP-D ฝูงผิดใจคือ42,117 สำหรับ monomeric SP-D 3371 สำหรับ HNP-2, RC2 สำหรับ 2,017.6 และ 1,890.6 สำหรับ RC101 สูตรที่อธิบายไว้ในวัสดุและวิธีการสามารถใช้ในการแปลงที่มีผลผูกพันในหน่วยเสียงสะท้อนเพื่อฟันกรามอัตราส่วนคือจำนวนของโมเลกุลdefensin ผูกพันต่อโมเลกุลของ SP-D

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

ปฏิกิริยาของดีเฟ็นซินกับ sp-d
เราได้เคยรายงานว่า hnp-1 และ hnp-2 ผูก sp-d
รบกวน neutralizing ของกิจกรรม เป็นการประเมินโดย Elisa ,
sp-d ผูก hnp-3 เช่นกัน แต่ผูกไว้อย่างให้ hd5
hbd-1 , หรือ hbd-2 หรือ RC1 RC2 หรือ ( รูปที่ 5 ) ผูกพันของ sp-d

hnp-3 น้อยกว่าผูก hnp-2 . โดยวิธี ELISA มี
ขับร้องโดย เคลือบพื้นผิวจานดีเฟ็นซินเพราะความพยายามของเรา
ผูกละลายดีเฟ็นซินจะ sp-d-coated พื้นผิวถูก
ซับซ้อนโดยพื้นหลังมัดสูง ไม่พบความแตกต่างของปริมาณของ RC1 RC2
, หรือ hnp-2 โปรตีนเพื่อ Elisa
แผ่น ( เป็นวัดโดยการใช้โปรตีนหลังจากเริ่มต้นผูกพัน
ขั้นตอน ;
ข้อมูลไม่แสดง )เรายังทดสอบการจับระยะดีเฟ็นซินโซลูชั่นเพื่อตรึง
sp-d โดยเสียงสะท้อน PLASMON พื้นผิว ( สุพรรณบุรี ) ผลของการศึกษาเหล่านี้
สรุปไว้ในตารางที่ 2 และลูกมะเดื่อ . 6 และ 7 สุพรรณบุรี
การทดลองวัดความผูกพันในเวลาจริงและมีความเที่ยงตรงสูง ตารางที่ 2 แสดงให้เห็นว่า hnp-1
– 3 มีความสัมพันธ์เกือบเหมือนกัน
sp-d ที่มีขนาดตั้งแต่ 40 ถึง 65 nm . ที่ระดับความเข้มข้น
1  g / ml (
300 nm )
2.5 โมเลกุลของ hnp-1 hnp-2 , หรือ hnp-3
ได้ผูกพันกัน sp-d โมโนเมอร์ hd5 ผูกพัน sp-d ความสัมพันธ์ที่คล้ายกัน
เพื่อ hnp 1 – 3 แต่เด่นชัดได้น้อยลงเต็มเปี่ยมบน
sp-d โมเลกุลเนื่องจากอัตราส่วนโดยโมลที่เป็นครึ่งหนึ่งของ hnps .
2 มนุษย์
- ดีเฟ็นซิน hnp-4 hd6 , และล้มเหลวที่จะมัด
sp-d ได้ . รวม , ELISA และสพผลสอดคล้องกันสำหรับ hnp-1 hnp-2
, ,และ hnp-3 . ทั้ง 2 วิธีก็เห็นด้วย
ที่ hbds ผูกพันน้อยที่สุด , ถ้าที่ทั้งหมด sp-d.
เมื่อมันมาถึง RCS , อย่างไรก็ตาม , ELISA และสพผล
ออกไป ในขณะที่วิธี ELISA พบน้อยที่สุด (
sp-d โดย RC1 RC2 ) และไม่มีโดย , สุพรรณบุรีของเราพบรูปอย่างละเอียด
6 การวัดการจับดีเฟ็นซินเพื่อ sp-d โดยเสียงสะท้อน PLASMON พื้นผิว
ในหน่วยเรโซแนนซ์ ( RU )sp-d ( 8292 ru ) ถูกตรึง
ในไบโอเซนเซอร์ชนิดเอมีนโดยการเชื่อมต่อ . ดีเฟ็นซินเตรียม
1  g / ml ใน hbs-ep บัฟเฟอร์ และไบโอเซนเซอร์ ไหลผ่านห้องที่ 
50 ลิตร / นาทีเป็นเวลา 5 นาที PLASMON ( การวัดทุก
2 โปรดทราบว่า ordinates ของสามข้อมูลกราฟทั้งหมดมีเครื่องชั่งแตกต่างกัน
.
รูปที่ 7 ผูกพันของความเข้มข้นต่ำของ hnp-2 RC2 , และ rc101
เพื่อ sp-d.เราใช้ biaevaluation 4.1 ซอฟต์แวร์และซ้อนกัน ผูกสมดุลย์
( โค้ง ) เช่นที่แสดงการคำนวณสมาคม ( KA ) และแยกออกจากกัน
( KD ) และค่าคงที่อัตราคงที่สมดุลผูกพัน ( KD ) แสดงในตารางที่ 1
ชนิดไบโอเซนเซอร์ที่ใช้ในการทดลองนำเสนอภาพประกอบ
ของหน่วยเสียง ( ru ) ของ sp-d. ที่น้ำมวล :
42117 สำหรับ sp-d สำหรับ hnp-2 3371 , เกิด , 20176 RC2 และ 1890.6
สำหรับ rc101 . สูตรที่อธิบายไว้ในวัสดุและวิธีการสามารถใช้
แปลงผูก ในหน่วยโมลต่อเสียงสะท้อน ให้ คือ จํานวน
defensin ผูกพันต่อโมเลกุลของ sp-d. โมเลกุล